苯甲醛及其类似物对酪氨酸酶抑制作用的研究
酪氨酸酶活性的抑制研究及皮肤美白化妆品的研制
究 制
ｏ ｎ Ｈ
肿
Hale Waihona Puke ∞Ｄｏ ｐａ Ｄｏ ｐａ ｑｕ ｎｏｎ ｉ ｅ
— 一 —— ’
ｌ
、ｌ
ｌ
［
收 稿 ｆ期 ：０ ２—０ ｊ ２０ ４—１ ０
作 者简介 ： 自强 （ ９ ５一） 男 ， 建惠 安人 ， 王 １６ ， 福 工程 师 ， 长期 从事 香料 、 香精 、 化妆 品 的研制工 作 。
酶 茔 每 芭 大
摘 要 ：研 究探 讨 了皮 肤 黑 色素 的 成 因 和 皮 肤 美 白机 理 。 通 过 测 定 常 用 的 ６种 生 物 美 白剂 对 酪 氨 酸 酶 活 性 的抑 制 率 ，初 步 建 立 美 白剂 效 果 的评 价 体 系 ， 实验 还 表 明 自制 中草 药 萃 取 物 美 白 效 果 明 显 ，抑 制 率 可 达 ９ ％ 。 同时 ， 开 发 了 ３种 美 白、 祛 斑 、 防 晒 等 功 能 的 化 妆 品 ， 市场 潜 力 ５
的 妆＾ ＩＪ－， Ｉ ｜ ｃ ｔ ＝ ＝
此 ，近 些 年 皮 肤 美 白类 化 妆 品 市 场 的 开 发 日趋 重 视 ，无 论 是 日常 家 庭 用 还 是 专 业 美 容 店 用 ，美
白化 妆 品 已 成 为 护 肤 类 化 妆 品 的 主 流 品 种 之 一 ，尽 管 其 价 格 不 菲 ，但 所 占 的 市 场 份 额 越 来 越
维普资讯
・
２・
福
建
轻 纺
・ ０ ２・ ２０
皮 肤 黑 色 素 细 胞 组 织 将 黑 色 素 转 移 到 表 皮 基 底 层 细 胞 中 ，随 着 细 胞 的 新 陈 代 谢 而 被 带 到 角
酪氨酸酶结构功能分析及其抑制物的设计
科技与创新┃Science and Technology&Innovation ·118·2017年第13期文章编号：2095－6835（2017）13－0118－02酪氨酸酶结构功能分析及其抑制物的设计熊东彦，李志远，黄丹，慕昕，刘桢（东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150030）摘要：黑色素生成与酪氨酸酶相关。
在保证健康的前提下，为了适当抑制黑色素生成，美白皮肤，我们使用生物信息学方法研究了酪氨酸酶的性质，并针对其性质设计了抑制分子。
利用遗传算法得到了不同物种的酪氨酸酶系统进化树，发现东非狒狒、猕猴等的酪氨酸酶与人类的具有较高的相似度。
在PDB数据库中预测到人类酪氨酸酶与巨大芽孢杆菌酪氨酸酶在空间结构上具有最大相似度。
N端与C端分别有1个β-折叠，N端与C端之间有多个α-螺旋。
由此发现，Zn2+和Cl-能够有效降低酪氨酸酶的活性。
黑色素合成受信号通路调控，JNK通路可以通过阻止cAMP应答元件结合蛋白来抑制酪氨酸酶的合成。
雌激素为黑色素合成的“第一信使”，其作用通过ER途径介导，由此寻找到抑制其活性的分子，比如埃克替尼、阿帕替尼。
关键词：酪氨酸酶；生物信息学；抑制分子；系统进化树中图分类号：S917.4文献标识码：A DOI：10.15913/ki.kjycx.2017.13.118黑色素是一种生物色素，能保护生物体免受紫外线伤害，过多的黑色素沉积易引发黑色素瘤。
黑色素合成受多个途径调控，其中，由酪氨酸酶参与的合成途径是黑色素合成的重要途径之一。
酪氨酸酶是一种氧化还原酶，广泛存在于各生物中，与生物体合成色素直接相关。
目前，酪氨酸酶在医疗美容方面的应用发展迅速。
随着生活水平的提高，人们对美的享受也越来越讲究，美白剂的开发随之成为化妆品行业关注的焦点之一。
目前，市场上的美白剂主要有熊果苷、曲酸等，文献表明这些物质均具有较好的美白功效，但这些物质具有一定的皮肤刺激性，或稳定性较差。
天然源酪氨酸酶抑制剂研究进展
。
按照机 制 ， 褐变 可分 为非酶 和酶促褐 变两类 ， 而
又 以后者更 为常见 。据统 计 ， 加工 过 程 中超 过 ５ Ｏ
Ｒ
Ａ ’Ｈ Ｎ
（Ｉ Ｉ）
Ｎ
Ｎ
‘＾ ＼
Ｒ
一
／
＋ ｏ：
Ｏｒ＂ ｆ
Ａ’ Ｈ Ｎ
Ｎ ｉ） —ｉ ｌ （ Ｉ
图 １ 褐 变 反应 过 程
Ｖｏ ． ８ Ｎｏ １ Ｉ２ ．
Ｆｅ ｒ ａ ｙ ２ ０８ ｂ ｕ ｒ ０
天 然 源 酪 氨 酸 酶 抑 制 剂 研 究 进 展
杨 新 玲 ， 李 纲
（ ．郑 州大学 化学 系， 南 郑 州 ４ ０ ０ ２ １ 河 ５ ０ ８；．郑 州牧业 工程 高等 专科 学校 ， 河南 郑 州 ４ ０ １ ５ ０ １）
Ｋｉ ｍ，Ｄ ｎ ｕ ｏ ｇ Ｈｙ ｎ从 百 合 科 植 物 尖 被 菊 芦 （ — Ｖｅ ｒｔｕ ａｕｕ 提 取 到 白 藜 芦 醇 ， 研 究 了 它 对 酪 ａｒ ｍ ｐ ｔｌｍ） 并 氨 酸 酶 的 抑 制 作 用 ， 现 糖 基 化 能 提 高 自藜／ 。后 者 Ｉ ５ 为 ０ ０ ２ Ｋｉ 为 ． ８ ｌＬ Ｃ。 ． ８ ｍｍｏ／ 。动力学分 析知 ， ｌＬ 该抑制 为混合 型抑 制 。
上述 酶促反 应 常导 致水 果 、 菜 的褐 变 及 部分 蔬 种类水产 品 的黑 变 ， 成 感 观质 量 和 营养 成 分 的损 造
制 机理 的理解 ， 以便 进 一步 设计 安 全 高效 的新 型抑
制剂。
失； 此外 ， 黑色素 的不正 常积聚也 会引起 人体皮 肤黑
斑 的产生 。而催 化这一反应 的关键 酶是 酪氨 酸酶 。
酪氨酸酶抑制剂的研究进展
酪氨酸酶抑制剂的研究进展作者：张启勤来源：《科技资讯》2015年第18期摘要：酪氨酸酶在黑色素的生物合成过程中起着关键性的作用，是黑色素合成的限速酶，该酶决定了哺乳动物皮肤、头发的颜色。
部分色素沉着性疾病，如皮肤病，如黄褐斑、雀斑等，是由于过量水平的黑色素在表皮沉积而形成。
因此，可以选择应用酪氨酸酶抑制剂，通过抑制酪氨酸酶的活性，阻断黑色素的合成反应链，减少其在皮肤内的生成，从而达到祛斑增白的效果。
近年来，由于其在化妆品领域的广泛应用，使得不断有更新更有效的酪氨酸酶抑制剂得到研究并开发。
关键词：酪氨酸酶抑制剂植物来源人工合成中图分类号：Q356.1 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2015）06（c）-0200-02酪氨酸酶（Tyrosinase），又称多酚氧化酶，是一种含铜金属酶，广泛存在于细菌、真菌、裸子植物、被子植物、哺乳动物等生物中，并存在于生物界系统发育阶段的各个水平。
一般认为，羽毛，毛发，眼睛，昆虫表皮，种子等呈现出黑色、褐色、浅黄色等色素，都是酪氨酸酶作用的结果。
酪氨酸酶在不同的生物中具有各异但却都很重要的功能。
酪氨酸酶兼有单加氧酶和氧化酶双重功能，是生物体内参与黑色素（melanin）合成的关键酶。
酪氨酸酶催化L-酪氨酸最终形成黑色素是一个非常复杂的过程。
黑色素的合成途径一般被分为两个阶段：远端步骤和近端步骤。
近端步骤包括单酚和/或邻-二酚的酶氧化，由含铜酪氨酸酶催化形成邻醌；远端步骤包括化学反应和酶反应，最终合成黑色素。
酪氨酸酶抑制剂作为黑色素祛除剂可以在皮肤美白化妆品具有重要作用，因此，可以通过酪氨酸酶的活性抑制实验来确定这些美白剂。
酪氨酸酶抑制剂的来源非常广泛，不仅有天然产物，而且有很多是人工合成化合物。
如表1和表2所列，这些化合物在抑制酪氨酸酶单酚酶酶活的同时也抑制了二酚酶的酶活。
1 植物来源的酪氨酸酶抑制剂众多的具有生物活性、副作用小的化合物来源于植物。
如表1所示，很多植物源的天然产物对酪氨酸酶活性具有抑制作用，并且这些化合物的抑制能力及其抑制类型不尽相同。
酪氨酸酶抑制剂的研究进展
摘% 要： 酪氨酸酶 （ &’()*+,-*.， /0#1#$1#21# ） 广泛存在于自然界中， 其化学本质是含铜蛋白， 是黑色素生物合成的关键酶 和限速酶。酪氨酸酶的活性与色素沉着性疾病、 食品褐变等均有密切关系。抑制酪氨酸酶活性对人类皮肤色素疾病 的治疗、 食品保鲜及农业抗虫领域具有重要意义。本文对近年来酪氨酸酶抑制剂的来源、 制备方法、 抑制机理进行了 综述。 关键词： 酪氨酸酶， 抑制剂， 作用机理
［ !* ］ 由基的作用， 能抑制色斑的生成等。朱晨江等 对
用， 且其为竞争性抑制类型。
［ %( ］ B;247 C&D 等 从 E14AF2@G</8 =.=;9.A/8 叶中分
离栎精， 发 现 栎 精 对 酪 氨 酸 酶 有 很 强 的 抑 制 作 用。
［ %H ］ 章克昌等 研究了 !I 味中药醇提物对酪氨酸酶的
种从海洋软体动物中提取出来的糖类物质 S: 分析， 以黑素瘤细胞为受试对象， 结果发现它有很好的美 白作用。 %&!&!" 化学合成物 " 研究者通过对酪氨酸酶活性中 心和催化原理的研究， 已证明一些化学合成物对酪 氨酸酶具抑制作用。 维生素 C 可以作为 #$。曾伟成等学者分别以雪 梨酪氨酸酶和马铃薯酪氨酸酶为作用对象， 发现 T C 对酪氨酸酶具有较高的抑制作用。研究人员还发现
熊果苷进行结构改造， 合成了一系列稳定高效的新 型碳糖苷类熊果苷类似物， 并通过核磁、 质谱确定了 化合物的结构， 初步测试结果表明， 化合物具有良好 的酪氨酸酶抑制活性。
［ !( ］ 戴新荣等 在无水氯化锌和氯化氢存在下， 以
蘑菇酪氨酸酶抑制剂的合成、生物活性与分子对接研究
He Hag
Abstract ：Six benzaldehyde thiosemicarbazones were synthesized and evaluated their mushroom tyrosinase inhibition activity.The results showed compounds 1a（R=2-OH）and 1b（R=2-OH-4-OCH3）exhibited the IC50 values of 0.65±0.09µM and 0.46±0.04µM against monooxidase，5.15±0.17µM and 3.31±0.10µM against dioxidase，respectively，which means the 2-position of benzene ring plays an important role in the activity.Molecular docking results showed the sulfur atom of 1a can chelate with Cu2+，and imine formed two hydrogen bonds with His85 and His259，further，the hydrophobic can be increased because of the intramolecular hydrogen bond.
氨酸酶具有双重催化功能，能够催化 L- 酪氨酸羟基化形成 L- 10µL 抑制剂溶液和 8µL 活力为 336U/mL 的蘑菇酪氨酸酶加入
多巴（单氧化酶），然后氧化 L- 多巴形成多巴醌（双氧化酶）， 96 孔 Elisa 板，并在 28℃温浴 3min。然后，添加 50µL 0.6mM
酪氨酸酶活性抑制实验方法
酪氨酸酶活性抑制实验方法一、试剂：酪氨酸酶、酪氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、阳性对照（熊果苷粉末）、样品、去离子水二、试剂配制：1、磷酸盐缓冲溶液（PH=6.8）：先分别配制0.2M的磷酸二氢钠和0.2M的磷酸氢二钠。
0.2M磷酸二氢钠：称取 71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于 1000ml 去离子水；0.2M磷酸氢二钠：称取 31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 去离子水；取51ML磷酸二氢钠+49ML磷酸氢二钠即得0.2M、PH=6.8的磷酸缓冲液。
2、L-酪氨酸溶液：称取L-酪氨酸25.6 g，用磷酸缓冲液定容于50mL容量瓶中，即得L-酪氨酸溶液。
3、酪氨酸酶溶液：将马铃薯洗净，于4℃预冷4h左右。
去皮，切成约1.0 cm3丁状，于-20℃冷冻过夜。
称重，按1：1（W:V ）的比例加入4℃预冷的磷酸钠缓冲液，用组织捣碎机制成匀浆，3层纱布过滤，滤液于4000 r/min离心10min，上清液即为所得的酪氨酸酶粗酶液，4℃保存，2h内用完。
4、受试液的配制：将原先所配5mg/ml的溶液用甲醇稀释到1mg/ml.。
5、阳性对照：取熊果苷粉末0.01g，溶于10ml的甲醇溶液，即得1mg/ml的对照品溶液。
三、实验方法：依下表所示向试管中依次加入磷酸盐缓冲溶液、样品溶液、酪氨酸溶液，于35℃水浴10分钟。
然后加入酪氨酸酶液，混匀，再在35 ℃下孵育30min，迅速转移至比色皿中，在475nm处测定吸光值。
受试组用空白对照组1调零，阴性对照组用空白对照组2调零，阳性对照组用空白对照组3调零。
受试组吸光值为A1，阴性对照组吸光值为A2，阳性对照组吸光值为A3。
抑制率=1－[（A1－A2）/(A3－A2)]×100%=（A3－A1）/(A3－A2)×100% 注：受试液组共四种样品。
3_羟基苯甲酸对酪氨酸酶的抑制作用和抑菌作用_张丽娟
第45卷 第5期厦门大学学报(自然科学版)V ol.45 N o.5 2006年9月Journal of Xiamen University (Natural Science )Sep.2006 3-羟基苯甲酸对酪氨酸酶的抑制作用和抑菌作用收稿日期:2006-01-04基金项目:国家自然科学基金(30570408)和福建省重点科技项目(2004N002)资助作者简介:张丽娟(1962-),女,在职硕士研究生.工作单位:厦门市第一医院.*通讯作者:chen qx @j 张丽娟,张春乐,宋康康,陈清西*(厦门大学生命科学学院细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室,福建厦门361005)摘要:酪氨酸酶是一种金属铜蛋白,广泛存在于自然界中,在生物体合成黑色素过程中起着关键作用.以3-羟基苯甲酸为效应物,研究对蘑菇酪氨酸酶活力的影响和对化妆品中的主要腐败菌的抑制作用.结果表明:3-羟基苯甲酸对酪氨酸酶有明显的抑制作用,其半抑制率(I C 50)为4.20mmol /L.抑制作用表现为可逆的竞争型,抑制常数K I 为2.38mmo l /L.3-羟基苯甲酸对大肠杆菌(E.coli )、金黄色葡萄球菌(S t.aureus )和枯草芽孢杆菌(B.subti lis )有显著的抑制作用.本文通过研究3-羟基苯甲酸的抑酶和抑菌作用,为进一步研究设计新型化妆品添加剂奠定了理论基础.关键词:酪氨酸酶;3-羟基苯甲酸;抑制作用;抑菌作用中图分类号:Q 356.1 文献标识码:A 文章编号:0438-0479(2006)05-0705-04 酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)是一种活性中心具有双铜离子的氧化还原酶,参与黑色素合成的头两步反应,是黑色素合成的限速酶[1].在植物中,酪氨酸酶是引起果蔬发生酶促褐变的主要酶类[2].而在昆虫体内,该酶也普遍存在,主要与昆虫脱皮时的鞣化过程有重要关系[3].在人体中,酪氨酸酶则主要存在于皮肤表皮细胞的黑色素细胞中,与一些常见皮肤疾病如雀斑、黄褐斑、老年斑等色素障碍性疾病及恶性黑色素肿瘤的发生具有重要关系[4].因此,酪氨酸酶抑制剂也被作为具有美白作用的添加剂添加到化妆品中.虽然,随着研究的深入,逐渐诞生除酪氨酸酶以外的美白作用靶点的理念.但目前市场上使用的美白化妆品的增白剂,无论是天然提取的还是化学合成的,其增白机理均是通过抑制皮肤中酪氨酸酶的活性而达到美白的作用.同时,现有美白化妆品中的添加剂各自仍存在诸多方面的不足,酪氨酸酶抑制剂的设计与研究领域仍具有很大的空间.我们研究了3-羟基苯甲酸对酪氨酸酶抑制作用机理,通过与其同系物对酪氨酸酶抑制机理的比较,提出3-羟基苯甲酸与酶分子间的结合作用的分子模型,进一步探讨苯甲酸类化合物中苯环上功能基团的改变对该类化合物抑制酪氨酸酶活力的影响.同时,研究了3-羟基苯甲酸对3种化妆品常见腐败菌的抑菌作用.通过此研究,将进一步阐明3-羟基苯甲酸对酪氨酸酶的抑制机理和苯甲酸类化合物抑制酪氨酸酶的构效关系,以期设计出同时具有辅助防腐功能的新颖高效的酪氨酸酶抑制剂用于美白化妆品.1 材料与方法1.1 材 料蘑菇酪氨酸酶、二甲亚砜(DMSO )为Sigma 化学公司产品;L -3,4-二羟基苯丙氨酸(L -DOPA )、3-羟基苯甲酸和3-羟基4-甲氧基苯甲酸为Aldrich 化学公司产品.其它试剂为国产分析纯,使用的蒸馏水为玻璃重蒸水.大肠杆菌(E.coli )、金黄色葡萄球菌(S t.au -reus )、枯草芽孢杆菌(B.subtilis )均由厦门大学生命科学学院微生物教研室提供.培养基为LB 培养基.1.2 方 法酪氨酸酶的活力测定以0.5m mol /L L -DOPA 为底物,参考文献[5].3-羟基苯甲酸预先溶于DM SO 中,在3m L 测活体系中加入含不同浓度的效应物的DMSO 溶液,并以DM SO 为对照,以排除其影响.在475nm 处,30℃恒温条件下,采用UV -650分光光度计测定光密度值随时间的增长直线,由直线斜率求得酶活力,消光系数按3700(mol -1 L cm -1)[6]计算.酶的抑制机理采用Linew eaver -Burk 双倒数作图判断,并通过比较动力学参数(K m 和V m )来判断.抑菌试验采用琼脂渗透法,根据文献[7]方法.将活化好的菌苔用无菌水制成菌悬液,然后加到普通琼脂培养基中,使菌液浓度约为3.0×105个/mL ,摇匀,即刻倒入无菌培养皿中,待充分冷凝后备用.用无菌打孔器在平皿内均匀打孔若干,直径约6mm ,间距不少于24mm ,孔中距平皿边缘不少于15mm ,分别在每孔内加入40μL 含不同浓度的3-羟基苯甲酸(溶于DMSO ).阴性对照为40μL 的DM SO.实验重复3次,以抑菌圈大小表示效应物的抑菌能力.2 实验结果2.1 3-羟基苯甲酸对酪氨酸酶酶活力的影响以L -DOPA 为底物,在测活体系中,加入不同浓度的3-羟基苯甲酸,研究其对酶活力的影响,酶活力随着3-羟基苯甲酸浓度增大而呈指数下降,见图1曲线A ,由图可得其半抑制率(IC 50)为4.20mmo l /L.采用相同的测活方法,测定了3-羟基4-甲氧基苯甲酸对酪氨酸酶活性的影响,结果见图1线B.实验结果说明3-羟基4-甲氧基苯甲酸对酪氨酸酶的抑制作用明显弱于3-羟基苯甲酸,当浓度为5.00mmo l /L 时,对酪氨酸酶的抑制率仅为30%. 图1 3-羟基苯甲酸(A )和3-羟基4-甲氧基苯甲酸(B )对酪氨酸酶二酚酶的抑制 F ig.1 Inhibitory effect of 3-hy drox ylbe nzoic acid (A )and 3-hy dro xy L -4-metho xy -benzoic acid (B )on the dipheno lase activity o f tyr osinase2.2 3-羟基苯甲酸对酪氨酸酶的抑制效应在含0.5m mol /L 底物及不同浓度的3-羟基苯甲酸的测活体系中,探讨酶活力与加入的酶量的关系.试验结果见图2.酶剩余活力对酶浓度作图得到一组通过原点的直线,直线的斜率随着3-羟基苯甲酸浓度的增大而下降,说明3-羟基苯甲酸对酪氨酸酶的抑制作用是可逆的,它通过抑制酶活力而导致催化效率的降低,而不是通过降低有效的酶量导致活力的下降.2.3 抑制机制及抑制常数的测定前文报道蘑菇酪氨酸酶催化L -DOPA 氧化是遵循Michaelis -Menten 动力学方程[5].以3-羟基苯甲酸为效应物,研究对酶促反应初速度的影响.结果以 图2 3-羟基苯甲酸对酪氨酸酶抑制效应机理的判断直线0～4的3-羟基苯甲酸浓度分别为:0、1.0、2.0、3.0和4.0mmo l /L F ig.2 De te rminatio n of the inhibito ry mechanism o f 3-hydr oxy lbenzoic acid o n ty r osinase 图3 3-羟基苯甲酸的抑制类型和抑制常数的测定.直线0～4的3-羟基苯甲酸浓度分别为:0、1.0、2.0、3.0和4.0mmo l /L Fig.3 Determination o f the inhibito ry ty pe and inhibi -tion co nstant of 3-hydro xy lbenzoic acid o n ty rosi -naseLinew eaver -Burk 双倒数作图得到一组交于Y 轴的直线(图3),说明3-羟基苯甲酸不改变最大反应速度(V m ),仅使米氏常数(K m )值增大,其效应为竞争性抑制类型.以K m 值对效应物浓度作图得到一条直线,可以求出3-羟基苯甲酸对酪氨酸酶抑制常数(K I )为2.38mm ol /L.2.4 3-羟基苯甲酸对几种化妆品常见腐败菌的抑制作用以DMSO 为阴性对照,80U /m L 的庆大霉素为阳性对照.相同试验条件下,在试验的孔中加入3-羟基苯甲酸DMSO 溶液40μL ,测定效应物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径.实706 厦门大学学报(自然科学版) 2006年验结果(表1)表明,3-羟基苯甲酸对上述试验的3种细菌均有显著的抑制作用,其中以对枯草芽孢杆菌的抑制作用最强,其次为大肠杆菌,对金黄色葡萄球菌抑制较弱.不同浓度的3-羟基苯甲酸对上述3种试验菌抑制的抑菌圈测定结果见表1.与阳性对照的庆大霉素(80U /mL )比较,3-羟基苯甲酸对枯草杆菌的抑菌活性最强,当其浓度为20m g /m L 时,对枯草杆菌的抑菌圈直径为15mm ,超过80U /m L 的庆大霉素的抑菌圈直径(14m m ),而对其它两种细菌的抑菌圈直径均小于庆大霉素的. 表1 3-羟基苯甲酸对大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈(mm )测定 T ab.1 Determinatio n o f the bacterio static activity of 3-hy drox ylbenzoic acid by the method o f the agar dif -fusion3-羟基苯甲酸/(mg mL -1)大肠杆菌枯草杆菌金黄色葡萄球菌DM SO #---庆大霉素*1814232.58(±)--59(±)8(±)8101010(±)102012151440161717 注:#DM SO 为阴性对照;*浓度为80U /m L 作为阳性 对照;“±”表示抑菌圈模糊,“-”表示无抑菌圈.3 讨 论表2 羟基苯甲酸对酪氨酸酶抑制效应T ab.2 Inhibitory effects o f hy dro xy L -benzoic acids on mush room ty r osinase常 数3-羟基苯甲酸4-羟基苯甲酸[6]2-羟基苯甲酸[8]苯甲酸[9]I C 50 4.20mmol /L 1.30mmol /L 4.30mmo l /L 1.00mmo l /L 抑制作用可逆抑制可逆抑制可逆抑制可逆抑制抑制类型竞争性竞争性竞争性非竞争性K I 2.37mmol /L0.73mmol /L2.49mmo l /L0.95mmo l /L 酪氨酸酶在人体内具有重要的生理活性,对黑色素的生物合成起着重要的调控作用,是人肤色的决定因素之一.通过抑制该酶的活力,不但可以对皮肤色素沉着性疾病具有一定的治疗效果,而且可以达到美白的效果.亚洲人属于黄色人种,人口众多,具有广阔的美白化妆品市场.而目前酪氨酸酶抑制剂的研究主要集中在日韩两国.本研究有助于填补我国在此研究领域的空白,为深入研究酪氨酸酶抑制剂提供理论基础.苯甲酸是一种可作食品饲料防腐剂、醇酸树脂和聚酰胺的改性剂、医药和染料中间体的精细化工产品[8].作为具有苯环的有机酸,苯甲酸也是一种有效的酪氨酸酶抑制剂[9].我们已经报导了其衍生物4-羟基苯甲酸[6]和2-羟基苯甲酸对酪氨酸酶的抑制作用[10].本文报道3-羟基苯甲酸对酪氨酸酶的抑制作用并与它们作比较(表2).苯甲酸对酪氨酸酶的抑制作用表现为非竞争性,而羟基化的苯甲酸,无论是邻位、间位还是对位的羟基苯甲酸均是酪氨酸酶的可逆竞争型抑制剂.由IC 50和K I 的大小顺序,得到这3种化合物的抑制强度顺序为:4-羟基苯甲酸>3-羟基苯甲酸>2-羟基苯甲酸.由表2可以看到,苯环上羟基的引入以及羟基位置的不同都会使化合物抑制酪氨酸酶的活性发生改变.当苯甲酸的苯环上引入羟基,其抑制机理发生改变,由非竞争性转变为竞争性抑制剂.这可能是因为,苯甲酸是通过羧基与酶主要的氨基形成席夫碱结构而产生抑制作用,而当苯环引入羟基,其作用机理发生改变,化合物与底物竞争地与酶活性中心结合,化合物的羧基不能与酶形成席夫碱结构.而羟基的位置对化合物抑制活性的影响符合规律:4-取代>3-取代>2-取代化合物,表明,苯甲酸类化合物苯环上4-位对于该类化合物抑制酪氨酸酶的活性具有重要的作用.苯甲酸类化合物苯环上引入不同取代基后,由于电子分布和空间效应的不同,其生物活性也相应发生变化.为了进一步说明苯环上取代基的不同对苯甲酸类化合物抑制酪氨酸酶活性的影响,我们研究了3-羟基4-甲氧基苯甲酸对酪氨酸酶活力的影响.结果表明3-羟基4-甲氧基苯甲酸对酪氨酸酶的抑制作用明显减弱.由此我们可以推测羟基的邻位引入甲氧基,将导致产生空间位阻效应,使化合物不能与酶活性中心作用,而丧失抑制酪氨酸酶的活性.进一步说明了具有苯环的化合物中苯环上取代基团的类型及位置对于其对酪氨酸酶的作用都是至关重要的.大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌是化妆品中常见的腐败菌.通过抑菌实验结果表明,3-羟基苯甲酸707 第5期 张丽娟等:3-羟基苯甲酸对酪氨酸酶的抑制作用和抑菌作用对这3种细菌均具有抑制作用,尤其对枯草杆菌抑菌作用最强.文献[11]报道0.1%的苯甲酸在中性条件下对大肠杆菌、枯草杆菌均没有抑制作用,而对金黄色葡萄球菌有较强的抑制代作用,抑菌圈达8.38mm.在我们的研究中,3-羟基苯甲酸对大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌均有较强的抑制作用,抑制强度随着效应物浓度的增大而加强(表1),说明3-羟基苯甲酸中羟基的引入增大了苯甲酸类化合物的使用范围,并有利提高该类化合物的抑菌活性.因此,可以在此基础进行结构改造,以期得到抑菌作用更强的化妆品防腐剂.本文通过对3-羟基苯甲酸抑制酪氨酸酶机理的研究及与其同系物抑制效应的比较,进一步阐明了该类化合物抑制酪氨酸酶的构效关系,以期为进一步设计新型的酪氨酸酶抑制剂奠定理论基础,及进一步发展新型具有辅助防腐功能的美白添加剂用于化妆品.参考文献:[1] Sánchez-Fe rrer A,Ro dríg uez-López J N,G arcía-Cánov asF,et al.T y rosinase:a comprehensiv e review of its mecha-nism[J].BBA-protein and M olecula r Enzy molog y,1995,1247:1-11.[2] Jimenez M,Chazarr a S,Escribano J,et petitive in-hibitio n of mushro om ty ro sinase by4-substituted benzal-dehydes[J].J.Ag ric.Fo od Chem.,2001,49(8):4060-4063.[3] 薛超彬,陈清西,王勤,等.菜青虫不同虫态及虫龄的多酚氧化酶性质比较[J].昆虫学报,2004,47(3):305-309. [4] 潘兴华.黑素细胞及黑素的生成与调节[J].生理科学进展,1998,29(2):179-181.[5] 宋康康,邱凌,黄璜,等.熊果甙作为化妆品添加剂对酪氨酸酶抑制作用[J].厦门大学学报:自然科学版,2003,42(6):791-794.[6] Chen Q X,So ng K K,Q iu L,et al.I nhibito ry effects onmushr oom ty ro sina se by p-alkox ybenzoic acids[J].Fo odChem.,2005,91:269-274.[7] 陈月开,徐军,曲运波,等.氨基酸的抑菌作用研究[J].中国生化药物杂志,2001,22(1):29-30.[8] 郑公铭,何建新,谢秋香,等.苯甲酸制备新工艺研究[J].茂名学院学报,2004,14(3):4-6.[9] 刘晓丹,黄璜,陈清西.苯甲酸对蘑菇酪氨酸酶抑制作用机理的研究[J].厦门大学学报:自然科学版,2003,42(1):102-106.[10] Z hang J P,Chen Q X,Song K K,e t al.Inhibitory effectso f salicy lic acid family co mpo unds on the diphenolase ac-tivity of mushroo m ty ro sinase[J].Foo d Chem.,2006,95:579-584.[11] 李耀荣,肖丽英.几种防腐剂对常用内服液体制剂防腐效果的研究[J].邯郸医学高等专科学校学报,2005,18(5):411-412.Inhibition of3-hydroxylbenzoic Acid on Tyrosianse andIts Bacteriostatic ActivityZHA NG Li-juan,ZHA NG Chun-le,SONG Kang-kang,CH EN Qing-xi*(K ey Labora tory of the M inistry o f Education fo r Ce ll Bio lo gy and T umor Cell Engineering,Scho ol o f Life Sciences,Xiamen Univ ersity,Xiamen361005,China)A bstract:T y ro sinase(1.14.18.1)is a key enzy me during me lanin-biosynthesis,w idely distributed in nature.T he active site o f this enzyme consists of tw o coppe r atoms.T his paper repo r ts that3-hy drox ylbe nzoic acid can inhibit o-dipheno lase activity o f mush-roo m tyr osinase.T he inhibitio n kine tics and mechanism of the enzy me by3-hy drox ylbenzoic acid we re studied.T he results sho wed tha t3-hy dro xy lbenzoic acid w as a reve rsible inhibito r o f mushroo m ty ro sinase.With the co ncentratio n of this inhibito r incr ea sing,the activity of the diphenolase reduced ex po nentially.T he inhibito r conce ntr atio n leading to50%activ ity lo st(I C50)w as estima ted to be 4.20mmo l/L for dipheno lase.T he inhibition kinetics analy zed by Lineweav er-Burk plo ts sho wed that3-hydro xy lbenzoic acid wa s a co mpe titive ty pe inhibitor,and the inhibitio n co nstants for free enzyme(K I)w as deter mined to be2.38mmol/L.T he bacte rio sta tic activity of3-hydro xy lbenzoic acid wa s investig ated by the ag ar diffusio n method.T he result sho wed that3-hy dr oxy lbenzo ic acid could inhibit E.coli, B.subti lis and S t.aureus,w hich usually exist in putrefactive cosmetic.Key words:T y ro sinase;3-hydro xy lbenzoic acid;inhibitio n;dipheno lase;bacteriostatic activity708厦门大学学报(自然科学版) 2006年。
酪氨酸酶抑制剂的应用研究进展
酪氨酸酶抑制剂的应用研究进展胡泳华;贾玉龙;陈清西【摘要】酪氨酸酶是一类络合铜离子的金属酶类,广泛存在于动植物、微生物及人体中,是生物体合成黑色素、果蔬褐变的关键酶.酪氨酸酶的异常表现可能会出现黑色素瘤等,黑色素异常生成造成的色素沉着是动物衰老及果蔬褐变的重要表现.综述了酪氨酸酶抑制剂在美容保健、色素型皮肤病的治疗、病虫害防治以及食品保鲜等方面的应用,如:通过直接抑制酪氨酸酶活性以及调控细胞中酪氨酸酶的表达量来有效调控黑色素的生成,从而达到美白及治疗色素紊乱症的作用;抑制果蔬褐变,延长货架期;抑制昆虫蜕皮时的鞣化,达到杀灭农业害虫的目的;提高微生物对于紫外线及其他辐射的敏感度,进一步达到抑菌的目的.【期刊名称】《厦门大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(055)005【总页数】9页(P760-768)【关键词】酪氨酸酶抑制剂;医疗美容;害虫防治;保鲜;生物抗菌【作者】胡泳华;贾玉龙;陈清西【作者单位】厦门大学生命科学学院,福建厦门361102;厦门大学生命科学学院,福建厦门361102;厦门大学生命科学学院,福建厦门361102【正文语种】中文【中图分类】Q356.1酪氨酸酶(tyrosinase，EC 1.14.18.1)广泛分布于微生物、动植物及人体中,在植物中,酪氨酸酶一般称为多酚氧化酶;在昆虫中,一般称为酚氧化酶;在微生物和人体中,称为酪氨酸酶.酪氨酸酶是生物体合成黑色素、果蔬褐变的关键酶,在昆虫蜕皮时的鞣化过程和伤口愈合中起重要作用,细菌的黑色素能保护细菌细胞和孢子免受紫外线的伤害.酪氨酸酶具有单酚酶和二酚酶双重催化功能,在单酚酶的作用下,酪氨酸被羟基化成L-多巴(L-DOPA),在二酚酶的作用下,L-DOPA被氧化生成多巴醌,多巴醌再经过一系列的反应之后生成黑色素[1].酪氨酸酶表现异常,有可能会出现黑色素瘤及早发性老年痴呆疾病等,黑色素异常生成造成的色素沉着是动物衰老及果蔬褐变的重要表现[2].酪氨酸酶抑制剂应用广泛,涉及美容保健、色素型皮肤病治疗、病虫害防治以及食品保鲜等多个领域.黑素细胞中酪氨酸酶的基因转录是在小眼转录因子(microphthalmia transcription factor,MITF)的调控下进行的，MITF是黑素细胞增殖及黑素生成过程中起决定性作用的转录因子.现有研究表明,很多信号途径参与调节MITF的表达,例如:Wnt信号途径、cAMP(cyclic adenosine monophosphate)信号途径、P38及MAP(mitogen activated protein)激酶信号途径等[3]，一些主要信号通路总结于图1所示.在阳光照射(即紫外线的刺激下),皮肤角化细胞中的黑色素体受到刺激,可以通过促使分泌促肾上腺皮质激素和α-MSH黑色素细胞刺激素激活ACTH(adreno cortico tropic hormone)和PGE2(prostaglandin E2)蛋白的活化,激活cAMP调节CREB和CRE复合体的形成,进一步激活通路下游的酪氨酸酶活化;CREB/CRE复合体也可以通过上游NOS活化导致PKG(protein kinase G)通路激活而完成,DAG调控的PKC(protein kinase C)通路同样可以达到活化复合体的作用.CREB/CRE复合体激活之后,调节黑色素信号通路中的关键因子MITF在细胞核内完成MBOX结合,激活酪氨酸酶、相关蛋白TRP-1和DCT的大量表达活化.在完成黑素合成相关基因转录后,黑素在黑素小体内主要通过酪氨酸酶的作用进行合成，在人体皮肤角化细胞中,黑色素的形成导致表皮褐变,产生黑斑.以酪氨酸酶抑制剂作为化妆品美白添加剂的作用靶点主要是通过抑制酪氨酸酶的活性和调节酪氨酸酶的转录.其中抑制酪氨酸酶活力的作用模式是目前市场上大多数美白化妆品类开发应用的依据[4].黑色素细胞树突生长障碍是造成白癜风的病因之一,Wang等[5]研究了Rnaset2在人体黑色素细胞中的作用,研究结果表明Rnaset2是调控色素细胞树突生成的关键蛋白之一.Ito等[6]研究诱变白斑病相关酚类发现其能被酪氨酸酶催化,但相应的酚类抑制剂却不能被催化,证实酚类酪氨酸酶抑制剂在开发时需要先检查其是否能够被酪氨酸酶催化.孙道权等[7]研究了水溶性丝胶蛋白能够有效抑制黑色素生成,丝胶粉能够抑制皮肤中的酪氨酸酶活性,从而抑制黑色素的生成,对皮肤起到一定美白作用.陈龙等[8]的研究发现鱼胶原肽能够有效地抑制酪氨酸酶活性,鱼胶原肽可作为无毒副作用的纯天然美白化妆品原料.成静等[9]的研究发现胶原三肽作为构成胶原的最小单位,能够很好地抑制酪氨酸酶活性,在小鼠的黑色素瘤B16细胞中,既能够很好地抑制黑色素生成，同时又对细胞毒性较低.刘琦等[10]研究了维生素C、乙基醚、烟酰胺、β-熊果苷等美白化妆品成分对酪氨酸酶活性的抑制作用,研究表明3种美白剂对于酪氨酸酶的抑制作用表现为非竞争型抑制机理,说明他们与酪氨酸酶的独立部位结合,而不会和底物竞争活性中心.张凤兰等[11]研究表明,熊果苷具有一定的毒性,但它能被人体皮肤表面分离的菌株代谢转变成氢醌类化合物,但转变程度不足以对人CHO (Chinese hamster ovary)细胞产生致畸作用.杨美花等[12]的研究表明L-半胱氨酸能够有效抑制酪氨酸酶的活性,并且能够被酪氨酸酶催化成一种无色底物,使酪氨酸酶不表现出活性,并在细胞水平上证明L-半胱氨酸能够作为一种安全无毒的美白化妆品有效成分.还有很多研究发现多种药用植物中能够提取出有效抑制酪氨酸酶活性的成分,从而极大地丰富了酪氨酸酶抑制剂来源.Bae等[13]从毛壳属植物中提取的毛壳素就能够很好地抑制酪氨酸酶活性并且抑制小鼠黑色素瘤中黑色素的生成.柯静霞[14]的研究表明,蛇婆子提取物在使用8周水平上,能够有效抑制酪氨酸酶活性,降低黑色素活性,并且有效降低黑色素生成量,从而具有一定的美白功效.罗倩仪等[15]通过酪氨酸酶抑制模型研究了几种美白祛斑复配配方的实际筛选和功能优化,实验证明壬二酸衍生物、红景天提取物能够具有一定的美白祛斑作用.Lin等[16]从台湾火刺木中分离的活性物质也能够高效低毒的对酪氨酸酶产生良好的抑制效果并且作为美白剂进行使用.铃木敏幸等[17]对美白化妆品的发展方向进行综述时也提到,通过酪氨酸酶的阻碍实验可以有效地评价美白剂的相关作用,并且能够反映化妆品降低黑素生成的能力.早在2005年刘之力等[18]提到,中药复方乙醇提取物对酪氨酸酶有时也会存在激活作用,但激活酪氨酸酶活力并不代表能够在动物试验中增加黑色素生成的作用.马秋华等[19]从商品化的药物筛选到壬二酸，发现其具有抑制酪氨酸酶活性,并且能够有选择性地抑制黑色素过多的异常化细胞,作为一种美白化妆品的原料.付晓磊等[20]基于商品化的酪氨酸酶抑制剂对苯二酚合成了一系列对苯二酚氨基酸缀合物,通过表征实验证明其能够有效地抑制酪氨酸酶活性,通过构效关系模型研究证实了其具有良好的抑制活性;宋长伟等[21]基于龙胆酸化合物设计合成了系列衍生物,也具有良好的抑制黑色素生成的作用.以上的研究结果显示,酪氨酸酶抑制剂在化妆品研制过程中作为美白添加剂,能够保护人体皮肤免受紫外线辐射.酪氨酸酶在植物体内广泛存在,其很早就被作为植物储藏期间色变腐烂的原因加以研究.果蔬体内多酚氧化酶主要存在于完整细胞的质体、线粒体等细胞器内膜和细胞膜上及细胞质中,而酚类底物存在于液泡中,这种区室化分布减少了酚类物质与酶的接触,避免了正常组织中酶促褐变的发生.果蔬等产品在受到机械损伤或处于低温、高温环境下,细胞膜的完整性被破坏,区室化分布受到损害,使得酚类物质与多酚氧化酶相接触,加速了正常组织的褐变过程[22-23].在多酚氧化酶作用下,果蔬内源性多酚类物质如酪氨酸、多巴等氧化形成醌,醌类物质再聚合形成类黑色素,从而导致产品变色,造成营养丢失及经济损失.早期,含硫化合物广泛应用于食品的抗褐变中,王伟等[24]发现亚硫酸氢钠对马铃薯多酚氧化酶具有显著的抑制作用及在马铃薯切片护色中具有防褐变功能.然而,这些含硫化合物由于硫的残留对人体的健康造成一定的影响逐步被限制使用.目前,普遍的保鲜方法大致可以分为以下几类:低温保鲜[25-26]、化学保鲜[27-28]、气调保鲜[29-30]、涂膜保鲜[31-32]、臭氧保鲜[33-34]以及辐射保鲜[35-36]等.这些方法虽然可以不同程度地对食品的保鲜起到一定的作用,但由于成本高、费用多等原因而不能得到广泛应用.因此寻求一种高效、简单、低价的保鲜方法显得十分的重要.Sato等[37]从Lentinula edodes中克隆了1 854 bp的Letyr基因，其编码618个氨基酸残基的分子质量为68 ku的蛋白.该基因在蘑菇采后保鲜过程中的表达量大量增加.Sakamoto等[38]采用抑制消减杂交的方法发现采后的Lentinula edodes中两个酚氧化酶基因(酪氨酸酶tyr和漆酶lcc4)的表达明显增加,并且鉴定出这是导致蘑菇褐变的主要原因.因此,可以通过抑制酪氨酸酶的活力达到抑制或延缓食品褐变的发生,而且酪氨酸酶还是各种微生物生命活动所必需的酶,抑制酪氨酸酶的活性还能抑制腐烂菌的生长,达到保鲜防腐的目的,且不影响食品的风味及口感. 常见的酪氨酸酶抑制剂如半胱氨酸、抗坏血酸、柠檬酸等已应用于食品的保鲜中[39-40].Dawley等[41]研究了4-己基间苯二酚对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用,而4-己基间苯二酚已被应用于防止苹果片褐变[42]以及延缓虾类产品体内水溶性色原物质被氧化成黑色素而造成虾头胸部黑变[43].Lin等[28]研究了没食子酸丙酯对酪氨酸酶的作用,而后将其应用于龙眼的保鲜中,取得了很好的抗褐变效果.Xing等[44]发现铁取代磷酸盐(Na6PMo11FeO40)对酪氨酸酶是可逆的非竞争型抑制作用,并且其可以显著地延缓莲藕切片的褐变.植酸(又称为肌醇六磷酸)可以很好地抑制苹果汁中的多酚氧化酶活力从而可以显著地降低苹果汁在加工过程中褐变的发生[45].另外,冷冻处理、70 ℃热变性或者300～1 000 MPa高压处理也可以使酪氨酸酶活力失活[46],但这些处理可能对食品的品质造成一定的影响,因此从酪氨酸酶抑制剂出发寻找高效的保鲜剂不失为一种有效的手段.本研究采用酪氨酸酶抑制剂研究了抑制剂对马铃薯条、双孢蘑菇、龙眼及荔枝的抗褐变保鲜,研究结果如图2所示.由图2可知,对照组的马铃薯条比实验组褐变严重；对照组的蘑菇表皮褐变严重，出现腐烂现象；对照组的龙眼表皮褐变严重，有掉果及腐烂现象；而对照组的荔枝果实出现褐变、发霉现象.可见酪氨酸酶抑制剂可以很好地延缓果蔬褐变的发生.随着人口数量的不断增长及生活质量的不断提高,粮食短缺所带来的威胁也越来越严重,粮食产量受到自然灾害及病虫害的极大挑战.农药是控制病虫害、提高粮食产量的最有效手段之一.然而由于农药的广泛应用使得害虫的抗药性不断上升,农药本身的毒性亦不断上升,这对自然环境以及人类自身都构成了极大的威胁.面对这一严峻形势,研制新型、无公害、对环境友好的低毒高效杀虫剂已成为农业工业的第一目标,现有的农药品种远远不能满足粮食生产的需要,仍然需要大力加强农药新品种的研究与开发[47].早在1993年著名昆虫毒理学家张宗炳等[48]指出:探索新杀虫药剂的一条最有希望的途径是生物途径,其中酪氨酸酶抑制剂可列入首选.酪氨酸酶在昆虫的正常发育过程中具有重要的生理功能.它主要参与表皮的硬化、黑化过程;参与对外来侵染物的免疫防御反应;参与伤口愈合反应[49-51].在昆虫表皮硬化过程中,酪氨酸酶催化单酚羟化为二酚,然后氧化成醌,醌与表皮层中的角蛋白及几丁质相互作用,互相交联在一起,形成角质,高度硬化的角质可以阻断微生物和异物的入侵,形成保护昆虫的第一道屏障.此外,酪氨酸酶还可产生具有细胞毒杀作用的氧自由基和具有潜在细胞毒杀作用的半醌及三羟酚,进一步增强寄主的防御能力.在较高等的无脊椎动物如节肢动物中,酪氨酸酶除了参与角质的硬化和黑化外,还参与其他2种重要的生理过程,即防御反应(节肢动物免疫)和伤口愈合.对于小颗粒异物如细菌,宿主可通过吞噬作用加以消灭.当入侵的异物太大(如寄生虫),宿主便通过黑色素包被作用来抵抗和消灭寄生虫,而酪氨酸酶在这个过程中起重要作用.由于这些过程可能是害虫形成防御体系的重要反应,因此酪氨酸酶有可能作为害虫控制中的一个作用靶标.天然酪氨酸酶抑制剂将成为继几丁质酶抑制剂后的一类新的环境友好型的害虫生物调控剂.本实验室设计的酪氨酸酶抑制剂3,4-二羟基苯甲酸庚酯对于菜青虫(Pieris rapae L.)具有杀灭作用,将质量浓度分别为0，2.5，5，10，20,40 mg/mL的酪氨酸酶抑制剂和菜青虫饲料混合均匀，制成内吸型杀虫剂配方,对菜青虫喂养持续3 d,在第3天观察效果(图3)发现,5 mg/mL的质量浓度就可以有效抑制菜青虫幼虫的生长,这主要是通过抑制昆虫幼虫生长过程中的表皮糅化来达成的,可见这种质量浓度饲喂的幼虫大小明显小于对照组,而10 mg/mL的质量浓度以上,则可以完全杀灭菜青虫幼虫,说明了酪氨酸酶抑制剂可以有效抑制农业常见害虫幼虫的生长,在高浓度作用下,能够有效杀灭害虫幼虫,具有较好的研究价值和应用前景．Dong等[52]克隆了小菜蛾中的多酚氧化酶(PPO)并通过real-time PCR研究发现PPO存在于小菜蛾的不同发育阶段.Bhonwong等[53]比较了过表达PPO、抑制PPO表达以及正常的马铃薯叶喂养棉铃虫及甜菜夜蛾的生长情况,结果证实了PPO 在抑制棉铃虫及甜菜夜蛾的生长发育中起到重要的作用.Pan等[54]合成了系列的3,4-二羟基烷基酯,该系列化合物可以有效地抑制酪氨酸酶活力,并且发现其能使小菜蛾的生长明显受到抑制,进一步研究发现该系列化合物能使小菜蛾中PPO基因表达下降,从而抑制其生长.此外,曲酸[55]、缩氨基硫脲类化合物[56]、苯胺类席夫碱[57]以及α-巯基-β-取代苯基丙烯酸[58]等化合物对昆虫酚氧化酶具有很好的抑制作用,这为研究开发新型的“昆虫生命活动干扰剂”进行了有益探索.酪氨酸酶是合成黑色素的关键酶,其代谢产生的黑色素能够有效提高细菌对抗紫外线以及其他电离辐射作用[59].蔡信之等[60]甚至将高表达酪氨酸酶的基因转入苏云金芽胞杆菌中，用以增强细菌的抗紫外线以及抗辐射能力.因此,筛选出能够抑制微生物的酪氨酸酶活性便显得尤为重要.Basavegowda等[61]通过对青蒿素提取物进行纳米金属离子处理后,发现其不仅能够有效抑制酪氨酸酶,还能够表现出良好的抑菌活性.田敏等[62]通过对环境微生物进行筛选,以链霉菌X59为鉴定菌的黑色素生物合成抑制剂筛选模型,从4 000余种微生物中筛选出一株活性化合物产生菌,其代谢产物能够有效抑制黑色素的生物合成.黄晓冬等[63]研究了红树植物桐花树叶片多酚提取物能够抑制酪氨酸酶活性并对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有明显的抑制活性;鲁卫斌等[64]的研究表明直接从马铃薯中提取的酪氨酸酶用于处理羊毛,具有一定的抗菌功效,并且对金黄色葡萄球菌的抑菌率能达到76.32%.Xia等[65]的研究表明,5-羟基-4-乙酰基-2,3-萘二羧酸酐萘酚-呋喃能够有效地抑制酪氨酸酶活性,同时抑制细菌的生长.王聪慧等[66]的综述中也提到,茶多酚作为一种天然化合物,能够有效地抑制酪氨酸酶活性,同时具有很好的抑菌功效,对伤寒杆菌、副伤寒杆菌、痢疾杆菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌等均有明显的抑制作用;也有前人研究证实丁香酚能够在抑制酪氨酸酶活性的同时,对黄曲霉、烟曲霉、产黄青霉、桔青霉、粘红酵母的生长均有不同程度的抑制作用,是一种良好的天然防腐剂.张丽娟等[67]研究了3-羟基苯甲酸对酪氨酸酶的抑制机理以及几种常见腐败菌的抑制作用,证明了3-羟基苯甲酸具有很好的抑制酪氨酸酶及细菌生长的作用.陈祥仁等[68]研究了3,4-二羟基氰苯对于酪氨酸酶稳态酶活力以及酶促反应的迟滞时间有影响,同时能够很好地抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌3种细菌和真菌白色假丝酵母的生长.本文中研究了酪氨酸酶抑制剂对细菌的抑制作用,研究结果如图4所示.4-苯基丁醇对克雷伯氏肺炎菌(图4(a))、根癌农杆菌(图4(b))和沙门氏菌(图4(c))均有一定的抑制作用并呈浓度依赖效应.3-羟基苯甲醛对克雷伯氏肺炎菌(图4(d))、根癌农杆菌(图4(e))和沙门氏菌(图4(f))有一定的抑制作用,但效果不如4-苯基丁醇明显.综上,酪氨酸酶抑制剂可以很好地应用于生物抗菌中.目前,酪氨酸酶抑制剂已经在医疗、农业抗虫、食品保鲜等多方面得到了广泛的应用,但就其在黑色素合成信号通路的作用、抑制农业害虫及微生物的生长以及食品的防褐变保鲜中的具体作用机制仍需进一步研究.【相关文献】[1] 陈清西,宋康康.酪氨酸酶的研究进展[J].厦门大学学报(自然科学版),2006,45(5):731-737.[2] 陈清西,林建峰,宋康康.酪氨酸酶抑制剂的研究进展[J].厦门大学学报(自然科学版),2007,46(2):274-282.[3] LEE H S,GOH M J,KIM J,et al.A systems-biological study on the identification of safe and effective molecular targets for the reduction of ultraviolet B-induced skin pigmentation[J].Sci Rep,2015,2(5):10305.[4] 孙蓓,李潇,卢永波.影响皮肤黑素沉着的美白制剂及其作用机制研究进展[J].中国美容医学,2015,24(22):82-85.[5] WANG Q,WANG X,LE Y,et al.Rnaset2 inhibits melanocyte outgrowth possibly through interacting with shootin1[J].J Dermatol Sci,2015,80 (1):25-32.[6] ITO S,WAKAMATSU K.A convenient screening method to differentiate phenolic skin whitening tyrosinase inhibitors from leukoderma-inducing phenols[J].J DermatolSci,2015,80(1):18-24.[7] 孙道权,庄愉,盛家镛,等.可用于化妆品中水溶性丝胶粉的性能研究[J].日用化学工业,2014,44(12):683-687.[8] 陈龙,陈栋梁,杨国燕,等.鱼胶原肽抑制酪氨酸酶活性能力的比较研究[J].中国美容医学,2008,17(10):1512-1515.[9] 成静,陈栋梁,江雪琼,等.胶原三肽对B16黑素瘤细胞黑素合成的影响[J].中国美容医学,2011,20(6):939-942.[10] 刘琦,刘洋,吴金昊,等.几种美白剂抑制酪氨酸酶活性的研究[J].日用化学品科学,2015,38(11):22-27.[11] 张凤兰,黄湘鹭,曹进,等.熊果苷的遗传毒性及人体表皮细菌对熊果苷代谢转化作用研究[J].中国药事,2014,28(4):375-380.[12] 杨美花,李智聪,刘凤娇,等.L-半胱氨酸作为化妆品美白添加剂的作用机理[J].厦门大学学报(自然科学版),2009,48(4):581-584.[13] BAE J S,HAN M,YAO C,et al.Chaetocin inhibits IBMX-induced melanogenesis inB16F10 mouse melanoma cells through activation of ERK[J].Chem BiolInteract,2015,245:66-71.[14] 柯静霞.蛇婆子提取物在化妆品中的应用及美白功效研究[J].日用化学品科学,2011,34(5):30-33.[15] 罗倩仪,钟理.美白祛斑剂的复配研究及在化妆品中的应用[J].广东化工,2012,39(15):10-11.[16] LIN R D,CHEN M C,LIU Y L,et al.New whitening constituents from taiwan-native Pyracantha koidzumii:structures and tyrosinase inhibitory analysis in human epidermal melanocytes[J].Int J Mol Sci,2015,16 (12):28598-28613.[17] 铃木敏幸,芋川玄尔.美白化妆品发展趋向[J].上海轻工业,1996(4):20-24.[18] 刘之力,李雅莉,刘俐,等.六种中药复方乙醇提取物对酪氨酸酶激活作用及动物致色素作用的研究[J].中国皮肤性病学杂志,2005,19(10):588-591.[19] 马秋华,汪峰,周春英.壬二酸衍生物抑制酪氨酸酶活性实验研究[J].中国麻风皮肤病杂志,2011,27(3):215-217.[20] 付晓磊,赵春晖,张翼轩,等.对苯二酚的氨基酸缀合物的合成、表征及美白活性[J].应用化学,2015,32(2):158-166.[21] 宋长伟,熊丽丹,王裕军,等.新型龙胆酸衍生物的合成及其抑制酪氨酸酶活性研究[J].有机化学,2012,32:1753-1758.[22] 林河通,席芳,陈绍军.果实贮藏期间的酶促褐变[J].福州大学学报(自然科学版),2002,30(增刊):696-703.[23] CIOU J Y,LIN H H,CHIANG P Y,et al.The role of polyphenol oxidase and peroxidase in the browning of water caltrop pericarp during heat treatment[J].FoodChemistry,2011,127(2):523-527.[24] 王伟,胡泳华,黄浩,等.亚硫酸氢钠在马铃薯切片过程中防褐变作用机理的研究[J].厦门大学学报(自然科学版),2010,49(2):256-259.[25] WANG C X,LV X N,LIU Y,et al.Influence of tempe-rature and relative humidity on aging of atmospheric plasma jet treatment effect on ultrahigh-modulus polyethylene fibers[J].Journal of Adhesion Science and Technology,2007,21(15):1513-1527.[26] LATTAB N,KALAI S,BENSOUSSAN M,et al.Effect of storage conditions (relative humidity,duration,and temperature) on the germination time of Aspergillus carbonarius and Penicillium chrysogenum[J].International Journal of FoodMicrobiology,2012,160(1):80-84.[27] GACCHE R N,ZORE G B,GHOLE V S.Kinetics of inhibition of polyphenol oxidase mediated Browning in apple juice by beta-cyclodextrin and L-ascorbate-2-triphosphate[J].Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry,2003,18(18):1-5. [28] LIN Y F,HU Y H,LIN H T,et al.Inhibitory effects of propyl gallate on tyrosinase and its application in controlling pericarp browning of harvested longan fruits[J].J Agric FoodChem,2013,61:2889-2895.[29] GUILLAUME C,SCHWAB I,GASTALDI E,et al.Biobased packaging for improving preservation of fresh common mushrooms (Agaricus bisporus L.)[J].Innovative Food Science & Emerging Technologies,2010,11 (4):690-696.[30] BAN Z J,LI L,GUAN J F,et al.Modified atmosphere packaging (MAP) and coating for improving preservation of whole and sliced Agaricus bisporus[J].Journal of Food Science and Technology,2014,51(12):3894-3901.[31] JIANG T J.Effect of alginate coating on physicochemical and sensory qualities of button mushrooms (Agaricus bisporus) under a high oxygen modifiedatmosphere[J].Postharvest Biology and Technology,2013,76:91-97.[32] HONG K Q,XIE J H,ZHANG L B,et al.Effects of chitosan coating on postharvest life and quality of guava (Psidium guajava L.) fruit during cold storage[J].Scientia Horticulturae,2012,144:172-178.[33] DING T,RAHMAN S M E,OH D H.Inhibitory effects of low concentration electrolyzed water and other sanitizers against foodborne pathogens on oyster mushroom[J].Food Control,2011,22(2):318-322.[34] YUK H G,YOO M Y,YOON J W,et al.Effect of combined ozone and organic acid treatment for control of Escherichia coli O157:H7 and Listeria monocytogenes on enoki mushroom[J].Food Control,2007,18(5):548-553.[35] FERNANDES A,BARREIRA J C M,ANTONIO A L,et al.Study of chemical changes and antioxidant activity variation induced by gamma-irradiation on wildmushrooms:comparative study through principal component analysis[J].Food Research International,2013,54 (1):18-25.[36] FERNANDES A,ANTONIO A L,BARREIRA J C M,et al.Effects of gamma irradiation on the chemical composition and antioxidant activity of Lactarius deliciosus L.wild edible mushroom[J].Food and Bioprocess Technology,2013,6(10):2895-2903.[37] SATO T,KANDA K,OKAWA K,et al.The tyrosinase-encoding gene of lentinula edodes,letyr,is abundantly expressed in the gills of the fruit-body during post-harvest preservation[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,2009,73(5):1042-1047. [38] SAKAMOTO Y,NAKADE K,SATO T.Characterization of the post-harvest changes in gene transcription in the gill of the Lentinula edodes fruiting body[J].Current Genetics,2009,55(4):409-423.[39] OZOGLU H,BAYINDIRLI A.Inhibition of enzymic browning in cloudy apple juice with selected antibrowning agents[J].Food Control,2002,13 (4/5):213-221.[40] ROJAS-GRAU M A,SOBRINO-LOPEZ A,TAPIA M S,et al.Browning inhibition in fresh-cut ′fuji′ apple slices by natural antibrowning agents[J].Journal of FoodScience,2006,71(1):S59-S65.[41] DAWLEY R M,FLURKEY W H.4-Hexylresorcinol,a potent inhibitor of mushroom tyrosinase[J].Journal of Food Science,1993,58(3):609-610.[42] ALVAREZ-PARRILLA E,DE LA ROSA L A,RODRIGO-GARCIA J,et al.Dual effect of beta-cyclodextrin (beta-CD) on the inhibition of apple polyphenol oxidase by 4-hexylresorcinol (HR) and methyl jasmonate (MJ)[J].Food Chemistry,2007,101(4):1346-1356.[43] MARTINEZ-ALVAREZ O,GOMEZ-GUILLEN C,MONTERO P.Effect of different chemical compounds as coadjutants of 4-hexylresorcinol on the appearance of deepwater pink shrimp (Parapenaeus longirostris) during chilled storage[J].International Journal of Food Science and Technology,2008,43 (11):2010-2018.[44] XING R,ZHENG A P,WANG F,et al.Functionality study of Na6PMo11FeO40 as a mushroom tyrosinase inhibitor[J].Food Chemistry,2015,175:292-299.[45] DU Y J,DOU S Q,WU S J.Efficacy of phytic acid as an inhibitor of enzymatic and non-enzymatic browning in apple juice[J].Food Chemistry,2012,135(2):580-582.[46] SULAIMAN A,SILVA F V M.High pressure processing,thermal processing and freezing of Camarosa strawberry for the inactivation of polyphenoloxidase and control of browning[J].Food Control,2013,33 (2):424-428.[47] 罗万春.世界新农药与环境——发展中的新型杀虫剂[M].北京：世界知识出版社,2002：1-5.[48] 张宗炳,冷欣夫.杀虫药剂毒理及应用[M].北京:化学工业出版社,1993:331-337.[49] THEOPOLD U,SCHMIDT O,SODERHALL K,et al.Coagulation inarthropods:defence,wound closure and healing[J].Trends in Immunology,2004,25 (6):289-294.[50] SUGUMARAN M,NELLAIAPPAN K.Characterization of a new phenoloxidase inhibitor from the cuticle of Manduca sexta[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,268(2):379-383.[51] KRAMER K J,HOPKINS T L.Tyrosine metabolism for insect cuticle tanning[J].Archives of Insect Bioche-mistry and Physiology,1987,6(4):279-301.[52] DONG W,TANG B Z,SONODA S,et al.Sequencing and characterization of two cDNAs putatively encoding prophenoloxidases in the diamondback moth,Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera:Yponomeutidae)[J].Applied Entomology and Zoology,2011,46 (2):211-221.[53] BHONWONG A,STOUT M J,ATTAJARUSIT J,et al.Defensive role of tomato polyphenol oxidases against cotton bollworm (Helicoverpa armigera) and beet armyworm (Spodoptera exigua)[J].Journal of Chemical Ecology,2009,35(1):28-38.[54] PAN Z Z,LI H L,YU X J,et al.Synthesis and anti-tyrosinase activities of alkyl 3,4-dihydroxybenzoates[J].J Agric Food Chem,2011,59(12):6645-6649.[55] 王树栋,罗万春,高兴祥,等.曲酸对小菜蛾酚氧化酶抑制作用的研究[J].中国农业科学,2004,37(9):1316-1321.[56] 李智聪,马素娟,潘志针,等.缩氨基硫脲化合物的合成及对菜青虫酚氧化酶抑制作用研究[J].厦门大学学报(自然科学版),2009,48(5):623-626.。
酪氨酸抑制性测定实验方案
熟地黄提取液对酪氨酸酶的抑制作用研究一、仪器和药品：仪器：分光光度计、微量移液器（1ml）、电子天平、容量瓶（10ml、50ml、250ml）、回流装置一套、沸石、抽滤装置、旋转蒸发仪、水浴恒温箱、烧杯和量筒若干。
药品：熟地黄粉末（约50g）、体积分数50%的乙醇（200ml）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、L-酪氨酸、酪氨酸酶、去离子水若干。
二、实验方案：A、熟地黄有效成分的提取：1、干燥熟地黄粉末10.0 g + 体积分数50%的乙醇100mL，室温浸泡24 h。
2、烧瓶+沸石+上述浸泡液，回流提取3 h，冷却后抽滤取滤液。
残渣再次加50%乙醇100mL 回流提取3 h，冷却抽滤取滤液，合并两次滤液。
（回流温度约80℃。
）3、将滤液置于旋转蒸发仪上60-65℃浓缩回收溶剂，得膏状提取物。
4、称取适量膏状提取物+去离子水配置成1 mg/mL 溶液备用。
B、磷酸缓冲溶液（PBS）的配制：1、称取磷酸氢二钠13.3984 g，加去离子水溶解，转移至250mL 容量瓶中定容得a液；另称取磷酸二氢钠6.9011 g，加去离子水溶解，转移至250mL容量瓶中定容得b液。
2、分别移取a、b两溶液各50mL至250mL容量瓶中，加去离子水定容，即得pH=6.8的磷酸缓冲溶液。
C、L-酪氨酸溶液和酪氨酸酶溶液的配制：1、称取L-酪氨酸25.6 g，用PBS缓冲液定容于50mL容量瓶中，即得L-酪氨酸溶液。
2、称取酪氨酸酶0.3502 g，用PBS缓冲液定容于10mL容量瓶中，即得酪氨酸酶溶液。
（冰水浴中操作、保存。
）D、酪氨酸酶活力的测定：（分光光度法测A475）用微量移液器分别按表一剂量准确移取a、b、c、d四组样液，置于37℃水浴中恒温10 min后，各加入0.40mL酪氨酸酶溶液，混匀，37℃温育反应10 min，迅速移入比色皿中，测得在475nm处的吸光度A a、A b、A c、A d ，然后按下面的公式计算熟地提取液对酪氨酸酶的抑制率：抑制率=[1-（A d-A c）/（A b-A a）]×100%其中：a：既无底物也无提取物的待测液；b：有底物但无提取物的待测液；c：无底物但有提取物的待测液；d：既有底物也有提取物的待测液。
15种中药活性单体化合物对酪氨酸酶抑制作用研究
左旋多巴（5 mM）50 μl，140 μl PBS 于 96 孔板 37 ℃孵育 10 min， 加入酶 50 U 之后 10 min 于 475 nm 处测定吸光度。每一药物重 复 3 次。取麦冬大孔树脂提取物及 Vc 分别配制成不同浓度进行 测试，阳性对照为 Vc。
在早期使用的脱色剂中，氢醌、曲酸、含汞制剂、过氧化氢等， 都是毒性较大的物质，这促使人们转向从植物或微生物中寻找天 然、安全、高效的酪氨酸酶抑制剂，并应用于临床 。 [4，5]
本研究选取 15 种中药活性成分作为筛选对象测定其酪氨酸 酶抑制活性，旨在为新型高效酪氨酸酶抑制剂的发现和资源新用 途的开发提供参考。
麦冬皂苷 D、熊果苷、熊果酸、白藜芦醇、染料木苷、山奈酚、 黄 芩 苷 、异 鼠 李 素 、槲 皮 素 、毛 蕊 异 黄 酮 、白 杨 素 、黄 芩 素 、金 丝 桃 苷、豆蔻明、龙胆苦苷。以上为上海中药标准化研究中心提供的抑制率 将药物用 pH 6.8 磷酸缓冲液溶解稀释后与 0.1%L- 多巴反应
0 引言
酪 氨 酸 酶 (Tyrosinase) 是 一 种 含 铜 的 金 属 酶，广 泛 存 在 于 人 体、动植物及微生物中，是生物体内黑色素合成的关键酶，参与决 定哺乳动物皮肤、毛发的颜色，与人的衰老、昆虫的伤口愈合与发 育、果蔬的褐变有密切关系。酪氨酸酶异常过量表达可导致人体 的色素沉着性疾病如黑色素瘤、色斑等常见多发病，因此开发酪氨 酸酶抑制剂具有巨大的商业价值 。 [1-3]
液 0.5 mL 混合 ,37 ℃孵育 10 min 后，加入酪氨酸酶 50 U，37 ℃继 续孵育 10 min，取出冰浴，并立即于分光光度计 475 nm 处测吸光 度。每一药物浓度平行两份，计算均值及 SD。阳性对照采用不同 浓度的 Vc 溶液，以作为批内及批次之间的质量控制。
天然酪氨酸酶抑制剂研究进展
天然酪氨酸酶抑制剂研究进展天然酪氨酸酶抑制剂是一类能够抑制酪氨酸酶活性的化合物，具有潜在的药理学和生物学应用。
酪氨酸酶在多种生物过程中起着重要的调节作用，包括神经传导、免疫反应、细胞增殖和分化。
因此，研究天然酪氨酸酶抑制剂具有重要的科学和临床意义。
近年来，有一些重要的天然酪氨酸酶抑制剂被发现，并被广泛研究。
其中一类天然酪氨酸酶抑制剂是儿茶素类化合物，包括儿茶素和表儿茶素。
这些化合物具有多种生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤和抗肥胖等。
儿茶素类化合物的酪氨酸酶抑制活性主要通过与酪氨酸酶结合并抑制其活性来实现。
有研究表明，这些化合物能够结合酪氨酸酶的活性中心，并与其形成氢键和范德华力。
这种结合能够阻断酪氨酸酶与底物之间的相互作用，从而减少酪氨酸酶的活性。
除了儿茶素类化合物之外，还发现了一些其他天然酪氨酸酶抑制剂。
例如，人参总皂苷被发现具有抑制酪氨酸酶的活性，其抑制机制可能涉及与酪氨酸酶的亲合作用。
此外，多肽类化合物和天然产物也被发现具有酪氨酸酶抑制活性。
研究表明，天然酪氨酸酶抑制剂的应用具有潜在的药理学和临床意义。
例如，酪氨酸酶被认为在肿瘤发生和发展中扮演重要角色，因此，抑制酪氨酸酶的活性可能成为肿瘤治疗的一种新策略。
此外，酪氨酸酶抑制剂也被认为对于预防和治疗其他疾病，如炎症、肥胖和神经退行性疾病等，具有潜在作用。
总结来说，天然酪氨酸酶抑制剂研究进展非常迅速。
儿茶素类化合物和其他天然产物被广泛研究，并发现具有抑制酪氨酸酶活性的作用。
这些化合物的抑制机制主要涉及与酪氨酸酶的亲合作用。
酪氨酸酶抑制剂具有潜在的药理学和临床意义，包括肿瘤治疗、炎症控制和神经退行性疾病的治疗等。
47种中药对酪氨酸酶活性的影响及酶动力学的研究_涂彩霞
成 ,最大反应速度不变 ,而表观 Km 值变小 。山慈姑 、 白鲜皮 、薄荷 、桃仁 、夏枯草和黄芩的乙醇提取物对酪 氨酸酶具有非竞争性激活作用 ,说明这些中药能提高 酶的活性 ,表现出表观 Km 值不变 ,反应的最大速度 增加 。独活 、潼蒺藜 、紫荆皮 、申姜 、女贞子 、鸡血藤和 刺蒺藜的乙醇提取物对酪氨酸酶具有混合性激活作 用 ,说明这些中药既能促进底物与酶的活性中心的结 合 ,促进黑素产生 ,又能提高酶的活性 ,表观 Km 值减 小 ,同时反应的最大速度增加 。19 种中药乙醇提取物 对酪氨酸酶的激活类型见表 2 。
= A475 + 药 - 酶 。此外 ,另取 5 mgΠmL 的补骨脂素为 药物组阳性参比对照 。 1. 2. 3 中药影响酪氨酸酶活性的动力学观察 见参 考文献[ 5 ] ,将中药提取物溶解在 0. 5 mL 磷酸缓冲液 (1Π15 molΠL ,pH6. 8) 中 ,再与蘑菇酪氨酸酶 100μL (60 u) 混合 ,25 ℃孵育 10 min ,分别加入不同剂量的左旋 多巴溶液 ,继续孵育 2 min ,立即于分光光度计 475 nm 处测光吸收值 A475 ,利用多巴色素在 475 nm 处的消光 系数为 3. 7 ×103 ,计算酶的活力单位 ,采用 Lineweaver - Burk 双倒数法制得酶动力学曲线 ,用米氏公式计算 Km 。 1. 3 数据处理和统计方法 采用配对计量资料 t 检 验分析 。 2 结果 2. 1 中药乙醇提取物对酪氨酸酶有激活作用 47 种 中药中 ,有 19 种的乙醇提取物对酪氨酸酶有激活作 用 ,按作用强弱依次为鸡血藤 、夏枯草 、女贞子 、薄荷 、 潼蒺藜 、申姜 、旱莲草 、黄芩 、泽兰 、甘草 、山慈姑 、白鲜 皮 、独活 、刺蒺藜 、紫荆皮 、桃仁 、菟丝子 、苏梗 、补骨 脂 。见表 1 。 2. 2 中药对酪氨酸酶动力学的影响 酶动力学分析 结果显示 :苏梗 、菟丝子 、旱莲草 、甘草 、补骨脂 、泽兰 和补骨脂素对酪氨酸酶具有竞争性激活作用 ,说明这 些中药能促进底物与酶活性中心的结酪氨酸酶的激活率 ( x ±s) %
3种Dawson型杂多酸对酪氨酸酶的抑制作用
3种Dawson型杂多酸对酪氨酸酶的抑制作用谢乐芳;李莉莉;陈丙年;王力【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2017(038)019【摘要】合成3种Dawson型杂多酸H8[P2Mo17Zn(OH2)O61]、H8[P2Mo17Cu(OH2)O61]和H7[P2Mo17Fe(OH2)O61](分别简写为P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe),并用红外和紫外光谱进行结构表征.进而用酶动力学方法研究3种化合物对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用(包括抑制效果、抑制机理、抑制类型).结果表明:P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe 3种化合物对酪氨酸酶二酚酶均有明显的抑制效果,对应的IC50值分别为0.3462、0.3615、0.3831 mmol/L.3种化合物均属于可逆竞争型,抑制常数KI分别为0.1068、0.0682、0.0572 mmol/L.综合比较,3种化合物的抑酶效果依次是P2Mo17Zn>P2Mo17Cu>P2Mo17Fe.【总页数】5页(P175-179)【作者】谢乐芳;李莉莉;陈丙年;王力【作者单位】集美大学食品与生物工程学院,福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院,福建厦门361021;厦门大学附属中山医院演武分院,福建厦门361005;集美大学食品与生物工程学院,福建厦门361021【正文语种】中文【相关文献】1.Keggin型和Dawson型杂多酸的制备及其催化氧化性能比较研究 [J], 蒋小平;丁满花2.钒取代的Dawson型磷钼酸对酪氨酸酶的抑制作用 [J], 李莉莉;邓阳阳;谢乐芳;王力3.Dawson结构的多金属氧酸盐对酪氨酸酶的抑制作用 [J], 李莉莉;陈丙年;邓阳阳;谢乐芳;邢蕊;王力4.Dawson型砷钨基多酸阴离子修饰的杂化材料的合成及性质研究 [J], 王丹;苏占华;宋瑶5.Dawson型砷钨基多酸阴离子修饰的杂化材料的合成及性质研究 [J], 王丹;苏占华;宋瑶因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
酪氨酸激酶抑制剂的研究新进展[1]
![酪氨酸激酶抑制剂的研究新进展[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/ec6af8cca1c7aa00b52acb1c.png)
抑制剂的合理药物设计中[29]。 根据这个药效团模
型, 酪氨酸激酶中的 A T P 作用位点可以分成以下 5 个区域。
(1) 腺嘌呤区域
这个区域是强烈的疏水区域。 在 EGFR 激酶
中, A T P 腺嘌呤环的 N 1 和 N 6 这两个氮原子和关
图 2 化合物 SU 2101 和 CGP 59326
Abstract P ro tein ty ro sine k ina ses p lay an im po rtan t ro le in signa l t ran sduct ion p a thw ay s in regu la t2 ing a num ber of cellu la r funct ion s. T y ro sine k ina ses a re a t t ract ive a s ta rget s in the resea rch of therap eu t ic agen t s, no t on ly aga in st cancer, bu t a lso aga in st m any o ther d isea ses. T he p rog ress in ty ro sine k ina se in2 h ib ito r ha s been review ed, includ ing the chem ica l st ructu res and the p ha rm acop ho re m odels.
关键词 酪氨酸激酶 抑制剂 A T P 药效团模型 中图分类号: Q 55517 文献标识码: A 文章编号: 10052281X (2002) 0520355205
Progress in Tyros ine K ina se Inh ib itor
不同中药乙醇提取物对酪氨酸酶抑制活性的对比分析
不同中药乙醇提取物对酪氨酸酶抑制活性的对比分析宝应县中医医院江苏省扬州市225800【摘要】目的：研究分析不同中药乙醇提取物对酪氨酸酶抑制活性的对比。
方法：选取中药诃子、艾叶、紫草、白芷等药材应用70%乙醇提取方法，将维生素C、熊果苷作为阳性参照，运用体外酪氨酸酶抑制方法，对比不同药物的活性。
结果：中药诃子酪氨酸酶抑制率达到50.34%，艾叶酪氨酸酶抑制率为21.67%，而紫草酪氨酸酶抑制率达到-10.36%。
结论：中药诃子、艾叶醇提取物对于酪氨酸酶有抑制活性，能够为美白中药的研究提供新方向。
【关键词】乙醇提取物；美白；酪氨酸酶抑制活性美容中药与化妆品在我国有着悠久的发展历史，最早在《五十二病方》中记录有关美容的方剂共8首[1]。
由于中药的毒副作用相对比较低，应用后有着明显的效果，所以深受爱美女士的追捧。
中医药美白、祛斑等产品在国外发展迅猛，市面上有许多美白产品都是利用抑制酪氨酸酶活性，降低黑色素形成，具有美白的作用，药物美白作用效果可利用监测手段，将酪氨酸酶抑制率作为重要的评估标准。
本次研究基于体外实验，借助酪氨酸酶活性抑制实验，对诃子、艾叶、紫草、白芷等药材美白与抗菌消炎中药的美白活性进行观察，为研发中药美白制剂提供可靠的研究依据。
1.材料与方法1.1材料选取熊果苷由台湾第一化工原料股份有限公司提供；酪氨酸酶与酪氨酸源自于美国Sigma企业；KH2PO4与K2HPO4由台湾联工化学制药厂提供。
1.2中药供试液制取中药饮片诃子、艾叶、紫草、白芷中药源于北京同仁堂药方，称量10克原药材，放在三角瓶中，加入用药乙醇150毫升浸泡12小时，在三角瓶口处，覆盖玻璃皿，文火加热45分钟，把中药提取液进行抽滤处理，旋转蒸发仪器浓缩，旋转真空干燥仪器，使其在温度为50℃的环境下干燥处理，制备供试中药提取物粉末，利用天平精准称量17毫克中药提取液干燥粉末，将其转移到容量瓶之中，通过纯净水超声溶解定容处理后，制取成浓度为每升1.7毫克的供试药液。
4味中药对酪氨酸酶抑制作用的探讨
·中药房之窗·14味中药对酪氨酸酶抑制作用的探讨闫军1,李昌生1,陈声利1,张君仁2,赵天恩3(1.济南市皮肤病防治院,济南市250001;2.山东大学药学院,济南市250012;3.山东省皮肤病性病研究所,济南市250022)中图分类号R28;R96文献标识码A文章编号1001-0408(2003)07-0442-02摘要目的:研究14味中药对酪氨酸酶的抑制作用。
方法:用50%乙醇提取中药有效成分,利用紫外分光光度法测定酶促反应的速度,以衡量其对酪氨酸酶的抑制作用。
结果:测得14条酶促反应时间曲线。
结论:13味中药对酪氨酸酶活性呈较好的抑制作用(P<0.01),除芦荟以外,其余中药不影响酶促反应的平衡。
桃仁、僵蚕、芦荟抑制作用最好。
关键词中药;酪氨酸酶;紫外分光光度法;抑制Stud y on the Inhibitin g Effects of14Kinds of Chinese Materia Medica on T y rosinaseYAN J un,L I Chan g shen g,CHEN Shen g li(J inan Cit y Hos p ital for Skin Diseases Prevention,J inan250001) ZHAN G J unren(School of Pharmac y,Shandon g U niversit y,J inan250012)ZHAO Tianen(Shandon g Provincial Instit ute of Dermatolo gy and Venereolo gy,J inan250022)ABSTRACT OBJ EC T IV E:To inversti g ate t he inhibitor y effect s of14kinds of t raditional Chinese medicines on t y rosinase activit y1M E THODS:The effective com p onent s of t raditional Chinese medicines were ext racted b y50%et hanol1The s p eed of enz y mic catal y sis of t y rosinase was determined b y ult raviolet s p ect ro p hotomet r y to evaluate t he inhibitor y effect s of ext ract s of t raditional Chinese medicines1R ESUL TS:14reactive time curves of enz y mic catal y sis of t y rosinase were obtained1CONCL U S-ION:13kinds of t raditional Chinese medicines in vit ro showed a better inhibitive effect on t y rosinase activit y(P<0101), wit hout influence on t he e q uilibrium of enz y mic catal y sis exce p t Aloe barbadensis Miller1Prunus p ersica Bat sch,Bomb y x mori Linnaeus and Aloe barbadensis Miller showed t he best inhibitor y effect on t y rosinase activit y1KEY WO RDS t raditional Chinese medicines;t y rosinase;ult raviolet s p ect ro p hotomet r y;inhibition中药治疗色素障碍性皮肤病取得了良好的疗效,且人们积累了大量宝贵经验。
酪氨酸酶抑制及激活作用动力学的分析
以底物浓度（mol/L）倒 数1/[S]对酶催化活性 OD/min值的倒数1/V作图， 根据三条线的交点判断抑制剂 的类型。
2020/12/14
三、实验报告
采用四人一组，每两人选择两个化合物进行测 1 试。因为每个实验由10个点构成，可以去掉几
测试酶催化活性。可以通过稀 释的方式改变样品的浓度。
以没有加入样品的酶催化活 性OD/min值为100%，用激 活百分数(指被激活而增加活 力的百分数)表示不同浓度样 品对酶的激活活性，作图求出 最大激活活性时样品的浓度。
2020/12/14
实验安排
6，激活剂动力学的测试 适当选择2个不同的样品浓
2020/12/14
在动植物体内，酪氨酸酶 对酪氨酸和其它酚类化合 物的代谢以及黑色素的合 成起重要的催化作用。酪 氨酸酶可以催化两类不同 的反应：单酚羟基化形成 邻二酚和邻苯二酚氧化成 邻醌，这两类反应都必须 有氧分子的直接参与。
2020/12/14
2020/12/14
❖ 酪氨酸酶是皮肤黑素生物合成的关键酶，它不仅决定黑素 合成的速率,还是黑素细胞分化成熟的特征性标志，因此 它给人体皮肤美白带来困难。酪氨酸酶的活性与黑素合成 量相关，控制其活力即可控制黑素生成量。因此，研究酪 氨酸酶的抑制，对防止水果、蔬菜的褐变，化妆品中的皮 肤增白，以及因酪氨酸酶催化产生黑色素引起的疾病（黄 褐斑、黑色素瘤等色素沉着性皮肤病等），具有非常重要 的治疗意义。
实验仪器和条件
北京普析通用UV-1901 紫 外可mol/LpH 6.8磷酸盐缓冲液。 底物：25mol/L 邻苯二 酚 化合物溶液的配制： 1-萘酚和二羟基二苯甲酮 用乙醇配成50mol/L。 2-萘酚和六羟基二苯甲酮 用乙醇配成10mol/L。 硫酸亚铁和硫酸铜用蒸馏 水配成50mol/L。
关于苯甲醛反应的探讨与改进
关于苯甲醛反应的探讨与改进苯甲醛是一种有机化合物，广泛应用于化学、医学和工业领域。
其反应特性受到研究者广泛关注。
在实际应用中，苯甲醛的反应较为复杂，涉及多种反应机理和条件，需要深入探讨和改进。
苯甲醛通常可以进行加成反应、氧化反应、还原反应等。
其中，加成反应是最常见的。
加成反应是指两个或多个分子合成在一起时发生的反应，这种反应会在原子之间形成新的化学键。
苯甲醛在加成反应中是一种良好的电子吸引剂。
其反应可以与醛、羧酸、亚胺、芳香胺、芳香酮等发生加成反应。
在加成反应中，苯甲醛可以与氨基酸发生缩合反应，产生肽键。
这种反应通常在生物化学和化学生物学领域中应用较为广泛。
例如，苯甲醛可以与一种氨基酸苯丙氨酸缩合，形成DHP-苯丙氨酸。
这种反应可以通过控制反应条件和反应物比例来调节肽链长度和组成。
此外，在生物检测和检测分析测试中，苯甲醛也常用于分析蛋白质和DNA相互作用的方法。
除了加成反应，苯甲醛还可以进行氧化反应和还原反应。
其中，氧化反应是指化合物失去电子，而还原反应则是化合物获得电子。
苯甲醛在氧化反应中可以被氧化为苯甲酸或苯甲酮，而在还原反应中，则可以还原为苯乙醇或苯乙烯。
虽然苯甲醛的反应种类较多，但其反应机理和反应条件需要进一步探讨和改进。
例如，在缩合反应中，苯甲醛的缩合产物常常不稳定，并容易水解或发生其他反应。
为了改进这个问题，可以通过控制反应条件和缩合反应的物质组成来达到更好的缩合效果。
在氧化和还原反应中，苯甲醛的反应机理和反应条件也需要进一步研究，以提高其反应效率和稳定性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
无水 乙醇 配 ） ０ Ｉ －Ｏ Ａ （ ．５ｍｍ ｌＬ ，５ ｘ ＬＤ Ｐ ０ ０ ｏ ，磷 Ｌ ／ 酸缓 冲 溶 液 配 ） ４ ｘ 磷 酸 缓 冲 溶 液 （ Ｈ ＝ ，９０ Ｉ Ｌ ｐ
６ ８ ，在 紫外 吸收 波长 在 ２ ０～ ０ ｍ下 扫描 吸收 ．） ２ ４０ａ
究 一 引。
苯二 酚分 子 中不含 有氨 基 ，为 了证 明以上 观点 ，本
酪氨酸酶的酶活力测定参考 文献 ［Ｏ ：先加入 ５ １］ Ｏ Ｌ含不 同浓 度 的抑 制 剂 （ 水 乙醇 配 ） 于 ９ ０ Ｉ 无 ０ Ｌ ｘ
含 有 ６６ ｘ ．７ Ｉ ｇ酪 氨 酸 酶 的 磷 酸 缓 冲 溶 液 （ Ｈ ＝ ｐ ６８ 中 ，在 ３ ．） ７℃恒温 水 浴 中保 温 １ ｉ，然后加 ５ｍｎ
以多巴和以邻苯二酚作为酪氨酸酶催化底物 ，对苯 甲醛及其类似物对酪氨酸酶抑 制作用机理 进行 了详 细的研究 ，
并利用 Ｃ （ Ｄ 圆二色谱 ）研究 了苯 甲醛类化合物对酪氨 酸酶 的构象影 响 ，提 出苯 甲醛 及其 同系物与酶分子相 互作
用的可能机理 。
关键 词 ：酪氨酸酶；抑制；苯甲醛；圆二色谱
入 ５ ＬＬ Ｄ Ｐ （ ． ５ ｍ ｏ Ｌ 溶 液 启 动 反 应 ， Ｏ ． Ｏ Ａ ０ ０ ｍ ｌ ） ／ 迅速 充 分 混 匀 ，在 ３ ℃ 恒 温 条 件 下 测 定 波 长 为 ７
论文 分别 以 多 巴 和邻 苯 二 酚 作 为 酪 氨 酸 酶 催 化 底 物 ，对 苯 甲醛及 其类似 物对 酪 氨酸酶 抑制 作用 机理 进 行 了详细 的研 究 ，并 利 用 Ｃ （ Ｄ 圆二 色 谱 ）研 究 了笨 甲醛类 化合 物对 酪氨 酸酶 的构 象影 响 ，提 出苯 甲醛及 其 同 系物 与酶 分子 相互作 用 的可 能机 理 ，为 后续 酪氨 酸酶抑 制剂 的分 子设 计及 实 际应用 提供 了
曲线 ，并 扣 除 乙醇 的影 响。 同 样 方 法 分 别 扫 描 Ｌ －
Ｄ Ｐ Ｏ Ａ及 苯 甲醛 的 紫外 吸收 曲线进 行对 照 。
１ ２ ２ 以 ＬＤ Ｐ ．． ． Ｏ Ａ为 底 物 的 酪 氨 酸 酶 活 力测 定
于酪 氨酸 酶也 可 以催 化邻 苯二 酚发 生反 应 ，并且 邻
抑 制作 用 是 通 过 与 酶 分 子 中氨 基 酸 侧 链 的氨 基 反 应 ，形成 席夫碱 而导 致酶 催化 活性 降低 。如 果 以上
结论 成立 ，底 物 Ｌ Ｄ Ｐ ． Ｏ Ａ分 子 中也 含 有 一 个 氨基 ， 那 么 ，苯 甲醛 应该先 与底 物 Ｌ Ｄ Ｐ ． Ｏ Ａ发生 反 应 。 由
１ 材 料 与方 法
１１ 材 ． 料
酪 氨酸酶 为 Ｓｇ ａ化 学公 司 的蘑 菇 酪 氨 酸 酶 ， ｉ ｍ 比活 力 为 ６ ６ ０ Ｕ ｍ ；Ｌ３ 一 羟 基 苯 丙 氨 酸 ８ ／ ｇ － ，４二 （ ．Ｏ Ａ 为 Ａｄ ｃ ＬＤ Ｐ ） ｌｒ ｈ化 学 公 司 产 品 。苯 甲醛 ，对 ｉ
２０ ０ ７年 ９月
苯 甲醛 及其类似物对酪氨酸酶抑制作 用的研究
乔 薇 ，巫晓琴 ，黎 峰 ，崔 强 ，闰素君 ，马 林
（ 中山大 学化 学 与化 学工程 学 院 ，广 东 广 州 ５０ ７ ） １２５
摘 要 ：酪氨酸酶是一种金属铜蛋白，广泛存在于自然界中，在生物体合成黑色素过程中起着关键作用 分别
中图分 类号 ：Ｔ２２３ 文 献标 识码 ：Ａ Ｓ０． 文章编 号 ： ５９６７ ２０）０． ４． ０２－ ９（０７ ５ ０１ ４ ５ － － ０ ０
酪 氨酸 酶 （ Ｃ ．４ １ ． ） Ｅ １ １ ． ８ １ 是一 种 活性 中心具 有
理 论 基础 。
双 铜离 子 的氧化 还原 酶 ，参 与 黑色 素合 成 的头 两 步 反应 ，是黑 色 素 合 成 的 限 速 酶 … 。它 广 泛 存 在 于 微 生物 、动 物 和人体 ，是 生物 体合成 黑 色素 等产 生 色斑 的关键 酶 。酪氨 酸酶 是结 构复 杂 的多亚 基 的含 铜氧 化还 原酶 ，它先 将 酪氨酸 羟化 ，产 生邻 位二 羟 基苯 丙氨 酸 （ 一 巴） ，然后 再将 多 巴氧 化成 多 巴 Ｌ多 醌 ，进而 生成 一 系 列 引 起 褐 化 的 色 素 物 。 近 年 来 ，除对 该酶 进行结 构 功能 的基 础研究 外 ，由于色
抑 制剂 的研究 ，国 内研 究较 少且 不够 深入 ，主要 是
一
１２ １ 苯 甲醛 与 Ｌ Ｄ Ｐ ． ． ． Ｏ Ａ的相 互作 用 的测 定
在１
ｍＬ样 品管 中 ，加 入 １ Ｌ苯 甲醛 溶 液 （ ｏ Ｌ Ｏ １ｍｍ ｌ ／
些 用 于 皮 肤 保 健 和 治 疗 的 常 规 抑 制 剂 的 研 文献［ ］ ９ 报道 ，苯 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ醛类 化 合 物对 酪氨 酸 酶 的
维普资讯
第４ ６卷
第 ５期
中山大学学报 （ 自然科 学版）
Ａ Ｔ Ｓ Ｉ Ｎ Ｉ Ｒ Ｍ Ｎ Ｔ Ｒ ＬＵ Ｕ Ｉ Ｅ ＳＴ ＴＳ Ｓ Ｎ Ａ Ｓ Ｎ Ｃ Ａ ＣＥ ＴＡ Ｕ Ａ Ｕ Ａ ＩＭ Ｎ Ｖ Ｒ ＩＡ Ｉ Ｕ Ｙ Ｔ Ｅ Ｉ
Ｖｏ． ６ Ｎｏ ５ １４ ． Ｓ ｐ ２ ０ ｅ． ０７
４５ａ 的光 密 度 值 ，由其 随时 间 的增 长 直 线 的斜 ７ ｍ 率计 算 出 酶 的 活 力 。 所 用 乙 醇 浓 度 均 为 ３３ ％ ， ．３ 并用 对 照扣 除 乙醇对本 试验 的影 响 测定 仪 器为 岛
羟 基苯 甲醛 ，对 苯二 甲醛 ，肉桂 醛 ，乙 醇等试 剂均 为 国产 分 析 纯 试 剂 ，使 用 的 蒸 馏 水 为 去 离 子 重 蒸
水。
１２ 方 ． 法
素障碍性疾病 、恶性黑色素瘤 、白化病和老年性痴
呆 的发 生与 治疗 ，均 与酪氨 酸酶 直接 相关 ，国 内外 对该 酶 的研究 主要 集 中在 医 药方 面 。对 于该 酶