酪氨酸酶抑制率测定方法

1. 4念珠藻甲醇提取物对酪氨酸酶活性的抑制

1. 4. 1念珠藻甲醇提取物对酪氨酸酶活力的影响

提取物对酪氨酸酶的抑制参照Masuda和Kubo的方

法[ 6, 7] , 并略作修改。待测样品用DMSO 进行浓度

梯度稀释, 浓度分别为1、05、025、0125 mg / mL; 换算成反应体系中的终浓度分别为333、1665、8325、4 3 g /mL。反应在96孔细胞板上

进行, 每组8孔, 分别是: A. 不含样品, 但含酪氨酸

酶的阴性对照, 3孔重复; B. 不含样品及酪氨酸酶的

空白对照, 1孔; C. 包含样品及酪氨酸酶, 3孔重复,

D. 含样品但不含酪氨酸酶的空白对照, 1 孔。A 孔

中加入190 L pH 68、0 1 mo l/L 磷酸缓冲液,

10 L 1380 U /mL酪氨酸酶; B 孔中加入200 L 相

同的磷酸缓冲液; C 孔中加入180 L磷酸缓冲液,

10 L 1380 U /mL酪氨酸酶, 10 L样品; D 孔中加

入190 L磷酸缓冲液, 10 L样品。然后将细胞板

在30条件下放置5 m in, 再在每孔中加入100 L

2 5 mmo l/L L-酪氨酸( 见表1 )。在30反应

10m in后, 立即置于Tecan Sunrise 酶标仪中测量在475 nm下的吸光值。提取物对酪氨酸酶活性的抑

制按公式计算:

抑制率=( A - B ) - ( C- D)*100%

A – B

参照文献方法〔3〕在数支干燥的试管中

各加入1.oml0.03%左旋多巴溶液，再加上维

生素E一日环糊精溶液，(加入量按表所列体积) 最后的磷酸钠缓冲液加至5.Oml，25℃恒温10 min后，加入0.4ml酶提取液，立即计时并迅速置于恒温槽内，待反应1min，用BaCRman

DV一70型分光原度计在475nm处测定吸收度，以缓冲液为参比，然后根据多巴色素的消光系数“=3700求出Vi，把无维生素E一日环糊精溶液存在时速度定为100%，求出不同浓度维生

素E一日环糊精存在时酶的相对活性以及对酶的抑制率

抑制率二V。空白一V抑制V。空白x100%