定量PCR技术的研究进展

定量PCR技术的研究进展国外医学遗传学分册 1999年第22卷第3期苏州市妇幼保键院（苏州215004）林玲综述苏州医学院（苏州2150) 高锦声审校提要定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。

目前，各种定量PCR改良方法层出不穷，已用于基础研究的许多领域，并开始从实验室走向应用领域。

本文采用国外惯用分类方法对该技术进行了综述，并在叙述各类方法原理的基础一简述基优缺点。

关键词聚合酶链反应；定量分析自1985年Saiki等首次描述聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术以来，因其展现了前所未有的敏感性和特异性，受到了人们的高度重视。

短短13年的时间，各种各样以PCR为基础的DNA序列的扩增和控制方法得到迅猛发展，几乎已应用于基础研究的各个领域。

并且成为医学临床和法医学研究强有力的分析工具，如：病毒[1]或细菌[2]等病原体、紊乱基因[3]、癌[4]的检测，使疾病出现临床症状前即能得出可靠的早期诊断，大大提高了治愈的可能性。

然而，近几年来，研究者们不再满足于得知某一特异DNA序列的存在与否，他们更着眼于对其进行精确的核酸定量。

人闪曾运用Southern、Northern、狭孔印迹定量分析特异核酸序列，但普遍认为这些方法其定量的下限为105～107靶分子。

在RNA水平上，Rnase保护试验法和S1核酸酶处理法检测所必需的最少靶分子数位5×104。

尽管把PCR作为一种定量工具在技术上面临着一些挑点钟[5]，但是由于它能在千百分子构成的背景中重复地检测到10个分子的靶序列，甚至更少量的特异核酸分子，使得这种挑战具有很强的诱惑力。

一、定量PCR（quantitative PCR 即Q-PCR）的原理在实验生物学及医学的一些场合，由单纯PCR所提供的阳性或阴性结果还远远不够，在阐述许多问题的本质时，基因及其表达的定量起着至关重要的作用。

根据PCR反应的指数增长特性，一些研究者通过改进方法来寻求扩增产物与样本中原始靶核苷酸之间量的关系，以达到后者进行定量之目的。

因为PCR反应每个循环的产物均成为下个循环的底物，并按指数级扩增，所以可用方程式Y=X（1+E）n来推算扩增产物，Y代表PCR产物，X指起始模板核苷酸的量，n指反应循环数，E只能在很有限的循环周期中保持相对恒定，通常是20～30个循环，随后扩增效应减慢直至为0，扩增过程达平台期，此时，PCR产物的积累不同志依赖于投入的模板核苷酸量。

因此，在使用上述方程式前，必须用实验检测PCR扩增的指数增长特性。

在PCR 扩增的指数增长过程终止前循环数的多少取决于扩增效率E和起始样本的特异核酸序列丰度。

对于一个给定的扩增片段，起始样本的含量越大，则指数扩增过程越短，扩增过程中的在特性或参数很可能会引起动力学的变化，E取决于诸多因素，包括引物和扩增序列的特性、组份的浓度以及PCR反应温度等。

其中特别是DNA聚合酶量/模板量的商值，它可能会随着热循环仪上标本位置或不同临床标本中某个DNA聚合酶抑制的出现而变化[6]。

即使在同一条件、使用一试剂的条件下，管与管之间的扩增效率也可能发生变异[7]。

影响E的因素中任何微小的差异将导致特异PCR产物水平的极大变化。

显而易见，与那些处于良好状态下的标本相比，某些相似的样本所含的特异靶序列已部分降解，含量减少。

由于RNA易于降解和在逆转过程中效率的不稳定性，样品问题更加突出。

围绕这些问题，一些方法被改进以期尽可能地消除这些变异达到精确定量。

与非定量PCR分析方法不同，定量PCR分析的操作程序有助于评估污染的情况，即测出污染的程度，即使负对照产生了正的信号，只要这些信号比实验样品的低得多，依据这样的结果，至少可以推测出实验中所得出的信号是真实的。

在一定程度上消除了单纯PCR过于敏感、假阳性率高的缺点。

定量PCR常用来研究发病机制[24]、估计病毒的负荷量[25～27]、监测临床治疗进展[23，27～31]或用于诊断遗传缺陷[32]等。

通过对靶基因量的检测，将其与疾病的临床表现、临床分型以及各种标志酶的值联系起来，为疾病的诊断和药物疗效监测提供科学的依据。

定量PCR在这些方面的应用，特别是阈值的选择，仍需进行大量的研究工作。

二、定量PCR的方法学进展在PCR定量体系中，人们常提及相对定量和绝对定量的问题。

相对定量的目的是评估样品间核酸含量的差异，绝对定量的目标是确定某个样品准确的分子数。

通常比较样品间核酸分子的相对含量而不是绝对分子数对于很多应用场合已经足够了。

在DNA水平，因为很容易获得精确对照，即使只要求相对定量值，人们也倾向于报道绝对数值。

大多数mRNA 含量在整个细胞周期中变化很大，且很难获得精确的RNA对照，所以mRNA的相对定量的被广泛应用。

在一些方法中，相对和绝对定量的区别并不很显著。

任何定量工作的准确性都在本质上与所用标准的准确性相关联。

目前，一些定量PCR方法虽各有优缺点，但已得到了一定程度的应用和发展。

选取何种方法，须由靶序列特性、靶序列分子数的估计范围、定量要求的精确程度即相对与绝对等因素来决定。

数种定量PCR方法联合使用的例子也经常出现。

所有Q-PCR方法均要求进行检测和核实，以保证结果的可重复性和统计学的可靠性。

除了有限衡释度方法，其它方法都须对产物本身进行定量。

1.外对照PCR定量外对照定量PCR产物是最简单的PCR定量方法[8]。

外对照，通常是质粒，一个已知量的标准稀释系列，能与样品中的靶序列平行扩增。

并能得出这个标准稀释系列PCR产物/起始物量的线性关系，在同一PCR扩增循环中的样品靶序列的起始量相对值即可推测出来。

但这个定量过程必须在指数扩增期进行。

事实上，为了得到统计学的可靠结果，对一个反应过程中多个时间点的产物量进行线性回归分析是必要的[10]。

这种方法甚至可以消除管与管之间的差异，但不能消除样本与样本之间的差异。

现在，有些研究人员趋向于用重组RNA 模板作为定量RNA的标准。

体外转录类似于RNA靶序列的特异RNA（即cRNA）可以纯化作为对照。

但这种方法还须检测试管间的差异以增加试验的精确度。

外对照PCR定量可与巢式PCR联合使用。

巢式PCR已被广泛接受并基本有效地解决PCR中的非特异性[11]。

虽然在巢式PCR反应中，内外两对引物也将产生一些不同种类的非特异产物，但其量常不能达到能干扰定量的水平。

一些相对简单的非特异检测方法可用于对巢式PCR产物进行定量[12]。

巢式PCR面临的始终是污染的问题。

对于外对照定量PCR这种相对简单的方法，一个绐终潜伏的问题是PCR对试验过程中微小差异的敏感性，因其对外扩增效率的影响，有可能破坏实验的精确性和可重复性。

因此，建立一个外对照定量PCR，必须分析这个试验的精确性和可重复性的限制程度。

有学者通过扩增特异的IgG和TCRγ的基因重排来粗略估计急性淋巴细胞白血病治疗后的疾病残余水平[33]。

近两年来，使用外对照定量PCR的文献较少。

2. 有限稀释PCR定量分析有限稀释是一个细胞生物学水平建立起来的定量方法。

这种方法可经过对阳性样本进行系列稀释直至靶序列不再被扩增来进行PCR定量。

它基于使用一个定性全或无端点并假定混合物中一个或多个靶序列会导致一个阳性端点。

稀释的程度用来计算起始靶分子的数量。

为了增加这类量方法的可重复性，应使PCR过程最佳化，一个或几个靶分子能被稳定检测出[13]。

在每个稀释度均应进行多次反应，结果利用统计学泊松分布原理来计算。

必须严格消除污染物，以免假阳性干扰正常结果。

这种分析方式，一个重要优点即定量不信赖扩增效率，但每个样品需要多将近PCR反应，工作繁琐。

近来，研究者也较少使用。

3. 内对照PCR定量从细胞材料中提取的核酸包含大量非靶序列的DNA或RNA，这为靶序列的细胞中某个特异序列在同一个PCR管中共同扩增提供了便利。

这个特异序列不占据靶序列引物的结合位点，也不处于靶序列间，可作为一个内部标准，如：细胞β-珠蛋白基因[14]。

靶序列和内对照在扩增过程中使用不同的引物，靶序列的定量通过与内对照比较产物带的强度业进行。

内对照在样品中DNA量、扩增效率、电泳时的上样量的变化都是标准化的。

只是二者起始量、指数扩增期的效率相似，才能精确对靶序列定量[15]。

内对照PCR可以消除管与管之间的变异，并在一定程度上消除样本与样本之间的变异。

内对照定量PCR是学者们常用的研究方法之一。

如：最近，Lee等[32]运用同源基因作内对照Q-PCR快速检测21三体，并认为这种方法可被用于21三体综合征的产前诊断。

而Andrei等[23]为了增加准确性利用双重内对照定量PCR同时扩增HIV病毒基因和宿主细胞特征基因HAL-DQ，二者比率作为DNA水平感染程度指标，用以监测病毒复制情况和药物疗效评价。

实验中所加入DNA的量对于一个成功的定量分析是非常关键的。

太多的模板DNA将会饱和复制机构，不但会产生特异产物，也会产生非特异产物。

RNA内对照PCR定量显得比较困难。

目前普遍认为逆转录效率较低，且是一个产生变量的重要来源。

DNA标准不能用来监测逆转录步骤。

通过测量cDNA来推断mRNA通常比实际值低。

因此精确定量RNA，选用RNA标准较合适。

将内对照RNA与靶序列一起转录和扩增以弥补RT-PCR较低的可重复性。

Souaze等[15]认为，这个反应的成功依赖于在反应过程中保持TM和ICM数的等同，我们能通过调整TM/ICM比率来控制RT-PCR定量的精确性。

TM（target molecule）即靶分子、ICM（internal control molecule）为内对照分子。

当TM/ICM比率于0.66～1.5，最终结果出现错误的可能性大约为10%,若TM/ICM=2，则出错率达到60%。

4. 竞争性PCR定量最精确的DNA和RNA定量，可以通过竞争PCR和竞争RT-PCR获得[16]。

这个方法基于靶序列与一个已知浓度的内部标准在同一反应管中竞争性地共同扩增，二者具有相同引物的结合位点，以同一引物扩增，二者竞争引物、核苷酸和聚合酶。

由于竞争作用，当一种模板量逐渐增加时，另一种模板扩增产量逐渐减少。

两种模板PCR产物的比值与两种初始状态时核酸含量的比值有关。

当两种模板的拷贝数相等时，它们的扩增产物也基本相当，这时初始反应体系中内部标准模板的量也代表了被检测模板的量[1]。

如果这个竞争性的模板选择并构建恰当，在整个反应过程中扩增效率与靶序列扩增效率一致，就不一定把反应限制在指数扩增期内。

Klaus等认为这是竞争PCR技术最大的优点之一[22]。

但有学者认为，还是把竞争PCR限制在指数扩增期，视结果为相对而不是绝对量较好[18]。

竞争PCR能消除管间及样本间的变异[6]，定量范围较广，能够检测2倍的差[17]，因此，这种方法被描述以来，就吸引许多研究者，被广泛运用于细胞DNA、RNA以及病毒、细菌核酸的定量检测。