实时荧光定量PCR简介、结果分析及报告课件
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荧光定量PCR工作原理及应用PPT课件
灵敏度高
由于采用了荧光信号，荧 光定量PCR具有较高的灵 敏度，能够检测低拷贝数 的基因表达。
重复性好
通过标准化和内参基因的 校正，荧光定量PCR具有 较好的重复性，结果可靠。
突变检测
检测范围广
荧光定量PCR可以检测各 种类型的基因突变，包括 点突变、插入和缺失等。
高通量
通过多重PCR和阵列技术， 可以对多个基因位点进行 高通量突变筛查。
准确性高
由于采用了实时监测和荧 光信号，荧光定量PCR能 够提高突变检测的准确性。
病原体检测与鉴定
快速准确
荧光定量PCR能够快速准确地检 测和鉴定病原体，为临床诊断和
治疗提供依据。
高灵敏度
对病原体进行特异性扩增后，荧 光定量PCR能够检测出极低浓度
的病原体。
鉴别分型
通过荧光标记的特异性探针，可 以对病原体进行分型和鉴别，有 助于了解疾病传播和流行病学调
特点
高灵敏度、高特异性、可定量分 析、可自动化等。
发展历程
01
02
03
04
1996年
美国PE-Cetus公司推出第一 台商业化荧光定量PCR仪。
1997年
ABI公司推出TaqMan荧光探 针技术。
2000年
实时荧光定量PCR技术开始广 泛应用于临床诊断和科研领域
。
2004年
数字PCR技术问世，实现了单 分子水平的检测。
荧光定量pcr工作原理及应 用ppt课件
目录
• 荧光定量PCR技术概述 • 荧光定量PCR工作原理 • 荧光定量PCR的应用 • 荧光定量PCR的优缺点 • 荧光定量PCR的未来发展
01
荧光定量PCR技术概述定义与特点 Nhomakorabea定义
实时荧光定量PCR技术全面分析ppt课件
定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终 精确的对起始模板的定量分析
4
常规vs实时
优缺点比较 定量PCR
常规PCR
灵敏度高 高精确度 安全省时
只能进行半定量或定性 分析 不安全易污染 费时费力
5
定量PCR三个基本概念
扩增曲线
背景期
指数增 长期
相关系数(R2) ---大于0.99
平行管重复性 ---SD小于0.167
58
标准曲线差
可能的影响因素
稀释精度 加样精度 反应体系的优化 模板降解
59
定量PCR的新 运用
60
等位基因分型（SNP研究) MicroRNA分析 基因拷贝数（CNV)分析 蛋白质分析
61
62
相对定量的问题 样品材料不均一造成的差别
内标基因 内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因 （内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响） 对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的 误差
19
SYBR Green I法进行相对定量的问
题
问题：
SYBR Green I可以与非特异性双链结合 信号 结果不准确
理想的PCR反应： 非X理n=X想0×的2PnCR反应：
Xn=X0(1+Ex)n
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log (X0 (1+Ex)n)
整理方程式得:
n：扩增反应的循环次数
Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
结合双链DNA分子小沟 延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适 合光源激发，发射出荧光，反映产物 浓度
4
常规vs实时
优缺点比较 定量PCR
常规PCR
灵敏度高 高精确度 安全省时
只能进行半定量或定性 分析 不安全易污染 费时费力
5
定量PCR三个基本概念
扩增曲线
背景期
指数增 长期
相关系数(R2) ---大于0.99
平行管重复性 ---SD小于0.167
58
标准曲线差
可能的影响因素
稀释精度 加样精度 反应体系的优化 模板降解
59
定量PCR的新 运用
60
等位基因分型（SNP研究) MicroRNA分析 基因拷贝数（CNV)分析 蛋白质分析
61
62
相对定量的问题 样品材料不均一造成的差别
内标基因 内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因 （内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响） 对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的 误差
19
SYBR Green I法进行相对定量的问
题
问题：
SYBR Green I可以与非特异性双链结合 信号 结果不准确
理想的PCR反应： 非X理n=X想0×的2PnCR反应：
Xn=X0(1+Ex)n
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log (X0 (1+Ex)n)
整理方程式得:
n：扩增反应的循环次数
Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
结合双链DNA分子小沟 延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适 合光源激发，发射出荧光，反映产物 浓度
实时荧光定量PCR检测的数据处理及结果报告课件
基本概念
标准品（Standard） 用来构建标准曲线的已 知浓度的样本。
参比（Reference） 用于对检测结果进行标 准化的被动（Passive）或主动（Active）信 号。如内标和外标即为主动性参比的例子。主 动性参比意味着信号由PCR扩增所致，主动性 参比有其自己的引物和探针。被Байду номын сангаас性参比则为 非PCR所致，如ROX染料，可以校正荧光信号的 非PCR波动。
基本概念
扩增效率E（amplification efficiency） 扩增效率指的是一个循环后的产物增加量与这 个循环的模板量的比值，其值位于0到1之间。 在PCR的前20或30个循环中，E值比较恒定，为 指数扩增期，随后E值逐步降低，直至0，此时 PCR达到平台期，不再扩增。扩增效率的计算 可以采用系列稀释法，将稀释后浓度的对数值 与所得Ct值做图，在一定范围内应该是得到一 条直线，利用公式（1）：E=10-1/K-1（K为该 直线斜率）即可计算出E值。
在扩增达到阈值线时，此时，n = Ct，于是，扩增产物的量
为：
YCt = X ( 1+E )Ct (2) YCt 为荧光信号达到阈值强度时扩增产物的量。在阈值线设 定以后，它就是一个常数。（2）式两边同时取对数，得：
Log YCt = LogX ( 1+E )Ct (3) 亦即：Log YCt = LogX +Ct×Log ( 1+E )
基本概念
绝对定量（Absolute quantitation） 绝对定量是使用一系列 稀释的已知浓度的标准品与临床标本同时进行测定，根据系列浓 度标准品的Ct值与起始模板（RNA或cDNA）量之间的线性比例关系， 绘制标准曲线。待测标本的浓度则可根据其测定的Ct值，从标准 曲线或回归方程计算得到原始模板的数量。这种方法是假定所有 的标准品和临床标本有相近的扩增效率。系列稀释标准品的浓度 应包含临床标本的浓度范围，并且在实时PCR仪及检测试剂方法的 准确度和线性范围内。
实时荧光PCR简介及结果分析
无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。 2、曲线指数期斜率与扩增效率成正比，斜率越大扩增
效率越高 3、标准的基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势。 4、各管的扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效
率相近。
实验中样品浓度所遇到问题
原因：样品浓度跨度太大
解决方案：上图显示的样品浓度跨度太大导致信号值显示差异大，我们可以重 新将样品的稀释多个梯度后再进行相关实验验证
实时荧光PCR简介 及检测结果分析
疾控中心检验科
主要内容
1
实时荧光PCR技术基础理论
2
实时荧光PCR结果分析
3
PCR异常曲线解析
一、实时荧光PCR技术基础理论
1、实时荧光PCR技术概论 实时荧光PCR技术产生并成熟于上世纪90年
代，由于该技术实现了PCR从定性到定量的飞 跃，能够对PCR反应的全过程进行实时监控， 并且自动化程度高，所以该技术从产生到现在 短短的十几年时间，在科研及检验领域获得了 广泛的应用，成为分子生物学领域不可或缺的 一项重要技术。
设定三原则： 指数扩增初期、 整体曲线倾斜程度一致、 高于阴性对照的地方
实验结果的总体分析方法：
整体曲线的观察：分析是否存在污染（主要是试剂 污染）；分析是否有因物理或其他因素造成的异常 曲线情况；
阴性对照分析：观察是否存在污染； 阳性对照分析：观察是否在质控范围内。
判断扩增曲线是否良好的指标： 1、曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，基线平而
左图反映的是随着PCR反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指 数期很短-线性图；右图反映的是荧光信号的变化量的对数与PCR反应循环数的关 系，从右图可知，指数期很明显，在确定阈值线时具有简单明了的特点-对数图。
效率越高 3、标准的基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势。 4、各管的扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效
率相近。
实验中样品浓度所遇到问题
原因：样品浓度跨度太大
解决方案：上图显示的样品浓度跨度太大导致信号值显示差异大，我们可以重 新将样品的稀释多个梯度后再进行相关实验验证
实时荧光PCR简介 及检测结果分析
疾控中心检验科
主要内容
1
实时荧光PCR技术基础理论
2
实时荧光PCR结果分析
3
PCR异常曲线解析
一、实时荧光PCR技术基础理论
1、实时荧光PCR技术概论 实时荧光PCR技术产生并成熟于上世纪90年
代，由于该技术实现了PCR从定性到定量的飞 跃，能够对PCR反应的全过程进行实时监控， 并且自动化程度高，所以该技术从产生到现在 短短的十几年时间，在科研及检验领域获得了 广泛的应用，成为分子生物学领域不可或缺的 一项重要技术。
设定三原则： 指数扩增初期、 整体曲线倾斜程度一致、 高于阴性对照的地方
实验结果的总体分析方法：
整体曲线的观察：分析是否存在污染（主要是试剂 污染）；分析是否有因物理或其他因素造成的异常 曲线情况；
阴性对照分析：观察是否存在污染； 阳性对照分析：观察是否在质控范围内。
判断扩增曲线是否良好的指标： 1、曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，基线平而
左图反映的是随着PCR反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指 数期很短-线性图；右图反映的是荧光信号的变化量的对数与PCR反应循环数的关 系，从右图可知，指数期很明显，在确定阈值线时具有简单明了的特点-对数图。
最新实时荧光定量PCR介绍PPT课件
Probe设计要求高 Probe合成费用高
常用于mRNA表达量分析等
实时荧光定量PCR介绍
常用于SNP解析，病毒、病源菌检测
3/12/2024 • 11
主要内容
2
Real Time PCR实验方法
反转录反应
Real Time PCR反应
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 12
RT Primer的选择
体外转录RNA标准品构建流程
目的基因
RT
目的基因
Total RNA cDNA
T7 Promoter
PCR
目的基因
TTTT•••T
PCR产物
T7 RNA polymerase
AAAA•••A
体外转录RNA
AAAA•••A
RNA纯化后，测OD定量。将RNA梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。
• Random Primer • Oligo dT Primer • Gene Specific Primer
Random 6mer Primer Gene Specific Primer
Oligo dT Primer
PCR F-Primer PCR R-Primer
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 13
进行相对表达量分析。
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 32
相对定量解析方法
管家基因
维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、β-actin等。
筛选方法
• 根据文献提供 • 通过具体实验筛选
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 33
主要内容
《RTPCR技术原理》课件
缺点
对操作人员要求较高
RTPCR技术的操作较为复杂，需要经过专 业培训的操作人员才能保证结果的准确性
。
成本较高
RTPCR技术需要昂贵的仪器和试剂 ，导致检测成本较高，可能限制其
在资源有限地区的普及。
A
B
C
D
可能出现交叉污染
在操作过程中，如果样品或试剂受到污染 ，可能会导致交叉污染，影响检测结果的 准确性。
《rtpcr技术原理》ppt课 件
目录 CONTENT
• RTPCR技术概述 • RTPCR技术原理 • RTPCR实验操作流程 • RTPCR技术的优缺点 • RTPCR技术的应用实例
01
RTPCR技术概述
RTPCR技术定义
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号 检测DNA片段的扩增情况，并实时监测其变化的技术。
2000年
ABI公司推出高分辨率熔解曲线分析 技术，提高了SNP分型和突变检测的 准确性。
2004年
基于焦磷酸测序原理的实时荧光定量 PCR技术问世，提高了检测通量和灵 敏度。
RTPCR技术的应用领域
基因表达分析
突变检测
通过比较不同组织或不同处理条件下基因 的表达水平，研究基因的表达调控机制。
用于检测DNA序列中的点突变、插入和缺 失等变异，用于遗传病、肿瘤等疾病的诊 断和监测。
基因突变检测
总结词
RTPCR技术能够高效地检测基因突变，为遗传性疾病的诊断和治疗提供依据。
详细描述
基因突变是许多遗传性疾病的诱因，RTPCR技术通过对特定基因的扩增和荧光 检测，能够快速、准确地检测出基因突变位点及类型。这有助于遗传性疾病的 早期诊断和针对性治疗，为患者提供更好的医疗方案。
荧光定量PCRPPT课件
仪器设备
确保PCR仪、荧光检测器 等设备正常运行，并按照 实验要求进行参数设置。
实验设计
根据研究目的和样本特性， 设计合理的荧光定量PCR 实验方案。
样本处理
样本收集
采集具有代表性的样本， 并妥善保存以备后续实验。
样本处理
将样本进行适当的处理， 如细胞分离、DNA/RNA 提取等，以获得足够的核 酸模板。
荧光信号检测
在PCR循环过程中，实时监测荧光 信号的变化，收集数据以供后续分 析。
结果分析
数据处理
结果应用
对荧光定量PCR实验数据进行处理， 如阈值设定、循环阈值（Ct值）计算 等。
将荧光定量PCR实验结果应用于后续 的研究或实际应用中，如基因表达分 析、病原体检测等。
结果解读
根据实验目的和预期结果，对荧光定 量PCR实验结果进行解读，并评估其 可靠性。
02
该技术利用荧光染料或荧光探针 标记特异性检测目标，通过荧光 信号的累积和检测，实现对目标 序列的实时定量分析。
荧光定量PCR技术的原理
在PCR反应过程中，随着DNA 的合成，荧光染料或荧光探针与
DNA结合，产生荧光信号。
随着DNA的扩增，荧光信号也 相应增强，通过实时监测荧光信 号的变化，可以计算出目标序列
基因突变检测
总结词
荧光定量PCR技术可用于检测基因突变，通过对基因序列的变异进行分析，有助于遗传性疾病的诊断、药物疗效 评估和个性化治疗。
详细描述
荧光定量PCR能够高特异性地检测基因序列的变异，包括点突变、插入和缺失等。通过比较正常组织和病变组织 的基因突变差异，有助于了解疾病的发生和发展机制，为遗传性疾病的诊断和治疗提供依据。同时，基因突变检 测还可用于药物疗效评估和个性化治疗方案的制定。
实时荧光定量PCR简介、结果分析及报告
示温度的不一致性等；
试剂问题：如Taq酶和（或）反转录酶的失活、探针的纯
度及标记效率和核酸提取试剂的效率等；
广西临床检验中心
失控的一般情况
阳性质控或样本失控的预防措施
纯化核酸：但不能完全避免来自标本核酸提取过程中所混入的去垢剂、 有机溶剂的抑制作用；
重复性实验：对临床样本进行重复双份测定，避免由于操作的随机性
广西临床检验中心
对数曲线与线性曲线的转换
对数曲线
线性曲线
广西临床检验中心
数据分析一般流程
曲线分析（Amplification Plot）
检测通道的选择：该步骤主要是由于多色
荧光检测在PCR检测中的应用越来越广泛，
比如含有内标的试剂，内标的检测通道与 目的基因的检测通道不同，因此需根据需 求选择不同的通道进行结果分析。
广西临床检验中心
标准曲线分析
斜率、截距、相关性
广西临床检验中心
数据分析一般流程
标准曲线分析（Standard Curve）
Slope（斜率）：理论值为-3.32。可以从两个方面来分析，首先是标准曲线 的10倍梯度关系，如果梯度正确，斜率数值会比较接近理论值；其次是试剂
的扩增效率，当梯度正确的情况下，扩增效率越高越接近理论值。
• 定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利 用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最 后通过Ct值和标准曲线对未知模板起始浓 度进行定量分析的方法。
广西临床检验中心
TaqMan作用机理
1. 2. 3.
forward primer
5' 3'
每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个单位信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
实时荧光定量PCR技术ppt课件
斜率与扩增效率
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
荧光定量PCR化学原理
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个
2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值：
ΔΔCT= ΔCT（test) - ΔCT（calibrator)
3、计算表达水平比率：
2 –ΔΔCT=表达量的比值
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
平台PCR仪介绍
ABI 7500 fபைடு நூலகம்st
特征：
使用96孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直
观
ABI试剂ROX校正物理方面的误差：枪的误差
（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光
性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性
（如孔间、批间温度的波动）
Rn= Normalization = Reporter / Referenc
基因在不同组织中的表达差异
药物疗效考核
耐药性研究
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
实时荧光定量PCR技术原理ppt课件
样本处理与RNA提取
外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照
逆转录
逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
传统PCR检测
Real-time qPCR
激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
荧光基团
扩增曲线（primary curve）
扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
.
未知
104
103
106
105
102
10
标准曲线 (standard curve)
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
主要内容
Real-time qPCR的定量原理
2
Real-time qPCR的检测方法
3
Real-time qPCR的基本概念
外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照
逆转录
逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
传统PCR检测
Real-time qPCR
激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
荧光基团
扩增曲线（primary curve）
扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
.
未知
104
103
106
105
102
10
标准曲线 (standard curve)
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
主要内容
Real-time qPCR的定量原理
2
Real-time qPCR的检测方法
3
Real-time qPCR的基本概念
实时荧光定量PCR检测的数据处理及结果报告PPT课件
纵坐标为起始拷贝数对数值横坐 标为Ct值时的数学模型
重新重理（4）式 Log YCt = LogX +Ct×Log ( 1+E ) 可得： LogX = -Ct×Log ( 1+E ) + Log YCt (5)
纵坐标为起始拷贝数对数值横坐 标为Ct值时的数学模型
根据Y= AX+B，（5）式中的Y = LogX，X = Ct，A = -Log ( 1+E )，B = Log YCt 从A = -Log ( 1+E )中，可计算PCR反应的扩增效率E = 10-A-1 （6） 如果 A = -0.301，代入（6）式可得：E = 1，即扩增 效率为100%。 如果 A = -0.201，代入（6）式可得：E = 0.589，即 扩增效率为58.9%。 这样可以判断是否需要优化反应条件。此时，斜率A 必≥-0.301。 截距B = Log YCt ，其与阈值线的选定直接相关，应 为Ct值趋向于0时的原始模板拷贝数的对数值。
基本概念
绝对定量（Absolute quantitation） 绝对定量是使用一系列稀释 的已知浓度的标准品与临床标本同时进行测定，根据系列浓度标 准品的Ct值与起始模板（RNA或cDNA）量之间的线性比例关系， 绘制标准曲线。待测标本的浓度则可根据其测定的Ct值，从标准 曲线或回归方程计算得到原始模板的数量。这种方法是假定所有 的标准品和临床标本有相近的扩增效率。系列稀释标准品的浓度 应包含临床标本的浓度范围，并且在实时PCR仪及检测试剂方法 的准确度和线性范围内。 系列稀释的标准品最好是RNA，也可以是双链DNA片段、单链 DNA或载有靶序列的质粒。标准品必须是纯的，与RNA标准品相 比，DNA有相对较好的稳定性、重复性和敏感性，但其与逆转录 没有关系，不能反映逆转录效率。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
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- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利 用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最 后通过Ct值和标准曲线对未知模板起始浓 度进行定量分析的方法。
广西临床检验中心
TaqMan作用机理
1. 2. 3.
forward primer
5' 3'
每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个单位信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
广西临床检验中心
PCR反应过程
• 93 ℃~98 ℃变性：加热使双链DNA变为单链。
• 37 ℃~65 ℃退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交 链 。 • 70 ℃~75 ℃延伸：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以 引物为起始点的延伸反应。
广西临床检验中心
PCR技术原理
循环次数 1 21 DNA的链数 2
示温度的不一致性等；
试剂问题：如Taq酶和（或）反转录酶的失活、探针的纯
度及标记效率和核酸提取试剂的效率等；
广西临床检验中心
失控的一般情况
阳性质控或样本失控的预防措施
纯化核酸：但不能完全避免来自标本核酸提取过程中所混入的去垢剂、 有机溶剂的抑制作用；
重复性实验：对临床样本进行重复双份测定，避免由于操作的随机性
平台期
线性增长期
指数增长期 基线期
阈值线
CT值 扩增曲线线性图谱： 横坐标：扩增循环数（Cycle number）；纵坐标：荧光强度（Delta Rn）。
广西临床检验中心
PCR扩增曲线对数图
平台期 线性扩增期 指数扩增期 基线期
扩增曲线对数图谱： 横坐标：扩增循环数（Cycle number）；纵坐标：荧光强度（Delta Rn）。
而增加。
广西临床检验中心
结果分析时的几个基本概念
基线（Baseline） 阈值线（Threshold） Ct值（Cycle threshold）
广西临床检验中心
基线
• 基线（Baseline）：扩增曲线中的水平部分。
调整原则：如果Ct值>18，不需调整，使用自动分析结果； 如果Ct值<18，修改终点，再分析一次； 起点一般取3~6，终点一般取12~15。
标本间的交叉污染：如在实验过程中，由于操作 不当，或者样本采集不当造成的交叉污染； 产物污染：通常指扩增产物泄漏导致的气溶胶污
染；
试剂污染：如在提取过程中或配制反应液时造成
了试剂污染，从而使得检测结果出现污染；
相关性）。
广西临床检验中心
PCR扩增的数学原理
理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0(1+E)n
n: 扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产无量 X0：初始模板量 E：扩增效率
等式仅在限定的扩增指数增长期成立。超过此时期后， 扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平 台，不再扩增。
数据分析一般流程
定值浓度或Ct值
通过上述步骤分析后，可以得到一个比较
准确的定量结果或Ct值，如果在上述步骤
中没有记录到异常曲线或者情况，则可以 发出正确的报告，对于异常的曲线或者情 况，则需单独分析，确定复检的必要性。
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复检的一般情况-失控
阳性质控或阳性样本的失控
阴性质控或阴性样本的失控
2
3 10 20 30
22
23 210 220 230
4
8 1024 1,048,576 1,073,741,824 10亿
PCR特点：高效扩增、忠实复制
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PCR产物的电泳检测和分析
ladder
PCR fragment
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二、实时荧光定量PCR
(Real time Quantitative PCR)
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数据分析一般流程
数据分析三部曲
曲线分析（Amplification Plot）
标准曲线分析（Standard Curve）
定值浓度或Ct值
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数据分析一般流程
曲线分析（Amplification Plot）
该步骤主要是对扩增曲线进行整体或单个的调整，
主要包括：对数曲线与线性曲线的转换、模板或
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对数曲线与线性曲线的转换
对数曲线
线性曲线
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数据分析一般流程
曲线分析（Amplification Plot）
检测通道的选择：该步骤主要是由于多色
荧光检测在PCR检测中的应用越来越广泛，
比如含有内标的试剂，内标的检测通道与 目的基因的检测通道不同，因此需根据需 求选择不同的通道进行结果分析。
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失控的一般情况
阳性质控或样本失控的一般表现
阳性质控或者样本没有典型的扩增；
阳性质控Ct值或者定值偏差在±2SD之外
阳性质控或者样本扩增曲线异常，不呈典 型的“S”型，如直线倾斜扩增或者折线型；
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失控的一般情况
阳性质控或样本失控的一般原因
核酸提取中的随机误差：如核酸提取过程中的丢失、有机 溶剂的去除不彻底、标本中产生扩增抑制物的残留、所用 耗材存在PCR抑制物等； 仪器问题：如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所
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标准曲线分析
斜率、截距、相关性
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数据分析一般流程
标准曲线分析（Standard Curve）
Slope（斜率）：理论值为-3.32。可以从两个方面来分析，首先是标准曲线 的10倍梯度关系，如果梯度正确，斜率数值会比较接近理论值；其次是试剂
的扩增效率，当梯度正确的情况下，扩增效率越高越接近理论值。
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实时荧光PCR定量原理
k=-1/log(1+E)
Ct
Log C0 上图为外标定量方法原理图。
模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。 标准品与待测样本的扩增效率一致。
Log(浓度)与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作 出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中的起始模板量。
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实时荧光定量PCR简介、结果分析及 报告
广西临床检验中心 周向阳
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PCR技术简介
实时荧光定量PCR技术原理 实时荧光定量PCR结果分析 结果报告的要点分析
3
4
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（PCR：Polymerase Chain Reaction)
一、 多聚酶链式反应
1985年，Kary.B.Mullis教授发明了具有划 时代意义的PCR技术。 1993年， Kary.B.Mullis因该技术的发明而 获得诺贝尔化学奖。
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扩增曲线
S型曲线的四个特征性阶段
线性基线期：指PCR反应处于起始阶段。此阶段，扩增产物很少，所 产生的荧光信号很低，反应了系统背景情况。 指数增长期：指PCR达到其最大的扩增阶段，理想条件下，每一循环 后，PCR产物呈指数倍增加。 线性增长期：指PCR达到稳定的线性扩增阶段，PCR产物呈几何倍数增 加。 平台期：由于原料消耗殆尽，扩增减缓，荧光信号不再随循环数增加
内标检测探针的选择、基线的调整、阈值的设定
等几个方面。
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数据分析一般流程
曲线分析（Amplification Plot）
对数曲线与线性曲线的转换：一般情况下，
我们对实验结果的分析都是在线性曲线基
础上进行的，因此在实验扩增结束后，需 先将对数扩增曲线转换为线性曲线，以便 于后续的分析。
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对数曲线与线性曲线的转换
目的基因：FAM 内标：HEX
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数据分析一般流程
曲线分析（Amplification Plot）
基线的调整：其作用直观反应为曲线基线形状的高低或均 一性变化。通常情况下，选择自动分析，此时仪器会针对 每条曲线进行优化分析，因此效果通常比较好。在基线自 动分析的基础上，如果出现某些形状异常的曲线，则在其 他结果分析完成后，再单独对异常曲线进行手动基线调整 分析。
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数据分析一般流程
曲线分析（Amplification Plot）
手动基线设定原则：1.基线的结束点应在进入线
性期的前几个循环；2.基线开始点应避开反应开
始时不稳定的几个循环；3.基线应选择比较平坦
的区域；4.基线设定以刚好超过正常阴性对照品
扩增曲线的最高点。
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自动基线与手动基线
Intercept（截距）：不同公司的试剂截距有很大的不同，主要是指只有1个 病毒扩增时，曲线出现的Ct值。 R2（线性相关性）：指示本次实验标准品的线性关系。 注：优质试剂的标准品每次实验的参数是比较稳定的，做质控分析后偏差应在 ±2SD范围内，Ct值变异系数应小于10%。
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标准品分析：观察标准品分布是否均匀，梯度是否正常，Ct值是否正
常；
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数据分析一般流程
标准曲线分析（Standard Curve）
该面板主要用于标准曲线参数的分析，通过对曲
线各个参数的统计，可以判断实验定量的准确程
度或者试剂的稳定程度。其主要包括三个参数：
Slope（斜率）、Intercept（截距）和R2（线性
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与普通PCR的区别
普通PCR 实时荧光定量PCR 开管操作、需要后处理、 闭管操作、无需后处理、避 易造成污染，假阳性率高。 免了污染，防止假阳性。 PCR结束后，对终点产物进 行分析，不能定量，重复 性差。 实时监测PCR扩增，在指数扩 增期对起始模板进行定量， 重复性好。