q-pcr结果分析报告
PCR试验报告分析病变异趋势
PCR试验报告分析病变异趋势PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，广泛应用于基因分型、基因表达和病毒检测等领域。
通过PCR试验报告的分析，可以揭示病变的异趋势，为病理诊断和药物治疗提供可靠的依据。
一、PCR试验报告简介PCR试验报告是基于PCR技术进行特定基因序列扩增的结果，通过检测扩增产物的数量变化，可以间接了解样本中病原体的存在与否以及相关基因的表达情况。
PCR试验报告一般包括实验目的、方法、结果和结论等内容。
二、PCR试验报告分析步骤1. 实验目的PCR试验的目的是明确样本中特定基因序列的扩增情况，根据实验目的选择适当的引物和技术参数，确保实验的可靠性和准确性。
2. 实验方法PCR试验方法包括DNA提取、引物设计、试剂配制和扩增条件设置等步骤。
在实验中，需要保证操作规范，避免污染和误操作对结果的影响。
3. 结果分析根据PCR试验的结果，分析扩增产物的带型和浓度。
通过凝胶电泳等方法，可以直观地观察到扩增产物的数量和大小，从而推测样本中相关基因的表达情况以及病变的异趋势。
4. 异趋势分析根据PCR试验报告中的结果，针对病变的特定序列进行异趋势分析。
例如，若扩增产物的带型变浓、变宽或消失，可能说明该基因序列在样本中出现异常变异，与疾病相关。
根据不同疾病的病变特点，可以进一步分析异常变异背后的机制和影响。
5. 结论根据PCR试验报告的分析结果，给出相关结论。
结论应准确客观，不能过于主观或武断，应结合临床和实验观察数据进行综合判断。
三、PCR试验报告分析的意义1. 疾病诊断PCR试验报告能够快速、高效地检测病原体的存在与否，为疾病的早期诊断提供依据。
通过研究病变的异趋势，可以进一步深入分析和了解疾病的发生机制和进展规律。
2. 药物治疗指导PCR试验报告分析可以确定特定基因序列的表达情况，从而指导药物治疗的选择和剂量的调整。
尤其是对于个体化治疗和精准医疗而言，PCR试验报告的分析具有重要的指导意义。
pcr技术实验报告结果分析
pcr技术实验报告结果分析PCR 技术实验报告结果分析PCR 技术，即聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种在分子生物学领域广泛应用的强大工具。
通过这一技术，我们能够在短时间内大量扩增特定的 DNA 片段，从而为各种研究和应用提供了极大的便利。
在本次实验中，我们运用 PCR 技术对特定的基因片段进行了扩增，并对实验结果进行了详细的分析。
一、实验目的本次PCR 实验的主要目的是检测样本中是否存在特定的基因序列，并对其进行定量分析。
二、实验材料与方法（一）实验材料1、样本 DNA：从_____中提取的基因组 DNA。
2、引物：根据目标基因序列设计的特异性引物。
3、 PCR 试剂：包括 DNA 聚合酶、dNTPs、缓冲液等。
（二）实验方法1、 PCR 反应体系的配制：按照试剂说明书，将样本 DNA、引物、PCR 试剂等加入到反应管中，配制成总体积为_____μL 的反应体系。
2、 PCR 反应条件的设置：经过多次预实验优化，确定了以下反应条件：95°C 预变性_____分钟；95°C 变性_____秒，＿____°C 退火_____秒，72°C 延伸_____秒，共进行_____个循环；72°C 终延伸_____分钟。
三、实验结果（一）琼脂糖凝胶电泳结果将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察到了明显的条带。
其中，阳性对照样本显示出了预期大小的条带，而阴性对照样本则没有条带出现。
实验样本中，部分样本出现了与阳性对照相同大小的条带，表明这些样本中存在目标基因序列；而另一些样本则未出现条带，说明其不含目标基因或含量极低。
（二）定量 PCR 结果对于进行定量 PCR 的样本，通过仪器分析得到了每个样本中目标基因的拷贝数。
结果显示，不同样本中目标基因的含量存在显著差异，这可能与样本的来源、处理方式等因素有关。
四、结果分析（一）琼脂糖凝胶电泳结果分析1、阳性对照出现预期条带，说明 PCR 反应体系和反应条件设置正确，实验操作有效。
Q-PCR结果分析
B10 Sample 22 B11 Sample 23 B12 Sample 24 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 standard8 standard7 standard6 standard5 standard4 standard3 Sample 31 Sample 32 Sample 33
A10 Sample 10 A11 Sample 11 A12 Sample 12 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 standard8 standard7 standard6 standard5 standard4 standard3 Sample 19 Sample 20 Sample 21
05/05/2014
Target (°C) 40 Samples
Acquisition Mode None
Hold (hh:mm:ss) 00:00:30
Ramp Rate (°C/s) 2.20
Acquisitions (per °C)
Sec Target (°C) 0
Step size (°C) 0
anammox nir2 wzb
Samples Sample Count 96 Subset All Samples Pos D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 G1 G2 G3 Name Sample 37 Sample 38 Sample 39 Sample 40 Sample 41 Sample 42 Sample 43 Sample 44 Sample 45 Sample 46 Sample 47 Sample 48 wbt wbc ztt ztc nbt nbc Sample 55 Sample 56 Sample 57 Sample 58 Sample 59 Sample 60 wbt wbc ztt ztc nbt nbc Sample 67 Sample 68 Sample 69 Sample 70 Sample 71 Sample 72 wbt wbc ztt 05/05/2014 E1 E2 E3 Page 3 of 8 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E1 E2 E3 E4 E5 E6 ID Repl. Of Sample Notes
Q-PCR实验技术
体系1
体系2
保证引物终浓度是0.1-0.5uM.
实验步骤——点样
GAPDH-Con GAPDH-Con GAPDH-Con GAPDH-Con GAPDH-si-A GAPDH-si-A GAPDH-si-A GAPDH-si-A GeneA-Con GeneA-Con GeneA-Con GeneA-Con GeneA-si-A GeneA-si-A GeneA-si-A GeneA-si-A
谢谢观看
Thank you
简介
它是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程， 使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA) 的起始浓度进行定量。 在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异DNA （RNA）起始量存在相关性，从而实现定量检测。 Q-PCR的仪器由实时定量 PCR 仪、实时荧光定量试剂、通用电脑和自动分析软件 几部分组成。
体积
4ul 1ul 试剂1 试剂2
备注
试剂2最后加入oligo T primer (50nm×1)
random 6:mers (100nm×1) trizol RNA
1ul
1ul Xul
试剂3
试剂4
Rnase free H2O
13-Xul
试剂5
实验步骤——样品准备
Q-PCR： 逆转录结束后，将引物、SYGreen、DEPC放于冰盒中。 配置体系： SYGreen 5ul E1(引物R) 0.3ul E2(引物F) 0.3ul 模板 0.6ul DEPC水 3.8ul
Part.2
实验原理
实验原理
定量原理 :实时荧光定量 PCR 是在反应体系中加入荧光基团 ,使产物 的数量与检测到的荧光强度成线性关系 ,从而得出产物的扩增曲线。
Q-PCR重复性
实验的时候常常面临一个问题：重复性。
那么如何才能做好样品之间的重复，在实验过程中我们要注意那么方面，下面展开讨论。
1：合格重复性重复性标准为：3个重复样品的任何两个样品CT值之差不能大于0.5。
举例如下：重复样品 1 2 3合格CT 18.49 18.56 18.32不合格CT 18.03 18.79 18.7218.79－18.03=0.76＞0.5 因为重复2－重复1＞0.5，所以三个重复不合格，需要重做。
2：做好重复性流程假设做1个目的基因9个样品，操作步骤如下：2.1 为了得到良好重复性我们可以每个样品做4个重复，这样假如4个里面有一个不好，还有合格的3个重复数据，另外这样做还可以避免反应过程中的边缘效应。
2.2 先配制混合液。
实验过程体系如下：PCR反应体系1×SYBY MIX 5µLPrimer F/R(5P) 0.5µLDNA 2 µLddH2O 2 µlTotal 10µL注意：在配置混合液的过程中一般每9个反应，多加一个。
模板DNA需要单独加入9个样品，每个样品4个重复。
理论需要配制36个反应液，我们实际需要配制40个反应体系反应总体系如下：PCR反应体系SYBY MIX 200µLPrimer F/R(5P) 20µLDNA 2 µLddH2O 80µL2.3 配制好混合液后放进4℃备用2.4 拿出5排八连管（或者PCR反应板）操作必须在冰上进行。
（可以根据情况购买反应冰盒或者自行制备）加模板（模板必须完全相同，不能为相同样品，放在不同管中）必须用同一个枪头加4个重复。
（也就是说只需要用9个枪头）模板要加到反应管的底部，并且不要产生气泡。
2.5 加完模板后，用一个枪头加反应液。
反应液要加在反应孔壁上，这个时候如果是好的反应耗材，可以明显的看到液体顺着管壁流下，不会有任何残留。
（只需要一个枪头）当然此过程中如果感觉枪头使用次数过多造成了稍许的挂壁现象，可以更换，但必须保证4个重复不更换枪头。
临床荧光PCR结果分析及常见问题
临床荧光PCR结果分析及常见问题临床荧光PCR技术是一种在临床实验室中常用的分子生物学技术，其通过特定荧光探针来检测靶DNA序列的存在与否。
本文将介绍临床荧光PCR结果的分析及常见问题，希望能为读者提供有益的信息。
一、荧光PCR结果分析在进行临床荧光PCR实验后，我们需要对结果进行分析以确定目标DNA序列的存在与否。
以下是一些常见的结果分析步骤：1. 结果判读通过荧光信号的强弱和峰值出现的时间，我们可以初步判断目标DNA序列是否存在。
正常情况下，目标序列存在的样本中，荧光信号会在特定的循环数内出现，信号的强度也会相应增加。
2. 阈值设定设置一个适当的阈值，通常为信号强度的百分比。
我们可以根据阈值来确定一个样本是阳性还是阴性。
当信号超过阈值时，我们判定该样本为阳性；反之则为阴性。
3. 确定循环阈值（CT值）循环阈值（CT值）是指荧光信号达到阈值所需的循环数。
CT值的大小可以反映样本中目标DNA序列的丰度。
一般来说，CT值越小，说明目标DNA序列的初始数量越高。
4. 结果解读通过对不同样本的CT值进行比较，我们可以对实验结果进行解读。
例如，CT值较小的样本表示目标DNA序列的存在量较高，而CT值较大的样本说明目标序列的存在量较低。
二、常见问题及解决方法在临床荧光PCR实验中，也存在一些常见问题会对结果产生影响，下面是一些常见问题的解决方法：1. 假阳性结果假阳性结果是指在实验中，实际上目标DNA序列不存在，但荧光信号却超过阈值，被误判为阳性。
这可能是由于试剂或样本污染、非特异性引物或探针选择不当等原因引起的。
为避免假阳性结果，我们需要仔细选择试剂和探针，控制好实验操作的严密性。
2. 假阴性结果假阴性结果是指在实验中，目标DNA序列实际存在，但荧光信号未超过阈值，被误判为阴性。
这可能是由于试剂浓度不足、PCR条件不合适等原因造成的。
为避免假阴性结果，我们需确保试剂充足且质量良好，并进行PCR反应的优化。
实时荧光定量PCR的数据分析方法
实时荧光定量PCR的数据分析方法
作者：易健明， 屈武斌， 张成岗， YI Jian-Ming， QU Wu-Bin， ZHANG Cheng-Gang
作者单位：易健明,张成岗,YI Jian-Ming,ZHANG Cheng-Gang(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,全军军事认知与心理卫生研究中心,北京100850;安徽医科大学研究生院,安徽合肥230032)
， 屈武斌,QU Wu-Bin(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,全军军事认知
与心理卫生研究中心,北京100850)
刊名：
生物技术通讯
英文刊名：Letters in Biotechnology
年，卷(期)：2015,26(1)
引用本文格式：易健明.屈武斌.张成岗.YI Jian-Ming.QU Wu-Bin.ZHANG Cheng-Gang实时荧光定量PCR的数据分析方法[期刊论文]-生物技术通讯 2015(1)。
PCR实验及结果分析
PCR实验及结果分析PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种核酸扩增技术，可以在短时间内高效地扩增特定DNA片段。
PCR广泛应用于生物医学研究、基因工程、犯罪学和医学诊断等领域。
以下将对PCR实验和结果分析进行详细说明。
在变性步骤中，将待扩增的DNA样本加热至95℃，将其双链DNA解旋形成两个单链模板。
该步骤通常需要持续2-5分钟。
接下来是引物结合步骤。
引物是一小段特异性的DNA序列，它们与待扩增片段的两端互补配对。
引物以大量过剩的形式加入反应体系中，使其结合到单链DNA模板的两端。
这一步骤通常在55-65℃温度下进行，并需要持续1-5分钟。
最后是延伸步骤。
在这一步骤中，通过加入DNA聚合酶和四种核苷酸（dNTPs），使DNA引物延伸成为一个新的DNA链。
DNA聚合酶可以在适度的温度（通常是72℃）下与DNA模板结合，并从引物的3'端开始向5'端延伸。
这一步骤的持续时间取决于待扩增片段的长度，通常为1-5分钟。
在PCR实验中，使用的重要试剂包括DNA模板、引物、DNA聚合酶、MgCl2和dNTPs等。
同时，设定合适的反应体系和温度条件也是实验的关键。
在PCR实验完成后，扩增产物将进行凝胶电泳分析，以确定DNA是否成功扩增以及扩增产物大小。
凝胶电泳是一种常用的分离和检测DNA分子的方法。
在该方法中，将PCR反应产物与DNA分子标准一同加载到琼脂糖凝胶的孔中，并施加电压使DNA在凝胶中迁移。
由于DNA分子被凝胶阻挡，迁移速度取决于DNA分子的大小，因此可以根据迁移距离来确定扩增产物的大小。
电泳结束后，使用溴化乙锭等荧光染料染色。
荧光染料可以与DNA分子结合，在紫外线照射下产生荧光，以便于直观地观察扩增产物。
通过与DNA分子标准进行比较，可以确定PCR扩增产物的大小。
根据PCR扩增的结果，可以得出以下几个结论：首先，如果扩增产物呈现出预期大小的条带，则说明PCR反应成功。
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摘要：现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。
绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。
2－△△CT方法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。
本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。
另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。
关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。
实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。
实时定量 PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。
绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。
绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。
通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道（6 - 9 ），包括已发表的两篇研究论文（10,11 ）。
在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。
显然，我们说 X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。
用实时PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。
2－△△CT方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化：2－△△CT公式的推导，以及实验设计，有效性评估在Appl ied Biosystems User Bulletin No.2（P/N4303859）中有介绍。
用2－△△CT方法分析基因表达数据在文献中也有报道（5,6）。
本文介绍了该方法的推导、假设以及应用。
另外，本文还介绍了2－△△CT两种衍生方法的推导和应用，它们在实时定量PCR 数据分析中都可能被用到。
1. 2－△△CT方法1.1. 2－△△CT方法的推导PCR 指数扩增的公式是：这里，X n 是第 n 个循环後目标分子数，X0 是初始目标分子数，E x 是目标分子扩增效率，n 是循环数，C T 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。
因此：X T是目标分子达到设定的阈值时的分子数。
C T,X是目标分子扩增达到阈值时的循环数。
K x 是一个常数。
对于内参反应而言，也有同样的公式：用X T 除以R T 得到：对于使用 Taqman 探针的实时扩增而言， X T和 R T 的值由一系列因素决定：包括探针所带的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。
因此常数K 并不一定等于1 。
假设目标序列与内参序列扩增效率相同：或：X N 代表经过均一化处理过的初始目标分子量；△C T表示目标基因和内标基因C T值的差异（C T,X－C T,R ）整理上式得：最后用任一样本q 的X N除以参照因子（calibrator, cb）的X N得到：在这里对于一个少于150bp 的扩增片断而言，如果 Mg2+ 浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于1 。
因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是1.2. 2－△△CT方法的假设和应用要使△△CT计算方法有效，目标序列和内参序列的扩增效率必须相等。
看两个反应是否具有相同的扩增效率的方法是看他们模板浓度梯度稀释後扩增产物△CT如何变化。
图1 显示的是 cDNA 样品在 100 倍稀释范围内的实验结果。
对于每一个稀释样本，都用GAPDH 和c -myc 特异的荧光探针及引物进行扩增。
计算出c-myc 和 GAPDH 的平均C T值以及△C T值，通过cDNA 浓度梯度的log值对△C T值作图，如果所得直线斜率绝对值接近于0，说明目标基因和内标基因的扩增效率相同，就可以通过△△CT方法进行相对定量。
在图1中，直线斜率是0.047，因而假设成立，△△CT方法可以用来分析数据。
如果两个扩增反应效率不同，则需要通过定量标准曲线和绝对定量的方法来进行相对定量；或者也可以重新设计引物，优化反应条件使得目标序列和内参序列具有相同的扩增效率。
1.3. 2－△△CT内标和参照因子的选择使用内标基因的目的是为了对加入到反转录反应中的RNA 进行均一化处理。
标准的看家基因一般都可被用作内标基因。
适合于实时 PCR 反应内标基因包括GAPDH，β -actin，β2-microglobulin 以及rRN A 。
当然，其它的看家基因也同样能被用作内标。
我们推荐在应用某一基因作为内标之前首先确证该基因的表达不会受实验处理的影响。
验证实验处理是否对内标基因表达产生影响的方法在2.2 部分有描述。
2－△△CT方法中参照因子的选择决定于基因表达定量实验的类型。
最简单的设计就是把未经处理的样品作为参照因子（calibrator ）。
经内标基因均一化处理後，通过方法计算，目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于未经处理的样本的倍数来表示。
对于未经处理的参照样，△△C T=0，而20=1。
所以根据定义，未处理样本的倍数变化为1 。
而对于那些经过处理的样本，相对于参考因子基因表达的倍数为2－△△CT。
同样的分析也可用于不同时相的基因表达差异，在这种情况下，一般选0 时刻的样本作为参照因子。
有些情况下，并不是比较不同处理样本基因表达差异。
例如，有的是想看某一器官中特定 mRNA 的表达。
在这种情况下，参照因子可能是另一器官中该 mRNA 的表达。
表1显示了大脑和肾脏总RNA 中c-m yc 和GAPDH 转录本的CT 值。
在这一个例子中，大脑被人为的选择为参照因子，通过计算得到肾脏c-myc 表达量经GAPDH 校正後相对于大脑的表达量的结果。
尽管相对定量方法可用于这种组织之间的比较，但结果的生物学解释是相当复杂的。
不同种类细胞中目标和参照转录本单一的相对量变化可能在任何特定的组织中都存在。
1.4. 2－△△CT方法的数据分析实时定量PCR所得到CT值可以很容易的输出到表格程序如Microsoft Excel中去。
为了显示数据分析过程，我们在这里给出了一个基因表达定量的实验数据和样本列表。
通过β-actin 均一化处理，我们对目标基因fos-glo-myc 的表达变化进行了监测。
在8h 的时间范围内，在每一时间点都取3 个重复样本，每一样本在cDNA 合成之後都做定量PCR ，数据分析用到了公式9，即：Time x 表示任意时间点，Time 0表示经β -actin 校正后1 倍量的目标基因表达。
0 时刻目标基因和内标基因的平均C T（见图2 第8 栏）被用于公式9 中。
通过公式9 计算出每一个样本目标基因表达通过β -actin 均一化处理後相对于0 时刻的倍数（见图2 第9 栏）。
平均SD，CV 由每一个时间点所取的三个重复样求得。
用这种分析方法，在0 时刻的平均倍数变化接近于1。
我们发现通过检测在 0 时刻平均倍数变化是否为1 可以很方便的验证三个重复样品之间是否有错误或者误差。
如果得到的结果与1偏差很大，则表明存在计算错误或者是很高的实验误差。
在前面的例子中，在每一时间点上分别取了三个独立的 RNA 样本进行了分析。
因此对每一个样本分别处理，通过计算後取结果的平均值就非常重要。
如果是同一样本进行 PCR 扩增的重复，这就需要首先求出平均CT，然後再进行计算。
怎么样计算平均值就要看目标基因和内参基因是在同一个管子中扩增还是在不同的管子中扩增。
表 1 给出了目标基因（c- myc ）和内参基因（GAPDH ）在不同管中扩增的实验数据。
在这里不应该把任一单个的 c-myc 管子和 GAPDH 管子作比较，而应该分别计算出 c-myc 和 GAPDH 的平均C T来计算△C T。
重复实验中C T值的估计偏差通过标准的指数计算转化成最後结果中相对量的变化。
但其中的一个难点是 C T值与相应的拷贝数成指数关系（见第4 部分），因此，在最後的计算中，的误差通过△△C T 加上标准偏差和△△C T减去标准偏差来评估，这就使得求得的数值相对于平均值呈不对称分布。
不对称分布是因为结果经指数处理後转化成量的线性比较造成的。
通过不同荧光染料标记的探针，我们可以在同一管中同时扩增目标序列和内标序列。
表2 给出了目标基因（c- myc）和内标基因（GAPDH）在同一管中扩增的实验数据。
对于任意一个管子，目标基因（c- myc）和内参基因（GAPDH）扩增时加入的cDNA 量都是一样多的，所以可以分别对每个管子计算△C T值，这些值取平均后再进行计算。
在这里估计误差值也是一个不对称的范围，反映了误差经指数处理转化为线性差异。
在表1 和表2 中，估计误差在从△C T 到△△C T 的计算中未见有增加，这是因为我们把参照基因和检测基因的误差都显示出来了。
我们把△CT，cb 当作一个人为设定的常数来减去，得到△△CT 。
这样得到的结果就与图 2 所显示的在求平均之前对不同重复样本分别通过各自的CT 值求实所得结果相当。
另一种方法是将参照基因当作没有任何误差的1倍的量，在这种情况下，平均△C T,cb 的误差值被引入到每一样本的△△C T中。
在表1中，肾脏中△△C T变成- 2.50±0.20 而经过校正的c-myc 量是5.6 倍，范围从4.9 到 5.6 。
而在大脑中的结果是没有误差的1倍。
2. 2－△Cf方法2.1. 2－△Cf方法的推导通过内标RNA 可以对加入 RNA 的量的差异进行校正。
2－△△CT方法的数据分析的一个特点就是能够利用实时PCR 实验的一部分数据来完成这种校正。
在其它的方法不能定量初始 RNA 量的时候：例如，在能得到的 RNA 量非常有限的时候或者需要处理高通量的样品的时候，这一方法的优势就格外明显。
当然我们也可以利用PCR 实验以外的方法来完成这种校正。
最常用的一种方法就是用紫外吸收来确定用于cDNA 合成的RNA 量，然後将相同的RNA 反转录产生的cDNA 用于PCR 定量反应。
这种外标法校正的一个应用例子就是研究某种实验处理是否影响内标基因的表达。
在这里，目标基因和内标合二为一。
在这个例子中，公式[2] 不被公式[3] 除，公式[5 ]变成：整理得：任一样品X0,q 除以参照品X0,cb 得：在这里△ C'T=C T,q-C T,cb 。
△C’T与前面计算中用的△C T（用目标基因C T值减去参照基因C T值）相互区别。