q-pcr结果分析报告
PCR试验报告分析病变异趋势
PCR试验报告分析病变异趋势PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，广泛应用于基因分型、基因表达和病毒检测等领域。
通过PCR试验报告的分析，可以揭示病变的异趋势，为病理诊断和药物治疗提供可靠的依据。
一、PCR试验报告简介PCR试验报告是基于PCR技术进行特定基因序列扩增的结果，通过检测扩增产物的数量变化，可以间接了解样本中病原体的存在与否以及相关基因的表达情况。
PCR试验报告一般包括实验目的、方法、结果和结论等内容。
二、PCR试验报告分析步骤1. 实验目的PCR试验的目的是明确样本中特定基因序列的扩增情况，根据实验目的选择适当的引物和技术参数，确保实验的可靠性和准确性。
2. 实验方法PCR试验方法包括DNA提取、引物设计、试剂配制和扩增条件设置等步骤。
在实验中，需要保证操作规范，避免污染和误操作对结果的影响。
3. 结果分析根据PCR试验的结果，分析扩增产物的带型和浓度。
通过凝胶电泳等方法，可以直观地观察到扩增产物的数量和大小，从而推测样本中相关基因的表达情况以及病变的异趋势。
4. 异趋势分析根据PCR试验报告中的结果，针对病变的特定序列进行异趋势分析。
例如，若扩增产物的带型变浓、变宽或消失，可能说明该基因序列在样本中出现异常变异，与疾病相关。
根据不同疾病的病变特点，可以进一步分析异常变异背后的机制和影响。
5. 结论根据PCR试验报告的分析结果，给出相关结论。
结论应准确客观，不能过于主观或武断，应结合临床和实验观察数据进行综合判断。
三、PCR试验报告分析的意义1. 疾病诊断PCR试验报告能够快速、高效地检测病原体的存在与否，为疾病的早期诊断提供依据。
通过研究病变的异趋势，可以进一步深入分析和了解疾病的发生机制和进展规律。
2. 药物治疗指导PCR试验报告分析可以确定特定基因序列的表达情况，从而指导药物治疗的选择和剂量的调整。
尤其是对于个体化治疗和精准医疗而言，PCR试验报告的分析具有重要的指导意义。
pcr技术实验报告结果分析
pcr技术实验报告结果分析PCR 技术实验报告结果分析PCR 技术，即聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种在分子生物学领域广泛应用的强大工具。
通过这一技术，我们能够在短时间内大量扩增特定的 DNA 片段，从而为各种研究和应用提供了极大的便利。
在本次实验中，我们运用 PCR 技术对特定的基因片段进行了扩增，并对实验结果进行了详细的分析。
一、实验目的本次PCR 实验的主要目的是检测样本中是否存在特定的基因序列，并对其进行定量分析。
二、实验材料与方法（一）实验材料1、样本 DNA：从_____中提取的基因组 DNA。
2、引物：根据目标基因序列设计的特异性引物。
3、 PCR 试剂：包括 DNA 聚合酶、dNTPs、缓冲液等。
（二）实验方法1、 PCR 反应体系的配制：按照试剂说明书，将样本 DNA、引物、PCR 试剂等加入到反应管中，配制成总体积为_____μL 的反应体系。
2、 PCR 反应条件的设置：经过多次预实验优化，确定了以下反应条件：95°C 预变性_____分钟；95°C 变性_____秒，＿____°C 退火_____秒，72°C 延伸_____秒，共进行_____个循环；72°C 终延伸_____分钟。
三、实验结果（一）琼脂糖凝胶电泳结果将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察到了明显的条带。
其中，阳性对照样本显示出了预期大小的条带，而阴性对照样本则没有条带出现。
实验样本中，部分样本出现了与阳性对照相同大小的条带，表明这些样本中存在目标基因序列；而另一些样本则未出现条带，说明其不含目标基因或含量极低。
（二）定量 PCR 结果对于进行定量 PCR 的样本，通过仪器分析得到了每个样本中目标基因的拷贝数。
结果显示，不同样本中目标基因的含量存在显著差异，这可能与样本的来源、处理方式等因素有关。
四、结果分析（一）琼脂糖凝胶电泳结果分析1、阳性对照出现预期条带，说明 PCR 反应体系和反应条件设置正确，实验操作有效。
Q-PCR结果分析
B10 Sample 22 B11 Sample 23 B12 Sample 24 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 standard8 standard7 standard6 standard5 standard4 standard3 Sample 31 Sample 32 Sample 33
A10 Sample 10 A11 Sample 11 A12 Sample 12 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 standard8 standard7 standard6 standard5 standard4 standard3 Sample 19 Sample 20 Sample 21
05/05/2014
Target (°C) 40 Samples
Acquisition Mode None
Hold (hh:mm:ss) 00:00:30
Ramp Rate (°C/s) 2.20
Acquisitions (per °C)
Sec Target (°C) 0
Step size (°C) 0
anammox nir2 wzb
Samples Sample Count 96 Subset All Samples Pos D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 G1 G2 G3 Name Sample 37 Sample 38 Sample 39 Sample 40 Sample 41 Sample 42 Sample 43 Sample 44 Sample 45 Sample 46 Sample 47 Sample 48 wbt wbc ztt ztc nbt nbc Sample 55 Sample 56 Sample 57 Sample 58 Sample 59 Sample 60 wbt wbc ztt ztc nbt nbc Sample 67 Sample 68 Sample 69 Sample 70 Sample 71 Sample 72 wbt wbc ztt 05/05/2014 E1 E2 E3 Page 3 of 8 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E1 E2 E3 E4 E5 E6 ID Repl. Of Sample Notes
Q-PCR实验技术
体系1
体系2
保证引物终浓度是0.1-0.5uM.
实验步骤——点样
GAPDH-Con GAPDH-Con GAPDH-Con GAPDH-Con GAPDH-si-A GAPDH-si-A GAPDH-si-A GAPDH-si-A GeneA-Con GeneA-Con GeneA-Con GeneA-Con GeneA-si-A GeneA-si-A GeneA-si-A GeneA-si-A
谢谢观看
Thank you
简介
它是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程， 使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA) 的起始浓度进行定量。 在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异DNA （RNA）起始量存在相关性，从而实现定量检测。 Q-PCR的仪器由实时定量 PCR 仪、实时荧光定量试剂、通用电脑和自动分析软件 几部分组成。
体积
4ul 1ul 试剂1 试剂2
备注
试剂2最后加入oligo T primer (50nm×1)
random 6:mers (100nm×1) trizol RNA
1ul
1ul Xul
试剂3
试剂4
Rnase free H2O
13-Xul
试剂5
实验步骤——样品准备
Q-PCR： 逆转录结束后，将引物、SYGreen、DEPC放于冰盒中。 配置体系： SYGreen 5ul E1(引物R) 0.3ul E2(引物F) 0.3ul 模板 0.6ul DEPC水 3.8ul
Part.2
实验原理
实验原理
定量原理 :实时荧光定量 PCR 是在反应体系中加入荧光基团 ,使产物 的数量与检测到的荧光强度成线性关系 ,从而得出产物的扩增曲线。
Q-PCR重复性
实验的时候常常面临一个问题：重复性。
那么如何才能做好样品之间的重复，在实验过程中我们要注意那么方面，下面展开讨论。
1：合格重复性重复性标准为：3个重复样品的任何两个样品CT值之差不能大于0.5。
举例如下：重复样品 1 2 3合格CT 18.49 18.56 18.32不合格CT 18.03 18.79 18.7218.79－18.03=0.76＞0.5 因为重复2－重复1＞0.5，所以三个重复不合格，需要重做。
2：做好重复性流程假设做1个目的基因9个样品，操作步骤如下：2.1 为了得到良好重复性我们可以每个样品做4个重复，这样假如4个里面有一个不好，还有合格的3个重复数据，另外这样做还可以避免反应过程中的边缘效应。
2.2 先配制混合液。
实验过程体系如下：PCR反应体系1×SYBY MIX 5µLPrimer F/R(5P) 0.5µLDNA 2 µLddH2O 2 µlTotal 10µL注意：在配置混合液的过程中一般每9个反应，多加一个。
模板DNA需要单独加入9个样品，每个样品4个重复。
理论需要配制36个反应液，我们实际需要配制40个反应体系反应总体系如下：PCR反应体系SYBY MIX 200µLPrimer F/R(5P) 20µLDNA 2 µLddH2O 80µL2.3 配制好混合液后放进4℃备用2.4 拿出5排八连管（或者PCR反应板）操作必须在冰上进行。
（可以根据情况购买反应冰盒或者自行制备）加模板（模板必须完全相同，不能为相同样品，放在不同管中）必须用同一个枪头加4个重复。
（也就是说只需要用9个枪头）模板要加到反应管的底部，并且不要产生气泡。
2.5 加完模板后，用一个枪头加反应液。
反应液要加在反应孔壁上，这个时候如果是好的反应耗材，可以明显的看到液体顺着管壁流下，不会有任何残留。
（只需要一个枪头）当然此过程中如果感觉枪头使用次数过多造成了稍许的挂壁现象，可以更换，但必须保证4个重复不更换枪头。
临床荧光PCR结果分析及常见问题
临床荧光PCR结果分析及常见问题临床荧光PCR技术是一种在临床实验室中常用的分子生物学技术，其通过特定荧光探针来检测靶DNA序列的存在与否。
本文将介绍临床荧光PCR结果的分析及常见问题，希望能为读者提供有益的信息。
一、荧光PCR结果分析在进行临床荧光PCR实验后，我们需要对结果进行分析以确定目标DNA序列的存在与否。
以下是一些常见的结果分析步骤：1. 结果判读通过荧光信号的强弱和峰值出现的时间，我们可以初步判断目标DNA序列是否存在。
正常情况下，目标序列存在的样本中，荧光信号会在特定的循环数内出现，信号的强度也会相应增加。
2. 阈值设定设置一个适当的阈值，通常为信号强度的百分比。
我们可以根据阈值来确定一个样本是阳性还是阴性。
当信号超过阈值时，我们判定该样本为阳性；反之则为阴性。
3. 确定循环阈值（CT值）循环阈值（CT值）是指荧光信号达到阈值所需的循环数。
CT值的大小可以反映样本中目标DNA序列的丰度。
一般来说，CT值越小，说明目标DNA序列的初始数量越高。
4. 结果解读通过对不同样本的CT值进行比较，我们可以对实验结果进行解读。
例如，CT值较小的样本表示目标DNA序列的存在量较高，而CT值较大的样本说明目标序列的存在量较低。
二、常见问题及解决方法在临床荧光PCR实验中，也存在一些常见问题会对结果产生影响，下面是一些常见问题的解决方法：1. 假阳性结果假阳性结果是指在实验中，实际上目标DNA序列不存在，但荧光信号却超过阈值，被误判为阳性。
这可能是由于试剂或样本污染、非特异性引物或探针选择不当等原因引起的。
为避免假阳性结果，我们需要仔细选择试剂和探针，控制好实验操作的严密性。
2. 假阴性结果假阴性结果是指在实验中，目标DNA序列实际存在，但荧光信号未超过阈值，被误判为阴性。
这可能是由于试剂浓度不足、PCR条件不合适等原因造成的。
为避免假阴性结果，我们需确保试剂充足且质量良好，并进行PCR反应的优化。
实时荧光定量PCR的数据分析方法
实时荧光定量PCR的数据分析方法
作者：易健明， 屈武斌， 张成岗， YI Jian-Ming， QU Wu-Bin， ZHANG Cheng-Gang
作者单位：易健明,张成岗,YI Jian-Ming,ZHANG Cheng-Gang(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,全军军事认知与心理卫生研究中心,北京100850;安徽医科大学研究生院,安徽合肥230032)
， 屈武斌,QU Wu-Bin(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,全军军事认知
与心理卫生研究中心,北京100850)
刊名：
生物技术通讯
英文刊名：Letters in Biotechnology
年，卷(期)：2015,26(1)
引用本文格式：易健明.屈武斌.张成岗.YI Jian-Ming.QU Wu-Bin.ZHANG Cheng-Gang实时荧光定量PCR的数据分析方法[期刊论文]-生物技术通讯 2015(1)。
PCR实验及结果分析
PCR实验及结果分析PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种核酸扩增技术，可以在短时间内高效地扩增特定DNA片段。
PCR广泛应用于生物医学研究、基因工程、犯罪学和医学诊断等领域。
以下将对PCR实验和结果分析进行详细说明。
在变性步骤中，将待扩增的DNA样本加热至95℃，将其双链DNA解旋形成两个单链模板。
该步骤通常需要持续2-5分钟。
接下来是引物结合步骤。
引物是一小段特异性的DNA序列，它们与待扩增片段的两端互补配对。
引物以大量过剩的形式加入反应体系中，使其结合到单链DNA模板的两端。
这一步骤通常在55-65℃温度下进行，并需要持续1-5分钟。
最后是延伸步骤。
在这一步骤中，通过加入DNA聚合酶和四种核苷酸（dNTPs），使DNA引物延伸成为一个新的DNA链。
DNA聚合酶可以在适度的温度（通常是72℃）下与DNA模板结合，并从引物的3'端开始向5'端延伸。
这一步骤的持续时间取决于待扩增片段的长度，通常为1-5分钟。
在PCR实验中，使用的重要试剂包括DNA模板、引物、DNA聚合酶、MgCl2和dNTPs等。
同时，设定合适的反应体系和温度条件也是实验的关键。
在PCR实验完成后，扩增产物将进行凝胶电泳分析，以确定DNA是否成功扩增以及扩增产物大小。
凝胶电泳是一种常用的分离和检测DNA分子的方法。
在该方法中，将PCR反应产物与DNA分子标准一同加载到琼脂糖凝胶的孔中，并施加电压使DNA在凝胶中迁移。
由于DNA分子被凝胶阻挡，迁移速度取决于DNA分子的大小，因此可以根据迁移距离来确定扩增产物的大小。
电泳结束后，使用溴化乙锭等荧光染料染色。
荧光染料可以与DNA分子结合，在紫外线照射下产生荧光，以便于直观地观察扩增产物。
通过与DNA分子标准进行比较，可以确定PCR扩增产物的大小。
根据PCR扩增的结果，可以得出以下几个结论：首先，如果扩增产物呈现出预期大小的条带，则说明PCR反应成功。
实时荧光定量PCR检测的数据处理及结果报告
实时荧光PCR外标绝对定量的数 学模型
在实时荧光PCR 中，每个模板的 Ct值与该模板的 起始拷贝数的对 数存在线性关系， 起始拷贝数越多， Ct值越小。
实时荧光PCR外标绝对定量的数 学模型
利用已知起始拷贝 数的外部标准品可 做出标准曲线，在 现有实时荧光PCR 中，大部分以纵坐 标为Ct值，横坐标 为起始拷贝数，少 部分以纵坐标为起 始拷贝数，横坐标 为Ct值。
纵坐标为起始拷贝数对数值横坐 标为Ct值时的数学模型
重新重理（4）式 Log YCt = LogX +Ct×Log ( 1+E ) 可得： LogX = -Ct×Log ( 1+E ) + Log YCt (5)
纵坐标为起始拷贝数对数值横坐 标为Ct值时的数学模型
根据Y= AX+B，（5）式中的Y = LogX，X = Ct，A = -Log ( 1+E )，B = Log YCt 从A = -Log ( 1+E )中，可计算PCR反应的扩增效率E = 10-A-1 （6） 如果 A = -0.301，代入（6）式可得：E = 1，即扩增 效率为100%。 如果 A = -0.201，代入（6）式可得：E = 0.589，即 扩增效率为58.9%。 这样可以判断是否需要优化反应条件。此时，斜率A 必≥-0.301。 截距B = Log YCt ，其与阈值线的选定直接相关，应 为Ct值趋向于0时的原始模板拷贝数的对数值。
实时荧光PCR外标绝对定量的数 学模型
只要获得未知标 本的Ct值，即可 从标准曲线上计 算出该标本的起 始拷贝数，这是 采用外标进行实 时荧光PC+E )n (1) 其中，Yn 为第n个循环后扩增产物的量，X为原模板数，E为 扩增效率，n为扩增循环数。 在扩增达到阈值线时，此时，n = Ct，于是，扩增产物的量为： YCt = X ( 1+E )Ct (2) YCt 为荧光信号达到阈值强度时扩增产物的量。在阈值线设 定以后，它就是一个常数。（2）式两边同时取对数，得： Log YCt = LogX ( 1+E )Ct (3) 亦即：Log YCt = LogX +Ct×Log ( 1+E ) （4）
Q-PCR讲解
实验设计
数据分析
32
对照设置
33
对照设置
阴性对照
–Negative control: No template (NTC)
• Use: 检验是否有模板污染 –No reverse transcriptase (NRT): • Use: 检验RNA样品中是否有DNA污染 –No amplification control (NAC): • Use: 检验是否有聚合酶污染 –No probe control (NPC): • Use: 检验荧光污染 –Buffer: Only contains buffer • Use: 检验背景荧光
35
定量方式选择
• SYBR Green适用
-特异性要求不是特别高的反应，分子数（拷贝数）超过1000的反应 -探针实验前，进行预实验 -PCR条件非常成熟，无二聚体，无非特异扩增
• TaqMan适用
-特异性要求较高的实验
-多重PCR（标记不同的荧光基团）
-SNP -灵敏度要求较高的实验
36
标准曲线法和∆∆Ct法
2
qPCR基本概念
3
常规PCR与实时荧光定量PCR
• 常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定 性分析 • 实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测 PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终对起 始模板进行精确的定量分析
4
荧光定量PCR仪器工作原理
• 激发光发射源
25
相对定量内参基因选择
内参基因的作用
检测样本材料中RNA是否降解 纠正样本加样的差异 校正cDNA合成速率差异 校正PCR抑制剂的影响
常用内参基因
GAPDH β-actin 18SrRNA
关于荧光定量PCR报告的解读
关于荧光定量PCR报告的解读上一回我们讲到甲基化检测报告的解读。
下面我们讲讲如何解读荧光定量PCR报告的报告。
本次先讲相对定量部分。
大家都知道荧光定量PCR（即qPCR）分为相对定量与绝对定量两种。
区别见下表：相对定量绝对定量提取什么RNA DNA对样品的要求高一般是否需要内参基因需要可不需要是否需要对照组一般需要可不需要是否需要制备标准品/标准曲线不需要需要结果比值单位重量或体积内含有多少个目的基因，一般表示为10的几次方个拷贝数单位无单位有单位：拷贝数(Copies)/重量或体积常见用途病理，医学环境微生物1.相对定量我们提供的相对定量实验报告包含下几部分：“图片文件”文件夹中包含引物调试结果、PCR的扩增曲线和熔解曲线。
下图为引物调试结果。
每个样品三个泳道，左为使用第一套引物的产物，中为使用备用引物，右为空白对照。
（相关信息隐去）下图为扩增曲线下图为熔解曲线以上三个图供判断本次PCR的条件是否异常。
有经验的用户会根据曲线发现问题所在。
“文档”文件夹中包含结果数据的excel文件。
“原始数据”文件夹中包含qPCR的原始数据文件。
用ABI 7500或7900的配套软件打开。
为方便查看，此文件夹中的原始数据已转换为上述的excel文件。
“附录”文件提供实验条件、qPCR参数等。
您想知道的操作步骤和参数都已在里面列好了。
Word文件“上海捷瑞生物荧光定量PCR服务报告书”即为最终结果展示。
其中，我们提供原始的Ct值。
见下表。
（Ct：即Cycle Threshold的简写，意为“循环阈值”，是指扩增曲线出现拐点时所对应的循环数）以及经换算后的最终结果值（RQ，即RelativeQuantification的简写，意为“相对定量”）。
见下表。
上表18S为内参基因，表达量都设定为1（无单位）。
通常还会将其中某一组设为对照组（本例中为第一行071），将这组目的基因表达量也设定为1，其他组与对照组作对比，比值即为最终表达量RQ 值。
pcr技术实验报告结果分析
pcr技术实验报告结果分析PCR 技术实验报告结果分析PCR（聚合酶链式反应）技术是一种在分子生物学领域广泛应用的重要技术，它能够快速、特异性地扩增特定的 DNA 片段，为基因分析、疾病诊断等提供了有力的工具。
在进行 PCR 实验后，对结果的准确分析至关重要，这不仅关系到实验的成败，还直接影响后续的研究和应用。
本次 PCR 实验的目的是检测特定基因序列在样本中的存在与否，并对其含量进行相对定量。
实验中使用了提取自_____样本的 DNA 作为模板，设计了特异性的引物，经过 PCR 扩增反应后，通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行了分离和检测。
首先，观察琼脂糖凝胶电泳的结果。
在凝胶上，我们可以看到不同位置出现的条带。
如果出现了与预期大小相符的清晰明亮的条带，说明 PCR 反应成功扩增出了目标片段。
然而，如果没有出现条带，或者条带模糊不清、位置不正确，就需要对实验结果进行深入分析。
没有出现条带的情况可能有多种原因。
一是DNA 模板的质量问题。
如果提取的 DNA 质量不佳，如含有杂质、降解或者浓度过低，都可能导致 PCR 反应无法正常进行。
二是引物设计不合理。
引物的特异性不足、退火温度不合适或者引物自身形成二聚体等，都可能影响引物与模板的结合，从而无法启动 PCR 扩增。
三是 PCR 反应体系的问题。
例如，反应体系中酶的活性不足、dNTP 浓度不合适、镁离子浓度不当等，都可能影响 PCR 反应的效率。
四是反应条件设置不当，如退火温度过高或过低、循环次数不够等。
条带模糊不清可能是由于PCR 反应过程中的非特异性扩增导致的。
这可能是引物的特异性不够好，或者退火温度不够优化，使得引物与非目标区域结合并进行了扩增。
此外，反应体系中模板的浓度过高也可能导致非特异性扩增，产生模糊的条带。
如果条带的位置不正确，这通常意味着扩增出的片段大小与预期不符。
这可能是由于引物结合位点发生了突变，或者在实验操作过程中出现了失误，如引物加错、模板混淆等。
QPCR实验报告
QPCR实验报告一、实验目的本实验旨在通过实时荧光定量聚合酶链式反应（QPCR）技术，对特定基因的表达水平进行定量分析，以探究其在不同实验条件下的变化情况。
二、实验原理QPCR 是一种基于 PCR 技术的核酸定量方法。
在 PCR 反应体系中加入荧光染料或荧光标记的探针，随着 PCR 反应的进行，荧光信号不断累积。
通过检测荧光信号的强度变化，可以实时监测 PCR 反应的进程，并根据标准曲线对未知样品中的核酸浓度进行定量。
三、实验材料与设备1、实验材料提取的总 RNA 样品反转录试剂盒特异性引物QPCR 试剂盒2、实验设备实时荧光定量 PCR 仪离心机移液器微量核酸定量仪四、实验步骤1、 RNA 提取从细胞或组织中提取总 RNA，使用微量核酸定量仪测定 RNA 的浓度和纯度。
2、 cDNA 合成以提取的 RNA 为模板，使用反转录试剂盒合成 cDNA。
3、 QPCR 反应体系配制根据试剂盒说明书，配制 QPCR 反应体系，包括引物、cDNA 模板、PCR 反应液等。
4、 QPCR 反应将配制好的反应体系加入到 PCR 反应管中，放入实时荧光定量PCR 仪中进行反应。
反应条件通常为：95°C 预变性 30s，然后进行 40个循环，每个循环包括 95°C 变性 5s，60°C 退火/延伸 30s。
5、数据分析反应结束后，使用 PCR 仪自带的软件分析荧光数据，得到 Ct 值（Cycle threshold，循环阈值）。
根据标准曲线计算样品中目的基因的相对表达量。
五、实验结果1、标准曲线以不同浓度的标准品进行 QPCR 反应，绘制标准曲线。
标准曲线的线性关系良好，R²值大于 099，表明定量结果可靠。
2、样品检测结果实验样品中目的基因的 Ct 值如表 1 所示。
｜样品编号|目的基因 Ct 值|｜｜｜｜1|＿____|｜2|＿____|｜3|＿____|根据标准曲线和样品的 Ct 值，计算得到目的基因在不同样品中的相对表达量，结果如表 2 所示。
荧光定量PCR实验及数据分析
荧光定量PCR实验及数据分析荧光定量PCR（Fluorescence Quantitative PCR，qPCR）是一种常用于检测和定量分析DNA或RNA浓度的技术。
该技术利用荧光探针与靶分子结合产生荧光信号，通过荧光信号的强度可以确定靶分子的数量。
本文将介绍荧光定量PCR实验及数据分析过程。
实验步骤：1.样品制备：根据研究需要选择DNA或RNA样品，提取并纯化目标DNA或RNA，并将其浓度测定。
2.酶切反应：如果需要对目标DNA或RNA进行酶切，可在此步骤中将其酶切为较小的片段。
3.扩增反应体系的准备：根据实验设计和厂家提供的建议，配置扩增反应所需的试剂。
4.PCR扩增：将目标DNA或RNA与引物和荧光探针一起添加到PCR反应管中，并进行PCR扩增。
根据实验设计，设置反应的温度梯度和时间。
5.实时荧光检测：在PCR扩增的过程中，使用实时PCR仪不断监测PCR反应管中的荧光信号，记录其强度变化。
6.构建标准曲线：选取一系列已知浓度的标准样品进行PCR扩增，并记录每个标准样品的荧光信号强度。
根据标准曲线绘制荧光信号强度和目标分子浓度的对应关系。
7.分析样品数据：将样品的荧光信号强度与标准曲线进行比较，可以计算样品中目标分子的浓度。
根据实验目的，可以对样品数据进行统计分析，如计算平均值、标准差等。
数据分析：1.标准曲线分析：使用标准曲线中的已知浓度和相应的荧光信号强度，通过拟合曲线或插值方法，可以计算出待测样品中目标分子的浓度。
2.相对定量分析：若需要比较不同样品之间目标分子的相对表达水平，可选取一个内参基因作为参照，通过计算目标分子基因和内参基因相对表达量的比值，进行比较分析。
3.统计分析：根据实验设计和样品数量，可以使用合适的统计方法对数据进行分析。
常见的统计方法包括t检验、方差分析等。
总结：荧光定量PCR技术在生物学研究中具有重要的应用价值，能够快速、准确地定量测定DNA或RNA的浓度。
在进行实验时，需要注意实验步骤的正确操作，并合理选择实验设计和数据分析方法，以确保结果的可靠性和准确性。
实时荧光定量PCR简介、结果分析及报告周向阳
平台期 线性扩增期 指数扩增期
基线期
扩增曲线对数图谱： 横坐标：扩增循环数（Cycle number）；纵坐标：荧光强度（Delta Rn）。
扩增曲线
S型曲线的四个特征性阶段
➢ 线性基线期：指PCR反应处于起始阶段。此阶段，扩增产物很少，所 产生的荧光信号很低，反应了系统背景情况。
➢ 指数增长期：指PCR达到其最大的扩增阶段，理想条件下，每一循环 后，PCR产物呈指数倍增加。
DNA的链数 2 4 8
1024 1,048,576 1,073,741,824 10亿
PCR特点：高效扩增、忠实复制
PCR产物的电泳检测和分析
ladder
PCR fragment
二、实时荧光定量PCR
(Real time Quantitative PCR)
• 定义：在PCR反应体系中加入荧光基团， 利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程， 最后通过Ct值和标准曲线对未知模板起始 浓度进行定量分析的方法。
手动调节阈值线的原则：要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值， 同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是荧光信号超过域值。
Ct值
• Ct（Cycle Threshhold）值：每个反应管内的荧 光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 Ct 值（ threshold value ）。
目的基因：FAM
内标：HEX
数据分析一般流程
曲线分析（Amplification Plot）
➢ 基线的调整：其作用直观反应为曲线基线形状的高低或均 一性变化。通常情况下，选择自动分析，此时仪器会针对 每条曲线进行优化分析，因此效果通常比较好。在基线自 动分析的基础上，如果出现某些形状异常的曲线，则在其 他结果分析完成后，再单独对异常曲线进行手动基线调整 分析。
Q-PCR引物特异性检测方法
以96孔板为例
1.将模板DNA，分别稀释50倍，250倍，1250倍，6250倍（5倍稀释）
2.将Q-PCR引物与SYBR Green I混匀（引物0.5ul/孔，SYBR 5ul/孔）
3.将稀释的模板和引物分别点入96孔板，进行Q-PCR实验
4.在setup里将样品从unknow调成standard
设置平行孔和稀释梯度
5.分析图像结果
（1）看溶解曲线
最理想的为单峰：如出现多峰证明反应不特异或存在引物二聚体
峰的宽度较小
（2）看标准曲线
R2越接近1说明特异性越好
评判标准
R2:0.96~1 Slope:-3.58~-3.10 E:90%~110%
E=10(-1/slope)-1
（3）看扩增曲线
平滑，起始无扩增
思考
一般Q—PCR时，模板的稀释倍数为40~50（PS：也有只稀释几倍的），取决于目的基因的表达丰度。
一般保证目的基因的Ct在18~30之间。
相应的检验QP引物特异性时，应该将常用稀释倍数包含在内。
另偏离太大的点可以取掉，可能由于稀释倍数太高而不准确。
荧光定量PCR实验设计及结果分析
荧光定量PCR实验设计及结果分析荧光定量PCR（qPCR）是一种基于Polymerase Chain Reaction（PCR）技术的高灵敏度、高特异性的核酸定量方法。
它通过测量PCR反应体系中特定荧光染料的荧光信号，来实现对目标DNA或RNA的定量分析。
在荧光定量PCR实验设计中，需要考虑样品的选择、引物和探针的设计、实验条件的优化等方面的因素，并根据实验结果进行分析。
实验设计：1.样品选择：根据研究目的选择合适的样品，可以是细胞、组织或者提取的DNA/RNA样品等。
2.引物和探针的设计：根据目标序列的特点设计适当的引物和探针，确保其在PCR反应中的特异性和有效性。
3.实验条件的优化：优化PCR反应条件，包括温度、循环次数、荧光染料浓度等，以提高反应的特异性和灵敏度。
4.标准曲线的制备：通过稀释不同浓度的目标DNA或RNA来制备标准曲线，用于定量目标序列在待测样品中的存在量。
实验步骤：1.样品提取：根据实验需要选择合适的样品提取方法，提取目标DNA或RNA。
2.引物和探针设计：根据目标序列的特点，设计合适的引物和探针。
3.PCR反应：将提取的DNA或RNA与引物和探针一起加入PCR反应体系中，进行PCR扩增反应。
4.荧光信号检测：在每个PCR循环结束后，使用荧光探测仪读取PCR 反应管中的荧光信号。
5.数据分析：根据标准曲线，计算待测样品中目标序列的存在量。
结果分析：1.标准曲线的分析：利用标准曲线中各个浓度点的荧光信号与目标序列存在量的关系，计算出待测样品中目标序列的存在量。
可以通过软件进行自动计算，得到定量结果。
2.目标序列的存在量：根据定量结果，可以比较不同样品中目标序列的存在量，分析不同样品之间的差异或相似性。
3.PCR效率的评估：通过标准曲线的斜率来评估PCR反应的效率，斜率越接近-3.3，反应效率越高。
4.优化实验条件：根据结果分析，可以对实验条件进行优化，提高荧光定量PCR的灵敏度和特异性。
q-pcr结果分析报告
摘要：现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。
绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。
2－△△CT方法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。
本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。
另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量PCR 数据分析中可能会被用到。
关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman反转录PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。
实时PCR 技术和RT -PCR 的结合产生了反转录定量PCR 技术（4 ,5 ）。
实时定量PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。
绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。
绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。
通过实时PCR 进行绝对定量已有多篇报道（6 - 9 ），包括已发表的两篇研究论文（10,11 ）。
在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。
显然，我们说X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。
用实时PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。
2－△△CT 方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化：2－△△CT公式的推导，以及实验设计，有效性评估在Applied Biosystems User Bulletin No.2（P/N4303859）中有介绍。
用2－△△CT方法分析基因表达数据在文献中也有报道（5,6）。
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摘要：现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。
绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。
2－△△CT方法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。
本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。
另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。
关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。
实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。
实时定量 PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。
绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。
绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。
通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道（6 - 9 ），包括已发表的两篇研究论文（10,11 ）。
在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。
显然，我们说 X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。
用实时PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。
2－△△CT方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化：2－△△CT公式的推导，以及实验设计，有效性评估在Appl ied Biosystems User Bulletin No.2（P/N4303859）中有介绍。
用2－△△CT方法分析基因表达数据在文献中也有报道（5,6）。
本文介绍了该方法的推导、假设以及应用。
另外，本文还介绍了2－△△CT两种衍生方法的推导和应用，它们在实时定量PCR 数据分析中都可能被用到。
1. 2－△△CT方法1.1. 2－△△CT方法的推导PCR 指数扩增的公式是：这里，X n 是第 n 个循环後目标分子数，X0 是初始目标分子数，E x 是目标分子扩增效率，n 是循环数，C T 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。
因此：X T是目标分子达到设定的阈值时的分子数。
C T,X是目标分子扩增达到阈值时的循环数。
K x 是一个常数。
对于内参反应而言，也有同样的公式：用X T 除以R T 得到：对于使用 Taqman 探针的实时扩增而言， X T和 R T 的值由一系列因素决定：包括探针所带的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。
因此常数K 并不一定等于1 。
假设目标序列与内参序列扩增效率相同：或：X N 代表经过均一化处理过的初始目标分子量；△C T表示目标基因和内标基因C T值的差异（C T,X－C T,R ）整理上式得：最后用任一样本q 的X N除以参照因子（calibrator, cb）的X N得到：在这里对于一个少于150bp 的扩增片断而言，如果 Mg2+ 浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于1 。
因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是1.2. 2－△△CT方法的假设和应用要使△△CT计算方法有效，目标序列和内参序列的扩增效率必须相等。
看两个反应是否具有相同的扩增效率的方法是看他们模板浓度梯度稀释後扩增产物△CT如何变化。
图1 显示的是 cDNA 样品在 100 倍稀释范围内的实验结果。
对于每一个稀释样本，都用GAPDH 和c -myc 特异的荧光探针及引物进行扩增。
计算出c-myc 和 GAPDH 的平均C T值以及△C T值，通过cDNA 浓度梯度的log值对△C T值作图，如果所得直线斜率绝对值接近于0，说明目标基因和内标基因的扩增效率相同，就可以通过△△CT方法进行相对定量。
在图1中，直线斜率是0.047，因而假设成立，△△CT方法可以用来分析数据。
如果两个扩增反应效率不同，则需要通过定量标准曲线和绝对定量的方法来进行相对定量；或者也可以重新设计引物，优化反应条件使得目标序列和内参序列具有相同的扩增效率。
1.3. 2－△△CT内标和参照因子的选择使用内标基因的目的是为了对加入到反转录反应中的RNA 进行均一化处理。
标准的看家基因一般都可被用作内标基因。
适合于实时 PCR 反应内标基因包括GAPDH，β -actin，β2-microglobulin 以及rRN A 。
当然，其它的看家基因也同样能被用作内标。
我们推荐在应用某一基因作为内标之前首先确证该基因的表达不会受实验处理的影响。
验证实验处理是否对内标基因表达产生影响的方法在2.2 部分有描述。
2－△△CT方法中参照因子的选择决定于基因表达定量实验的类型。
最简单的设计就是把未经处理的样品作为参照因子（calibrator ）。
经内标基因均一化处理後，通过方法计算，目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于未经处理的样本的倍数来表示。
对于未经处理的参照样，△△C T=0，而20=1。
所以根据定义，未处理样本的倍数变化为1 。
而对于那些经过处理的样本，相对于参考因子基因表达的倍数为2－△△CT。
同样的分析也可用于不同时相的基因表达差异，在这种情况下，一般选0 时刻的样本作为参照因子。
有些情况下，并不是比较不同处理样本基因表达差异。
例如，有的是想看某一器官中特定 mRNA 的表达。
在这种情况下，参照因子可能是另一器官中该 mRNA 的表达。
表1显示了大脑和肾脏总RNA 中c-m yc 和GAPDH 转录本的CT 值。
在这一个例子中，大脑被人为的选择为参照因子，通过计算得到肾脏c-myc 表达量经GAPDH 校正後相对于大脑的表达量的结果。
尽管相对定量方法可用于这种组织之间的比较，但结果的生物学解释是相当复杂的。
不同种类细胞中目标和参照转录本单一的相对量变化可能在任何特定的组织中都存在。
1.4. 2－△△CT方法的数据分析实时定量PCR所得到CT值可以很容易的输出到表格程序如Microsoft Excel中去。
为了显示数据分析过程，我们在这里给出了一个基因表达定量的实验数据和样本列表。
通过β-actin 均一化处理，我们对目标基因fos-glo-myc 的表达变化进行了监测。
在8h 的时间范围内，在每一时间点都取3 个重复样本，每一样本在cDNA 合成之後都做定量PCR ，数据分析用到了公式9，即：Time x 表示任意时间点，Time 0表示经β -actin 校正后1 倍量的目标基因表达。
0 时刻目标基因和内标基因的平均C T（见图2 第8 栏）被用于公式9 中。
通过公式9 计算出每一个样本目标基因表达通过β -actin 均一化处理後相对于0 时刻的倍数（见图2 第9 栏）。
平均SD，CV 由每一个时间点所取的三个重复样求得。
用这种分析方法，在0 时刻的平均倍数变化接近于1。
我们发现通过检测在 0 时刻平均倍数变化是否为1 可以很方便的验证三个重复样品之间是否有错误或者误差。
如果得到的结果与1偏差很大，则表明存在计算错误或者是很高的实验误差。
在前面的例子中，在每一时间点上分别取了三个独立的 RNA 样本进行了分析。
因此对每一个样本分别处理，通过计算後取结果的平均值就非常重要。
如果是同一样本进行 PCR 扩增的重复，这就需要首先求出平均CT，然後再进行计算。
怎么样计算平均值就要看目标基因和内参基因是在同一个管子中扩增还是在不同的管子中扩增。
表 1 给出了目标基因（c- myc ）和内参基因（GAPDH ）在不同管中扩增的实验数据。
在这里不应该把任一单个的 c-myc 管子和 GAPDH 管子作比较，而应该分别计算出 c-myc 和 GAPDH 的平均C T来计算△C T。
重复实验中C T值的估计偏差通过标准的指数计算转化成最後结果中相对量的变化。
但其中的一个难点是 C T值与相应的拷贝数成指数关系（见第4 部分），因此，在最後的计算中，的误差通过△△C T 加上标准偏差和△△C T减去标准偏差来评估，这就使得求得的数值相对于平均值呈不对称分布。
不对称分布是因为结果经指数处理後转化成量的线性比较造成的。
通过不同荧光染料标记的探针，我们可以在同一管中同时扩增目标序列和内标序列。
表2 给出了目标基因（c- myc）和内标基因（GAPDH）在同一管中扩增的实验数据。
对于任意一个管子，目标基因（c- myc）和内参基因（GAPDH）扩增时加入的cDNA 量都是一样多的，所以可以分别对每个管子计算△C T值，这些值取平均后再进行计算。
在这里估计误差值也是一个不对称的范围，反映了误差经指数处理转化为线性差异。
在表1 和表2 中，估计误差在从△C T 到△△C T 的计算中未见有增加，这是因为我们把参照基因和检测基因的误差都显示出来了。
我们把△CT，cb 当作一个人为设定的常数来减去，得到△△CT 。
这样得到的结果就与图 2 所显示的在求平均之前对不同重复样本分别通过各自的CT 值求实所得结果相当。
另一种方法是将参照基因当作没有任何误差的1倍的量，在这种情况下，平均△C T,cb 的误差值被引入到每一样本的△△C T中。
在表1中，肾脏中△△C T变成- 2.50±0.20 而经过校正的c-myc 量是5.6 倍，范围从4.9 到 5.6 。
而在大脑中的结果是没有误差的1倍。
2. 2－△Cf方法2.1. 2－△Cf方法的推导通过内标RNA 可以对加入 RNA 的量的差异进行校正。
2－△△CT方法的数据分析的一个特点就是能够利用实时PCR 实验的一部分数据来完成这种校正。
在其它的方法不能定量初始 RNA 量的时候：例如，在能得到的 RNA 量非常有限的时候或者需要处理高通量的样品的时候，这一方法的优势就格外明显。
当然我们也可以利用PCR 实验以外的方法来完成这种校正。
最常用的一种方法就是用紫外吸收来确定用于cDNA 合成的RNA 量，然後将相同的RNA 反转录产生的cDNA 用于PCR 定量反应。
这种外标法校正的一个应用例子就是研究某种实验处理是否影响内标基因的表达。
在这里，目标基因和内标合二为一。
在这个例子中，公式[2] 不被公式[3] 除，公式[5 ]变成：整理得：任一样品X0,q 除以参照品X0,cb 得：在这里△ C'T=C T,q-C T,cb 。
△C’T与前面计算中用的△C T（用目标基因C T值减去参照基因C T值）相互区别。