壳聚糖修饰的Lysozyme_PLGA阳离子纳米药物的制备与表征

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疏水修饰磁性壳聚糖载药纳米粒子的制备与表征

第32卷第1期2017年3月合成技术及应用SYNTHETIC TECHNOLOGY AND APPLICATIONVol.32 No. 1Mar.2017疏水修饰磁性壳聚糖载药纳米粒子的制备与表征郝和群1>2,郑慧芳\张舰3**(1.皖西学院材料与化工学院，安徽六安237012 ;2.安徽省仿生传感与检测技术省级实验室，安徽六安237012;3.皖西学院高分子材料改性工程技术研究中心，安徽六安237012)摘要：利用〇-羧甲基壳聚糖（0-CMC)的表面多种官能团（如-NH2, - OH, -COOH等）与胆酸（CA)进行化学修饰得到两亲性共聚物，再以反溶剂法将Fe304和阿霉素（D0X)包埋在两亲性共聚物疏水的核中，制备两亲性的磁性壳聚糖载药纳米粒子，并对磁性载药纳米粒子的形貌、粒径大小、磁性、药物控释等进行了研究。

结果表明:磁性壳聚糖纳米粒子有较高的药物包埋效率(92. 3%),与自由阿霉素相比,磁性复合物具有明显的缓释作用和pH响应性；同时，有较好的超顺磁性。

这些说明制备的疏水修饰磁性壳聚糖载药纳米粒子具有双重响应性,有望作为药物输送载体对肿瘤进行实时跟踪、诊断和治疗。

关键词：0-竣甲基壳聚糖Fe304阿霉素控释中图分类号：0636.1 文献标识码：A章编号:1006 -334X(2017)01 -0015 -04癌症是导致人类死亡的主要疾病之一。

在抗肿瘤研究领域，虽然许多国家在过去的几十年里都投入了巨额的研究经费，但在降低癌症死亡率方面并不是很理想。

导致这一现象的原因有很多，其中一个重要原因是缺乏对肿瘤的早期诊断、检测以及疗效监测的方法。

而早期诊断在很大程度上依赖于分子影像技术，如核磁共振成像（MRI)、X射线、CT、PET、超声和光学成像等影像技术，获取有用的生物学信息，满足肿瘤的诊断、监测[1_2]。

目前，国内外已经报道了多条靶向可控治疗途径，如以抗体识别直接靶向治疗;通过特殊性能的纳米微粒为药物载体导向治疗等。

壳聚糖微球纳米粒的制备及其性能研究

采用扫描电子显微镜（SEM）对制备的纳米微球进行形貌观察，用动态光散射仪（DLS）测定纳米微球的粒径及分布，通过红外光谱（IR）分析纳米微球的化学结构，并采用体外释放实验考察纳米微球的载药性能和药物释放行为。
实验结果
通过优化乳化法制备的烷基壳聚糖纳米微球形貌圆整，粒径分布较窄，直径在100-200nm之间。红外光谱分析表明，烷基链成功引入到壳聚糖分子中。药物负载实验表明，烷基壳聚糖纳米微球具有较高的载药量，药物负载率可达30%以上，负载药物的纳米微球具有较好的稳定性。
2、化学性能：如降解性、稳定性等。壳聚糖微球纳米粒需要在不同的环境中保持稳定，同时又能够在特定条件下进行降解，因此对于其化学性能的要求较高。
3、生物性能：如细胞相容性、血液相容性等。由于壳聚糖微球纳米粒在药物传递和生物医学工程等领域有着广泛的应用前景，因此需要对其生物性能进行深入研究。在细胞实验和动物实验中，需要考察壳聚糖微球纳米粒对于细胞和血液的影响，以评估其生物安全性。
（2）小鼠免疫：将制备的免疫原注射到Balb/c小鼠体内，以诱导产生抗体。
（3）杂交瘤细胞制备：采用细胞融合技术，将产生抗体的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞。
（4）单克隆抗体纯化：通过有限稀释法，筛选出能够稳定分泌抗人CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞，并进行克隆扩大。然后，通过蛋白A柱进行纯化，得到单克隆抗体。
制备方法及性能研究：壳聚糖微球纳米粒的制备方法主要包括以下步骤：
1、原位聚合法：将壳聚糖在一定条件下进行溶解，加入交联剂和引发剂，通过原位聚合反应得到微球纳米粒。该方法的优点是制备过程简单、产量高，但可能引入残留物，影响其性能。
2、乳滴聚合法：将壳聚糖溶液与不相容的溶剂混合，通过高速搅拌形成乳滴，再通过热处理或溶剂挥发法制备出微球纳米粒。该方法的优点是乳滴尺寸可控，但可能受到搅拌速度和热处理温度等因素的影响。

壳聚糖药用纳米粒子的制备及性能研究

ｉ０ ℃ ，ｒａｔｎｉｅ４ｈｈｔｓｎ０・，ＭＭＡｓ５ｅｃｉｇｔ，ｃｉａ．ｇｍｏ６６ｍＬ，ａｍｍｏｉｍｅｉｉｒｔ．，ｎｕｃｒｃｎｔａｅ０９ｇ
ａｎｄ１ａｅｉｃｄ３Ｌ．Ｔｈｅｖｔｏｅｅｓｅｔｓｗｓｔｔｔｕｇｌａｉｇｒｔｎｄｃｔｃａｉ００ｍｉｒｒｌａｅｔｓｈｏｈａｈｅｄｒ —ｏｄｎａｅａ
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ＺＨＡＮＧｉ－ｉ，ＪｎｑｕＢＡＯ・ａＭｕｔｉ，ＬＩｈｎｊｎＵＺａ－ｕ。
（．ｙＬａｒｔｒｆＭａｉｅｉｔｙＴｈｏｙａｄＴｅｈｌｇ１ＫｅｂｏａｏｙｏｒｎｅＣｈｍｓｒｅｒｎｃｎｏｏｙ，ＭｉｉｔｙｏｕｃｔｏＱｅａｎｓｒｆＥｄａｉｎ，ｅｎＵｎｉｅｓｔｖｒｉｙｏｎａｆＣｈｉ，Ｑｉｇａ６１０，Ｃｈｎｎｄｏ２６０ｉａ；２ＣｏｌｇｆＰｈｒｃ．ｌｅｏａｍａｙ，ＨｅｉＵｎｔｄＵｎｖｓｔｅｂｅｉｅｉｅｉｙ，Ｔａｇｈｎ０３０ｎｓａ６００，Ｃｈｎ）ｉａ

壳聚糖修饰PLGA荧光纳米粒制备与表征实验总结PPT课件

0.182 0.168
19.71 21.30
2020/10/13
10
香豆素-6 HPLC分析方法的建立
1.线性：Y=38.131x-0.1522，R2=0.9999 2.精密度:精密度均小于2%，精密度良好。 3.专属性 4.回收率 5.包封率
2020/10/13
11
香豆素甲醇溶液
壳聚糖修饰PLGA纳米粒
壳聚糖分子中含有大量的游离氨基和羟基，可与粘液中的糖蛋白形成氢键而产生粘附作用。且粘膜中粘蛋白带有负电荷，壳聚糖与粘膜之间的电荷相互吸引能延长药物在体内特定区域的滞留时间，提高药物的生物利用度，壳聚糖已广泛应用于粘膜给药系统。
2020/10/13
3
立题依据
本实验制备壳聚糖修饰的PLGA纳米粒，根据CS的电势为正，而PLGA带负电荷，在搅拌的作用下，CS直接通过离子键的作用吸附在 PLGA纳米粒的表面，制得CS修饰的PLGA纳米粒。
壳聚糖修饰的PLGA纳米粒荧光探针的制备
2020/10/13
2012.06.05
1
内容提要
立题依据 CS-PLGA-NPs的制备处方优化方法学验证计划
2020/10/13
2
立题依据
壳聚糖是自然界唯一存在的荷正电荷的碱性多糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性，且具有多种生物活性。
汇报人：XXXX 日期：20XX年XX月XX日
14
2020/10/13
5
CS-PLGA-NPs的制备
表1 两种不同的壳聚糖修饰方法制备的粒子的粒径电位表征
方法
平均粒径（nm）多分散系数 Zeta电位(mV)
外水相加入法 221.85
0.186

壳聚糖修饰聚丙烯酸纳米粒子的制备及药物载药性能评价

壳聚糖修饰聚丙烯酸纳米粒子的制备及药物载药性能评价摘要：纳米药物载体的制备及性能评价对于新药的研发和临床应用具有重要意义。

本文介绍了壳聚糖修饰聚丙烯酸纳米粒子的制备方法，并对其药物载药性能进行评价。

实验结果表明，壳聚糖修饰能够显著改善纳米粒子的稳定性和药物的载药能力，为药物释放提供更好的控制。

1. 引言纳米粒子作为一种重要的药物载体，在药物传递、靶向治疗及缓释等方面具有巨大的潜力。

然而，纳米粒子的稳定性和药物载药能力仍然是值得关注的问题。

壳聚糖作为天然聚合物，具有良好的生物相容性和生物可降解性，因此被广泛应用于药物修饰和纳米粒子制备中。

本研究旨在通过壳聚糖修饰聚丙烯酸纳米粒子，提高其稳定性和药物载药性能。

2. 实验方法2.1 聚丙烯酸纳米粒子的制备聚丙烯酸纳米粒子通过乳液聚合法合成。

首先，将丙烯酸、甲基亚铁氨基甲酸酯等单体溶解在去离子水中，形成单体溶液。

然后，将单体溶液加入表面活性剂溶液中，进行乳液化处理。

最后，通过引发剂引发聚合反应，使得单体在乳液中聚合形成纳米粒子。

2.2 壳聚糖的修饰首先，将壳聚糖溶解于醋酸溶液中。

然后，将合成的聚丙烯酸纳米粒子分散于壳聚糖溶液中，进行表面修饰。

壳聚糖与聚丙烯酸纳米粒子之间通过静电作用和氢键相互吸附，形成壳聚糖修饰的聚丙烯酸纳米粒子。

3. 结果与讨论3.1 纳米粒子的稳定性评价利用动态光散射仪测量壳聚糖修饰聚丙烯酸纳米粒子的粒径及分布。

实验结果表明，壳聚糖修饰显著减小了纳米粒子的粒径，增强了粒子的稳定性。

此外，电镜观察结果显示，壳聚糖修饰形成了较为均匀的包覆层，进一步证实了稳定性的提升。

3.2 药物载药性能评价采用激光共振光散射和透射电镜等方法研究了壳聚糖修饰聚丙烯酸纳米粒子的药物载药性能。

实验结果显示，壳聚糖修饰纳米粒子具有较高的药物载药率和缓释性能。

壳聚糖修饰层可以作为药物的保护层，延缓药物的释放速度，实现持续释放效果。

4. 结论本研究成功制备了壳聚糖修饰的聚丙烯酸纳米粒子，并对其药物载药性能进行了评价。

印楝素_羧甲基壳聚糖_磷酸化壳聚糖纳米粒子的制备_性能与表征_殷旭东

江西农业学报　2010,22(1):69～73ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＪｉａｎｇｘｉ印楝素/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖纳米粒子的制备、性能与表征殷旭东,张子勇＊收稿日期:2009-11-05基金项目:国家自然科学基金项目(30771419、30971915)。

作者简介:殷旭东(1975-),男,博士研究生,研究方向为生物材料与纳米技术。

＊通讯作者:张子勇。

(暨南大学材料科学与工程系,广东广州510632)摘　要:为了克服壳聚糖只能溶于酸性水溶液的局限,对壳聚糖进行了化学修饰,通过引入磷酸基官能团,合成了可溶于中性水的壳聚糖衍生物磷酸化壳聚糖。

以磷酸化壳聚糖和羧甲基壳聚糖为基材,用聚电解质复合法制备了印楝素/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖纳米粒子水分散制剂。

测试结果表明,纳米粒子的平均粒径为200～300ｎｍ,纳米粒子对印楝素的负载率最大可达43.5%。

关键词:壳聚糖;羧甲基壳聚糖;磷酸化壳聚糖;纳米粒子;印楝素;制备中图分类号:Ｏ636.1　文献标识码:Ａ　文章编号:1001-8581(2010)01-0069-05Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ,ＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＡｚａｄｉｒａｃｈｔｉｎ/ＣａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌＣｈｉｔｏｓａｎ/ＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎＣｈｉｔｏｓａｎＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓＹＩＮＸｕ-ｄｏｎｇ,ＺＨＡＮＧＺｉ-ｙｏｎｇ＊(ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＭａｔｅｒｉａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ,ＪｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ,Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ510632,Ｃｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｏｖｅｒｃｏｍｅｔｈｅｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅ(ｄｉｓｓｏｌｖｅｄｏｎｌｙｉｎａｃｉｄｗａｔｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎ)ｏｆｃｈｉｔｏｓａｎ,ｃｈｉｔｏｓａｎｗａｓｍｏｄｉｆｉｅｄｂｙｃｈｅｍｉｃａｌｍｅｔｈｏｄ.Ａｗａｔｅｒ-ｓｏｌｕｂｌｅｃｈｉｔｏｓａｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｃｈｉｔｏｓａｎ(ＰＣＳ)ｗａｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｂｙｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃｇｒｏｕｐｉｎｔｏｃｈｉｔｏｓａｎ.Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｓｔａｔｉｃｅｌｅｃｔｒｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｐｏｓｉｔｉｖｅｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅａｎｄｎｅｇａｔｉｖｅｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ,ａｚａｄｉｒａｃｈ-ｔｉｎ/ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｈｉｔｏｓａｎ(ＣＭＣ)/ＰＣＳｄｉｓｐｅｒｓｉｂｌｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｗａｓｐｒｅｐａｒｅｄｂｙｕｓｉｎｇＰＣＳａｎｄＣＭＣａｓｂａｓｉｃｍａｔｅｒｉａｌｓ.Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉ-ｍｅｎｔａｌｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｚｅｏｆａｚａｄｉｒａｃｈｔｉｎ/ＣＭＣ/ＰＣＳｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｓｂｅｔｗｅｅｎ200ｎｍａｎｄ300ｎｍ.Ｔｈｅｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｔｈｅｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｔｏａｚａｄｉｒａｃｈｔｉｎｉｓｕｐｔｏ43.5%.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:Ｃｈｉｔｏｓａｎ;Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｈｉｔｏｓａｎ;Ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃｃｈｉｔｏｓａｎ;Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ;Ａｚａｄｉｒａｃｈｔｉｎ;Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ带有阳离子的天然多糖壳聚糖(Ｃｈｉｔｏｓａｎ,ＣＳ)因其独特的生物活性受到人们的青睐[1]。

PLGA 、壳聚糖纳米粒的制备及细胞毒性研究

PLGA 、壳聚糖纳米粒的制备及细胞毒性研究薛延香;詹雪灵;刘影;沈仁泽;晋冰玉;高杰【摘要】AIM:To prepare PLGA and chitosan ( CS) nanoparticles and to evaluate their cytotoxicity to periodontal ligament cells( PDLCs) .METHODS:PLGA and CS nanoparticles were prepared by emulsion solvent e-vaporation method cross-linking of CS with sodium tripolyphosphate respectively.The nanoparticles were characterized by Zetasizer 3000HS and transmission electron microscope.Passage 3 -5 PDLCs were cultured with PLGA and CS nanoparticles at 0(the control), 0.5 mg/mL, 1 mg/mL and 2 mg/mL respectively.The PDLCs were subjected to MTT assay at 24, 48, 72 h of culture.RESULTS:PLGA nanoparticles were uniform and spherical, and the mean particle size and dispersive coefficient were 188.10 ±2.86 nm and 0.55 ±0.04, respectively.CS nanoparticles were relatively uniform and aspheric, the mean particle size and dispersive coefficient were 250.97 ±30.86 nm and 0.50 ±0.07, re-spectively.The OD values of 2 mg/mL PLGA group and 1 mg/mL CS group were lower than that of the control (P<0.05) at 48 h of culture.At other times points, no significant difference was found among different groups (p>0.05).The relative growth rate of PDLCs in all groups was all higher than 85%.The toxicity grading of all groups was 0 or 1.CONCLUSION:PLGA and CS nanoparticles are nontoxic to PDLCs, according to ISO10993-5.%目的：制备大小均一的PLGA、壳聚糖纳米粒并研究其对牙周膜细胞的毒性。

壳聚糖修饰的Lysozyme—PLGA阳离子纳米药物的制备与表征

Ｕ２０Ｖ－０分光光度计，ｎｃ；８１力搅拌器，０Ｕｉ７．磁ｏ江苏金坛市亿通电子有限公司；Ｇ１－冻干燥ＬＪ０Ｃ冷机，京四环科学仪器厂；Ｌ２ＧＩ冷冻离心机，北Ｇ－０－Ｉ
溶菌酶，８０／ｇ浙江长兴艾格生物制品有１００Ｕｍ
限公司；壁微球菌，溶中科院微生物所；ＬＡ（乳ＰＧ聚酸与羟基乙酸物质的量比５：０分子量８０）分０５，００，析纯，南岱罡生物科技公司；Ｖ－２水解度济ＰＡ１４（
以化学键合的方式用于负载水溶性蛋白药物的纳米
微球的报道尚未出现。
ＧＡ纳米微球表面缺乏可用于共价修饰的基团，所以难以在表面负载生物活性物质如ＤＡ、体和疫Ｎ配
苗等］不易于通过受体或抗体进行靶向给药。，因此，人们尝试用不同方法将ＰＧＬＡ表层包裹不同的聚合物以达到物理改性ＰＧＬＡ微球表面的目的。如阳离子表面修饰是基于ＰＧＬＡ表层负电荷而设计
９％，合度２０～２０，Ｈ平均分子量９聚４０５０）ＣＳ（３００６００脱乙酰度大于９％）分析纯，０，北京化学试剂公司；二环己基碳二亚胺（Ｃ）分析纯，ＤＣ，上海化学试剂公司。

生物素化壳聚糖修饰的PLGA纳米粒的制备及表征

Vo.l 31高等学校化学学报No .82010年8月 CHEM I CAL J OURNAL OF CH I NESE UN I VERSI T I E S 1682~1687生物素化壳聚糖修饰的PLGA纳米粒的制备及表征陈红丽1,唐红波2,杨文智2,陈汉2,王银松3,梅林4,5,张彤2,熊青青2,张其清2(1.新乡医学院生命科学技术系,河南省遗传性疾病与分子靶向药物重点实验室培育基地,新乡453003;2.中国医学科学院生物医学工程研究所,天津市生物材料重点实验室,天津300192;3.天津医科大学药学院,天津300070;4.清华大学深圳研究生院,深圳518055;5.大连医科大学药学院,大连116027)摘要合成了生物素化壳聚糖(B i o -CS),并通过核磁共振(1H NM R )及电感耦合等离子体光质谱法(I CP -M S)对其进行结构确证.采用溶剂挥发法(W 1/O /W 2)制备聚乳酸-羟基乙醇酸(PLGA )纳米粒,并通过共价交联法对纳米粒进行B io -CS 表面修饰.未修饰的PLGA 纳米粒在扫描电镜下观察呈规则球状形态,平均粒径为(24814?2110)n m,Zeta 电势为-(21121?2113)mV,B i o -CS 修饰后的PLGA 纳米粒保持球状形态,平均粒径为(26813?2314)n m,Z eta 电势为(25145?2159)mV.采用X 射线光电子能谱(XPS)以及试剂盒对纳米粒表面生物素进行定性及定量研究,结果显示,经过B io -CS 修饰后的纳米粒表面含有N,S 元素,生物素取代度为31%的B i o -CS 修饰的PLGA 纳米粒,其表面生物素含量为(1136?0134)L mo l/100m g 纳米粒.关键词纳米粒;聚乳酸-羟基乙醇酸;生物素化壳聚糖;抗肿瘤中图分类号 O 631 文献标识码 A 文章编号 0251-0790(2010)08-1682-06收稿日期:2009-11-05.基金项目:国家重大科学研究计划项目(批准号:2006CB933300)和新乡医学院省级重点学科开放课题资助.联系人简介:陈红丽,女,博士,讲师,主要从事高分子生物医学材料及药物制剂方面的研究.E-m ai:l chenh l h @l 张其清,男,教授,博士生导师,主要从事生物材料、组织工程和控制释放药物体系的研究.E-m ai:l zhangq i q@ .cn近10年来,大量用于制备微球及纳米粒控释系统的合成高分子材料主要为聚酯类如乳酸-羟基乙醇酸共聚物(PLGA )和聚乳酸(PLA)等.目前,采用PLGA 制备的控缓释微球制剂如Lupron Depot 等已经上市.虽然这些聚酯类载体可以达到保护药物、防止降解以及缓释的优点,但是其与机体细胞缺少特异性结合,从而使到达非病灶组织的药物量增加,这在一定程度上限制了其在临床上的广泛应用[1~3].当前,大量的研究旨在通过对聚酯类材料的纳米粒或微球进行表面修饰,以达到药物长循环及靶向性的目的.采用具有良好生物相容性、可生物降解性及抗酸、抗炎和抗肿瘤活性[4,5]的多糖材料壳聚糖对PLGA 纳米粒进行表面修饰可以相应避免或减少其缺陷[6~10],我们曾系统研究了其作为抗肿瘤药物载体的可行性[11].在载体上连接靶向配体,与细胞表面特别是肿瘤细胞表面的受体结合,可以达到靶向输送药物的作用[12].生物素(B iotin)即维生素H,是分子量为244的小分子营养物质,人体几乎所有的细胞表面都具有表达这种小分子营养素的受体;而肿瘤细胞的快速生长,需要大量营养物质,其细胞表面往往会过度表达生物素的特异受体,与正常组织和细胞相比,具有较高的生物素结合能力.因此,将生物素受体作为一种特异识别的靶点,对药物载体进行生物素修饰,使其达到靶向杀肿瘤细胞的作用,已成为靶向抗肿瘤药物载体领域的研究热点之一[13~21].本文通过两步法合成了生物素化壳聚糖衍生物(B i o -CS),并对PLGA 纳米粒进行了表面修饰;采用动态激光散射法、Zeta 电位测定法以及扫描电镜对纳米粒的粒径大小、形态结构以及表面荷电性质进行表征;通过XPS 和试剂盒对纳米粒表面生物素进行定性及定量研究,为将这种新型纳米体系用作抗肿瘤靶向给药载体的研究提供了体外数据参考.1 实验部分1.1 试剂与仪器PLGA (M w =10000~30000,乳酸与羟基乙醇酸的摩尔比为50B 50,山东省医疗器械研究所),壳聚糖(低分子量,脱乙酰度85%,Sig m a 公司),生物素(北京嘉康源生物制品公司),N,N c -二环己基碳酰亚胺(DCC ,化学纯,批号:T20060815,国药集团化学试剂有限公司),N -羟基琥珀酰亚胺(NH S ,纯度>99%,HPLC 级,上海延长生化有限公司),生物素定量测定试剂盒Quant Tag B iotin K it(Ca.t N o .BDK-2000,Vector 公司),其余试剂均为分析纯.场发射扫描电镜(J EOL,JSM-6700F,日本);X 射线光电子能谱(P H I -1600,美国);电感耦合等离子体光质谱仪(V I STA-M PX,美国);核磁共振波谱仪(I NOAVA 500MH zV ar i a n,美国);超声波匀质仪(UH-500A,天津奥特赛斯仪器有限公司);粒径及电位分析仪(Zeta PALS Brookhaven Instrum ents C o .,美国),低温冷冻真空干燥机(Labconco 公司,美国).1.2 B io -CS 的合成及表征分别将1mm o l 生物素、1mm o lNH S 和112mm o lDCC 溶于20mL D M F 中,于50e 水浴中磁力搅拌反应16h 后滤去反应液中生成的白色沉淀二环己基脲(DCU ),收集滤液,加入乙醚至沉淀不再增加,放入冰浴中1h,过滤收集沉淀,即为活性生物素酯(B i o -NH S)粗品.将B i o -NH S 粗品用热异丙醇溶解,置于冰浴中3h 结晶,过滤收集结晶,用DM F 溶解后加入乙醚,冰浴1h ,过滤收集沉淀,真空干燥得B i o -NH S [20].取质量分数为1%的CS 溶液10mL ,将一定量B i o -NH S 溶于DM F 溶液中,在搅拌下逐滴加入CS 溶液中,搅拌反应20h ,多次透析,除去残留小分子化合物,冷冻干燥得B io -CS ,干燥储存,备用.将合成的产物生物素酯以及不同取代度的B i o -CS 以四甲基硅烷(TM S)为内标,分别进行1H NMR 谱分析.通过电感耦合等离子体光质谱法(I CP -M S)测定B i o -CS 样品中硫元素的浓度,并通过下式计算其B i o -CS 分子中生物素的取代度(Deg ree o f substitution ,DS),即每100个糖单元中偶联上的生物素残基数目.DS=n (S)@162/(m tota l -m b iotin )@100%,其中n (S)为S 元素的摩尔数,即S 测得的浓度@V ,其中V =10m L ,m total 为待测样品的质量,本实验中m total =10m g ;m b iotin 为待测样品中生物素残基的质量,即m b iotin =n (S)@227131;162为CS 分子中糖单元的分子量.精确称取干燥的1010m g B io -CS ,溶于10mL 稀盐酸中并定容,以100m g /L 标准硫元素溶液作为标准品,进行测定.硫分析谱线:18017n m.测定B io -CS 样品中S 元素的含量,计算B io -CS 分子中生物素的取代度.1.3 PLGA 纳米粒的制备采用超声乳化法制备纳米粒[11],取200mg PLGA 溶于4mL 二氯甲烷中,将015mL 水溶液转入PLGA 溶液中,超声30s 形成初乳,将初乳转入20mL 质量分数为1%的PVA 溶液中,再次超声30s ,形成复乳,转入100mL PVA 溶液中,搅拌4h ,待有机溶剂挥发后在18000r /m i n 离心下收集纳米粒,冷冻干燥,即得PLGA 纳米粒.1.4 CS 及B io -CS 修饰的PLGA 纳米粒采用共价交联法[11],取100m g PLGA 纳米粒,用去离子水分散并加入适量EDC 活化2h ,然后加入适量B io -CS 溶液(L 剂量:100m g ,M 剂量:150m g ,H 剂量:200m g),磁力搅拌反应24h ,离心收集纳米粒,冷冻干燥,待检.1.5 纳米粒表面壳聚糖及生物素的测定X 射线光电子能谱(XPS),使用P H I 1600ESC A 系统(Per k i n -E l m er)进行分析,以M g K A 为X 射线源(125316e V ),测试角度为50b ,功率250W,电压15kV,真空度为617@10-7Pa .每组取2个样品进行检测,每个样品扫描2个不同部位,以对纳米粒表面元素进行定量分析.采用生物素试剂盒Quan*t Tag TM B i o ti n K it 测定纳米粒表面的生物素含量.该试剂盒可用于定量测定游离生物素以及吸附或结合于蛋白、核酸和其它大分子上的生物素.该试剂盒能与生物素发生化学1683 N o .8 陈红丽等:生物素化壳聚糖修饰的PLGA 纳米粒的制备及表征反应,生成的有色产物具有紫外吸收.根据试剂盒使用说明,选用011mL 测定法,以535nm 波长测量其吸光值定量.1.6 纳米粒表面形态、粒径及Z eta 电位测定将干燥后的纳米粒置于铜片上,真空喷金后用场发射扫描电镜观察纳米粒形态结构.取适量纳米粒分散于去离子水中,用激光粒度分析仪测定纳米粒的粒径及粒径分布,并对其表面Z eta 电位进行检测,每个样本测量5次.1.7 统计学分析实验数据以均数?标准差表示,样本均数间比较采用t 检验,3种纳米粒的释放采用方差分析,以P <0105为差异具有统计学意义.2 结果与讨论2.1 B io -CS 的合成N -羟基琥珀酰亚胺生物素酯(简称活性生物素酯)及B i o -CS 的合成路线见Sche m e 1.生物素侧链上的羧基可与羟基和氨基等活性基团发生化学反应生成生物素衍生物.将生物素分子中的羧基和NH S 分子中的羟基反应转化成活泼酯的形式使羧基得以活化,然后在温和条件下与CS 分子中的氨基发生酰胺反应制备B i o -CS .生物素具有生物活性作用的是其二元环分子结构,将其侧链活性基团与CS 偶联的方法制备B i o -CS ,不破坏其活性结构,因而不会影响生物素与细胞表面生物素受体间的特异性识别作用[22].原料CS 、生物素、中间产物活性生物素酯及产物B i o -CS 的核磁图谱见图1.Sche m e 1 Synth etic routes of bioti ny l ated ch itosan (B i o-CS)Fig .11H N MR spec tra of b i otin(A ),NH S -biotin(B),CS(C)and B io -CS(D ) Tab le 1 D egree of s ub stitut i on (DS)of B i o -CS Sa m ple m (CS)/m g m (B io -N H S )/m g 105n (S)/mo l DS(%)B i o -CS141001000.72214B i o -CS31100150 1.3331B i o -CS34100200 1.4234B i o -CS36100250 1.4636活性生物素酯:1H NMR (DM SO,400MH z),D :6144(s ,1H,NH ),6136(s ,1H,NH ),4129~4136(m,1H,)C HC H 2S),4112~4115(m,1H,)C H C H S),3108~3113(m ,1H,)C H S),2186(m,4H,)C H 2)),2183(d ,J =512,1214H z ,1H,)C H 2S),2156(d ,J =1214H z ,1H,)C H S),2120(,t J =716H z ,2H,)CH 2COO),1131~1165(m,6H,)C H 2)).壳聚糖:1H NMR(D 2O /F 3CCOOD,400MH z),D :4174(H 1),2179(H 2),3153~3134(H 3,4,5,6),1176(NH C OC H 3).B i o -CS :1H NMR (D 2O /F 3CCOOD ,400MH z):4172(H 1),4135(m,1H,)CHC H 2S),4116(m,1H,)C H C H S),3162~3114(H 3,4,5,6),3107(m ,1H,)C H S),2191(m ,4H,)C H 2)),2172(d ,J =512,1214H z ,1H,)CH 2S),2153(d ,J =1214H z ,1H,)C H S ),2101(,t J =716H z ,2H,)C H 2COO ),1178(NHCOCH 3),1151~1114(m ,6H,)C H 2));产物图谱与相关文献[23~25]一致.可以籍此计算产物中生物素的取代度.根据投料比的不同,合成了4种不同生物素取代度的B io -CS (见表1),采用I CP -MS 测定硫元素的浓度,并通过公式精确计算B io -CS 分子中生物1684高等学校化学学报 V o.l 31素的取代度.2.2 纳米粒的制备及粒径、粒径分布、形态结构和表面荷电性的表征制备B i o -CS 修饰的纳米粒有两种思路:(1)合成B io -CS ,作为包覆材料来修饰制备好的PLGA 纳米粒;(2)用吸附的方式制备CS 修饰的PLGA 纳米粒,然后在纳米粒表面化学键合生物素.本文考虑到纳米粒经历化学反应可能造成包载药物的损失,因而选择了第一种制备方法.纳米粒的扫描电镜如图2所示.PLGA 纳米粒[图2(A )]呈规则球状形态,表面光滑,分散均匀,无粘连现象发生;CS 和B i o -CS 修饰的PLGA 纳米粒[图2(B ),(C )]保持了球状形态,但出现聚集的现象,并且随着CS 和B io -CS 投料量的增加,聚集程度呈增加的趋势,表现为分散性变差,这是由于PLGA 纳米粒表面包覆CS 或B io -CS 造成的[11].Fig .2 SEM i mages of PLGA nanospheres(A),CS m od ified PLGA nanospheres(B)andB io -CS m od ified PLGA nanospheres(C)纳米粒的粒径、粒径分布及表面Zeta 电位检测结果列于表2.PLGA 纳米粒平均粒径为(24814?2110)nm ,分散系数为01154?01079,Z eta 电位为-(21121?2113)mV;CS 和B i o -CS 修饰的PLGA 纳米粒粒径分别为(27313?2612)和(26813?2314)nm,Zeta 电位分别为(24145?1129)和(25145?2159)mV.PLGA 纳米粒表面荷负电说明在超声乳化制备过程中,PLGA 分子末端羧基由于其亲水性主要分布于纳米粒表面,有利于与包覆材料CS 及B i o -CS 分子中的氨基共价连接.与PLGA 纳米粒相比,CS 及B io -CS 修饰后的纳米粒粒径有所增加,Z eta 电位为正值,结合吸附法和共价交联法修饰PLGA 纳米粒的结论[11],均说明采用本法可成功地对PLGA 纳米粒进行CS 及B i o -CS 表面修饰.T ab le 2 Character istics of the nanospheres *Sa m p l em (PLGA)B [m (CS)or m (B io -CS )]Y iel d(%)Po l yd is pers it y i nd ex Particl e size/nm Z eta potenti al/mV PLGA n anospheres1B 091.4?2.60.154?0.079248.4?21.0-21.21?2.13CS-m od ified n anospheres1B 0.677.7?2.00.268?0.171273.3?26.224.45?1.29B i o -CS m od ified nanos pheres1B 0.674.7?2.60.213?0.064268.3?23.425.45?2.59 *Val ues express as m ean ?S .D.(n =5).2.3 纳米粒表面生物素的定性及定量检测图3为纳米粒的XPS 谱.在相同噪音水平下,PLGA 纳米粒表面未观察到氮和硫元素的信号,而CS 修饰的PLGA 纳米粒在400e V 附近出现明显的氮元素信号,B io -CS 修饰的纳米粒在160和400e V 附近出现了明显的氮和硫元素信号.以上数据均说明本文采用共价交联法成功完成了对PLGA 纳米粒的CS 及B io -CS 表面修饰[21].虽然通过XPS 分析结果,可获得B io -CS 修饰的PLGA 纳米粒单位面积上硫元素的质量比为0178%,但考虑到纳米粒粒径分布以及表面生物素分布的不均匀性,其表面积难以准确定量,从而难以量化后续细胞实验中的细胞摄取率,因此本文采用试剂盒法进一步对单位质量纳米粒的生物素含量进行了检测.靶向配体(如生物素)在纳米粒表面的分布密度决定了纳米粒与受体间的结合能力大小,从而影响纳米粒被肿瘤细胞摄取的程度,因此是制剂靶向性以及药效学的重要评价指标.本文采用Quant *Tag T MB iotin K it 生物素试剂盒精确测量并计算单位质量纳米粒的生物素含量,旨在为客观评价B io -CS 修饰的PLGA 纳米粒与肿瘤细胞间的结合能力提供数据支持.不同取代度的B i o -CS 通过共价连接的方式包覆于PLGA 纳米粒表面,试剂盒法测定单位质量纳米粒表面的生物素含量结果如图4所示.在相同生物素剂量(200m g)下,随着包覆材料B i o -CS 分子中生物素取代度的增加,纳米粒表面生物素含量1685 N o .8 陈红丽等:生物素化壳聚糖修饰的PLGA 纳米粒的制备及表征F i g .3 XPS spectra of PLGA nanosph ere s(A ),CS -m od ified PLGA nan ospheres(B )andB io -CS modif ied PLGA nanos ph eres(C)F i g .4 B iotin con ten t on the sur face of th e un it m ass of nanosph ere sL :100mg ,M:150m g ,H:200mg .也呈增加的趋势,如14%和31%生物素取代度的B io -CS 修饰的PLGA 纳米粒的生物素含量分别为(0186?0119)和(1136?0134)L m ol/100mg 纳米粒;34%及36%生物素取代度的B i o -CS 修饰的纳米粒的检测结果和31%生物素取代度相比,没有显著性差异(P >0105).此外,实验结果还显示在100~200m g 剂量范围内,随着B io -CS 投入剂量的增加,B io -CS 修饰的PLGA 纳米粒的生物素含量呈增加的趋势.理论上,纳米粒表面生物素含量越高,则与肿瘤细胞表面生物素受体结合的配体数量越多,也就越有利于两者之间的相互作用,从而增加肿瘤细胞对纳米粒的摄取.但是纳米粒表面的羧基及活性基团数目是一定的,并且由于空间位阻的作用,因而增加B io -CS 的量并不能无限增加纳米粒表面的生物素的量.因此,选用31%取代度的B io -CS 对PLGA 纳米粒进行表面修饰.综上所述,本文合成了4种不同生物素取代度的B io -CS 样品,并以其为包覆材料通过共价交联的方法对PLGA 纳米粒进行表面修饰.对纳米粒的形态结构、粒径大小以及表面荷电性质进行了表征,并通过XPS 和生物素试剂盒法对纳米粒表面生物素进行了定性及定量研究.结果显示,B i o -CS 修饰的PLGA 纳米粒呈规则球状形态;与PLGA 纳米粒相比其粒径有所增大,Z eta 电位变为正值;31%生物素取代度的B i o -CS 修饰的PLGA 纳米粒表面生物素含量为(1136?0134)L m o l/100m g 纳米粒.为后续B io -CS 修饰的PLGA 纳米粒的肿瘤靶向性研究提供数据支持.参考文献[1] Aw es h K.Y.,Pradeep M.,A nilK .M.,Pu s hpa M.,Sanyog J .,Govi nd P .A ..Nano m ed ici ne :NB M [J],2007,3(4):246)257[2] Zhang Z .,L ee S .H.,Feng S.S..B i o m aterial s[J],2007,28:1889)1899[3] F i scher S .,A ll m en E.U.,M en Y.W.,Groettrup M.,H ans P .M.,Gander B..B i o m aterial s[J],2007,28:994)1004[4] K ocbek P .,Ob er m ajer N.,C egn arM.,Janko K.,J u lijana K ..J .Con tro.l Rel ease[J ],2007,120:18)26[5] M undargia R . C.,Babua V.R.,Rangas w a m y V.,Prad i p P .,T ej rajM.A ..J .Con tro.l R el ease[J],2008,125:193)209[6] TaH.T.,D ass C.R.,Dunstan D . E..J .C on tro.l R elease[J],2008,126:205)216[7] H an H.D .,Song C.K.,Park Y .S .,Noh K.H.,K i m J .H.,Hw ang T .,K i m T .W.,Sh i n B .C ..Int .J .Ph ar m.[J],2008,35:27)34[8] Chatterj eea D .K .,Zhang Y..Sc.i Techno.l Adv .M ater .[J],2007,8:131)133[9] Chan P .,Ku ri sa w aM.,C hung J .E .,Yang Y.Y..B i o m aterials [J],2007,28:540)549[10] GUAN X-iPeng(官习鹏),QUAN D a -P i ng(全大萍),LI AO K a-iRong(廖凯荣),M AI K an -Cheng(麦堪成).C he m.J .Ch i nese Un-iversiti es(高等学校化学学报)[J],2006,27(10):1965)1968[11] Chen H.L .,Y angW.Z .,Ch en H.,L i u L .R.,Gao F .P .,Yang X.D .,Jiang Q .,Zh ang Q .Q.,W ang Y.S..C oll o i ds and Sur -faces B:B i oi n terfaces[J],2009,73:212)218[12] Langer R..Nat u re[J],1998,392:5)10[13] G regory R .J .,K i rsten M.,J ohn M.,John R .,Dav i d N..J .I n org .B ioche m.[J],2004,98(10):1625)1633[14] Y oges h B .P .,Udaya S .T .,Ay m an K .,M a L.,Panya m J ..B i o m aterials [J],2009,30:859)8661686高等学校化学学报 V o.l 31[15] Kun N.,Lee T. B.,Par k K.H.,Sh i n E .K .,LeeY. B.,C hoiH.K..Eur .J .Phar m.Sc.i [J],2003,18(2):165)173[16] Cheng C.,W eiH.,Bao X .,Ch engH.,L i C .,Gu Z .W.,Cheng S.X.,Zh ang X.Z .,Zhu o R .X..B i o m aterial s[J],2008,29(4):497)505[17] C ri sti na L.Z .,W illia m T.P ..J .Phar m.[J],2007,337(1/2):316)328[18] YAO Q i an(姚倩),HOU Sh-iX i ang(侯世祥),ZHANG Xuan(张宣),ZHAO Gang(赵钢),GOU X iao -Jun(苟小军),YOU Ji n-Zong(游金宗).A cta Ph ar m aceutica S i n i ca(药学学报)[J],2007,42(5):557)561[19] Y angW.J .,Cheng Y.Y .,Xu T .W.,W ang X.Y .,W en L .P ..E urop ean J ournal ofM ed ici nalCh e m istry[J],2009,44(2):862)868[20] M is h ra P .R.,Jai n N.K..In t .J .Phar m.[J],2002,231:145)153[21] Ru ss el-l Jones G.,M c T avis h K.,M cEw an J ..J .Inorg .B i oc h e m.[J],2004,98:1625)1633[22] X U Chang -Long(徐常龙),YAN P i ng(严平),W ANG L i n(王琳),AN Gan-C heng(安赣成).Ch e m ical In ter m ed i ate(化工中间体)[J ],2007,1:15)17[23] Sale m A.K.,Cann izz aro S.M.,Dav i esM. C..B i o m acromo l ecules[J],2001,2(2):575)580[24] Chen F . E.,JiaH.Q.,Chen X .X .,DaiH.F .,X i e B ..Che m.Phar m.Bu l.l [J],2005,53(7):743)746[25] Z HANG Can (张灿),DI NG Ya(丁娅),YANG B o(杨波),S H EN Jian(沈健).C hinese Journ alofN at uralM ed i ci n es(中国天然药物)[J ],2004,2(2):94)97Preparati on and Characterizati on of PLGA N anospheres SurfaceM odified w ith B i oti nylated ChitosanC HEN H ong -Li 1*,TANG H ong -Bo 2,YANG W en -Zhi 2,C H E N H an 2,WANG Y i n -Song 3,ME I L i n 4,5,Z HANG Tong 2,X I O NG Q i n g -Q i n g 2,Z HANG Q -i Q i n g 2*(1.H enan K ey Laboratory of H ere d itary D isease and M olecular T arget D rug T herapy (Cultivati ng B ase),D e p ar t m ent of L i fe Science and T echnology,X inx i ang M edical Universit y,X inx i ang 453003,Ch i na ;2.Instit u te of B i om e d ical Eng i neering,Chi nese A cade my of M edical Science ,P ek i ng Union M e d ical Co llege ,T ianjin 300192,Chi na ;3.Colle ge of Phar macy,T ianjin M edical Universit y,T ianjin 300070,Ch i na ;4.The Shenzhen K ey Lab of G ene and A ntibody Therapy,C enter for B io tech and B io-M edicine and D i vision ofL i fe Sciences ,Graduate Schoo l at Shenzhen ,T s i nghua Universit y,Shenzhen 518055,Ch i na ;5.Co llege of Phar m ac y,D ali anM e d ical U ni ver sit y,D ali an 116027,China )Abst ract B ioti n y l a ted ch itosan (B i o -CS con j u gates o r B io -CS )w ere synthesized and characterized .The deg ree o f substit u ti o n(DS),as defi n ed as t h e num ber o f bioti n per 100anhydroglucose un its of CS ,w as deter -m ined by 1H NMR and I CP .Po ly(lactic -co -g l y colic ac i d )(PLGA )nanospheres w ere prepared by a so l v en t evaporation techn i q ue(W 1/O /W 2).The surface of PLGA nanosphere w as m odified w ith B io -CS by covalen t bi n ding .PLGA nanospheres w ere al m ost spherica l i n shape under the scanning e lectron m icr oscopy (SE M )observation,and their m ean d ia m e ter deter m ined by the laser li g ht scatteri n g technique w as (24814?2110)n m.B io -CS m od ified PLGA nanospheresw ere a lso spherical i n shape ;t h e irm ean dia m eter and Z eta po tenti a l val u e w ere (26813?2314)nm and -(21121?2113)mV,respectively .The surface che m i s try o f nanosph -eresw as quantitatively st u died by X-ray photoelectron spectroscopy(XPS).The resu lts sho w t h e N reg i o n cor -respond i n g to the pri m ary a m ide o f CS and the S reg ion correspond i n g to the b i o ti n ,i n d icati n g that PLGA nanospheres w ere successfu lly surface -m odified w ith B i o -CS .The con tent of b i o ti n on the surface of B io -CS m odified PLGA nanospheresw it h DS o f b i o ti n of 31%w as deter m i n ed usi n g a co mm ercially ava ilable Quan*t Tag TM B iotin K it and its value w as (1136?0134)m ol/100m g .K eywords N anoparticle ;Po l y (lactic -co -g lyco li c ac i d )(PLGA );B i o ti n ylated ch itosan anticancer(Ed.:D,Z)1687 N o .8 陈红丽等:生物素化壳聚糖修饰的PLGA 纳米粒的制备及表征。

一种阳离子型两亲性壳聚糖纳米药物载体及其制备和应用[发明专利]

专利名称：一种阳离子型两亲性壳聚糖纳米药物载体及其制备和应用
专利类型：发明专利
发明人：马小军,周火飞,刘袖洞
申请号：CN201010213689.8
申请日：20100630
公开号：CN102309760A
公开日：
20120111
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种阳离子型两亲性壳聚糖纳米药物载体及其制备和应用，在壳聚糖分子上分别接枝亲油性小分子脱氧胆汁酸和亲水性小分子失水甘油基三甲基氯化铵，从而得到一种生物相容性好、可降解的两亲性壳聚糖材料。

在广泛pH溶液中，这种两亲性壳聚糖材料在超声条件下可以通过分子自组装的原理快速形成粒径150-350nm且分布均匀的纳米胶束，其内部亲油结构有利于提高脂溶性药物在水溶液中的溶解度，进而有望提高药物在体内的生物利用度。

该方法仪器设备要求简单、制备过程简单可控、易规模化。

因此适于制备紫杉醇、阿霉素、喜树碱、长春碱等价格昂贵且水溶性差、生物利用度差的抗肿瘤药物纳米载体释放系统，作为抗肿瘤药物新剂型有着广阔的市场前景和潜在的肿瘤临床治疗价值。

申请人：中国科学院大连化学物理研究所
地址：116023 辽宁省大连市中山路457号
国籍：CN
代理机构：沈阳科苑专利商标代理有限公司
代理人：马驰
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PLGA纳米微粒的制备及应用

Advances in Analytical Chemistry 分析化学进展, 2020, 10(4), 99-106Published Online November 2020 in Hans. /journal/aachttps:///10.12677/aac.2020.104015PLGA纳米微粒的制备及应用杨忆斐，刘天龙中国农业大学，动物医学院纳米病理学实验室，北京收稿日期：2020年10月12日；录用日期：2020年10月29日；发布日期：2020年11月5日摘要聚乳酸–乙醇酸共聚物(PLGA)作为药物传递系统的其中之一，已在疾病治疗以及生物组织工程中得以广泛应用。

PLGA作为FDA和欧洲药品局批准使用的注射药物系统，其安全性和有效性得到广泛证实，并在科学研究领域掀起热潮。

PLGA纳米粒包备药物较常规工艺制备药物在实现缓释、提高药效、减少用药量及不良反应等方面更具优势。

通过纳米颗粒的制备方法及表面修饰可增加难溶性物质的溶解度，提高药物与机体的免疫相容性，使药物更具穿透力及靶向性。

本文将对过往关于PLGA纳米粒的制备方法及PLGA 疾病治疗方面的应用进行总结与归纳，以便后人的初步了解与深入研究。

关键词PLGA纳米微球，制备方法，药物治疗，应用The Preparation and Application of PLGANanoparticlesYifei Yang, Tianlong LiuNanopathology Laboratory, College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, BeijingReceived: Oct. 12th, 2020; accepted: Oct. 29th, 2020; published: Nov. 5th, 2020AbstractPolylactic acid-glycolic acid copolymer (PLGA) as one of the drug delivery systems has been widely used in disease treatment and biological tissue engineering. As an injectable drug system ap-proved by the FDA and the European Medicines Agency, PLGA’s safety and effectiveness have been widely confirmed, and it has set off an upsurge in the field of scientific research. Compared with the drugs prepared by conventional processes, the use of PLGA nanoparticle to prepare drugs has杨忆斐，刘天龙more advantages in achieving sustained release, improving drug efficacy, reducing drug dosage and adverse reactions. The preparation methods and surface modification of nanoparticles can increase the solubility of insoluble substances, improve the histocompatibility of drugs, and make drugs more penetrating and targeted. This article will summarize the past preparation methods of PLGA nanoparticles and the application of PLGA disease treatment in order to facilitate the initial understanding and in-depth study of future researchers.KeywordsPLGA Nanoparticles, Preparation, Medical Treatment, Application Array Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc.This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0)./licenses/by/4.0/1. PLGA纳米微球概述PLGA因各种独特性质而备受瞩目，其配方更是被形容为能够适应各种亲水、疏水、大分子、小分子药物[1]，解决难溶于水的药物生物利用低的问题。

壳聚糖-聚天冬氨酸-5氟尿嘧啶纳米粒子的制备方法[发明专利]

专利名称：壳聚糖－聚天冬氨酸－5氟尿嘧啶纳米粒子的制备方法
专利类型：发明专利
发明人：杨武利,郑永丽,王春旭,府寿宽,董玲,沈锡中
申请号：CN200710170797.X
申请日：20071122
公开号：CN101181273A
公开日：
20080521
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明是一种制备壳聚糖聚天冬氨酸包载5－氟尿嘧啶纳米粒子的方法。

本发明中，利用壳聚糖和聚天冬氨酸形成离子复合物的过程对5－氟尿嘧啶进行包载，通过改变原料的分子量、摩尔配比以及反应条件等因素，在较温和的反应条件下制备了壳聚糖聚天冬氨酸包载5－氟尿嘧啶纳米粒子水分散体系，将其冷冻干燥后即得到纳米粒子粉状物。

本发明中壳聚糖聚天冬氨酸包载5－氟尿嘧啶水分散体系是分散均匀、形状为球形的纳米粒子。

本发明产物在水中能够重新分散成纳米粒子，具有一定的靶向和缓释性能。

本发明方法简单、原料易得，产品口服后，与市售口服制剂相比，其肠道吸收效率和生物利用度有明显提高，对恶性肿瘤具有较好的疗效。

申请人：复旦大学
地址：200433 上海市邯郸路220号
国籍：CN
代理机构：上海正旦专利代理有限公司
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以壳聚糖修饰PLGA的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗及其制备方法和应用[发明专利]

专利名称：以壳聚糖修饰PLGA的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗及其制备方法和应用
专利类型：发明专利
发明人：孙红武,顾江,张瑾,赵莉群,杨赟,王颖,高晨,韦金佞,程新,张卫军,邹全明
申请号：CN201910575081.0
申请日：20190628
公开号：CN110302369B
公开日：
20220429
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了以壳聚糖修饰PLGA的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗及其制备方法和应用，该纳米粒疫苗粒径为200nm～300nm，PdI值在0.02‑0.3之间；其制备方法如下：将Vo蛋白溶液加入含聚乙烯醇和多磷酸钠的溶液中，然后搅拌下加入丙酮溶解的聚乳酸‑羟基乙酸共聚物溶液，接着搅拌下加入冰醋酸溶解的壳聚糖溶液，充分分散，过滤，离心洗涤获得纳米粒疫苗；制得的该疫苗对大肠杆菌K1感染保护效果好，与Al(OH)3佐剂吸附的Vo疫苗相当，无显著统计学差异，可作为预防大肠杆菌K1感染引起相关疾病的疫苗，对大肠杆菌K1感染引起相关疾病的预防和治疗具有重要意义。

申请人：中国人民解放军陆军军医大学
地址：400037 重庆市沙坪坝区高滩岩正街30号
国籍：CN
代理机构：重庆航图知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：王贵君
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壳聚糖修饰二氧化硅载紫杉醇纳米粒的制备、释放及对a549细胞作用研究

基金项目:辽宁省教育厅青年科技人才育苗”项目,项目编号:JYTQN201919㊂　作者简介:曹艳瑕(1990),女,辽宁朝阳人,主管药师,在读硕士研究生,主要研究方向为纳米技术改善难溶性药物水溶性及新剂型研究㊂　通讯作者:吴超(1982),男,辽宁锦州人,副教授,博士学位,主要研究方向为纳米技术改善难溶性药物水溶性及新剂型研究㊂壳聚糖修饰二氧化硅载紫杉醇纳米粒的制备㊁释放及对A549细胞作用研究曹艳瑕1,2,吴超1,安宇3(1.锦州医科大学,辽宁锦州121000;2.朝阳市第二医院,辽宁朝阳122000;3.辽宁广播电视大学锦州分校,辽宁锦州121000) 摘要:目的　构建壳聚糖(chitosan ,CS )修饰介孔二氧化硅纳米粒(mesoporous silica nanoparticles ,MSN )载紫杉醇(paclitaxel ,PTX )的药物递送系统(CS-SS-MSN-PTX ),考察其氧化还原和pH 双响应性释药性能及对A549肺癌细胞抑制效果㊂方法　采用硅烷偶联剂和离子结合作用在介孔二氧化硅纳米粒上逐步引入巯基(-SH )㊁含有二硫键的羧基链(Py-SS-COOH )和壳聚糖(CS )以制备药物载体(CS-SS-MSN ),然后通过吸附法包载紫杉醇(PTX )制成药物递送系统(CS-SS-MSN-PTX )㊂通过透射电子显微镜㊁差示扫描量热法和傅里叶红外光谱法对载药系统进行表征,体外释放实验考察载药系统在不同条件下响应性释放行为,细胞实验考察CS-SS-MSN-PTX 对A549细胞的毒性作用㊂结果　CS-SS-MSN-PTX 的平均粒径为162.5nm ,载药量为25.32%㊂体外释放结果表明,在未添加谷胱甘肽(GSH )的pH =7.4缓冲液中,CS-SS-MSN-PTX 在72h 药物累计释放量为21.04%±1.85%,在pH =5.0为43.00%±1.36%,在添加GSH 的pH5.0的释放介质中PTX 的释放达到80.90%±2.23%㊂细胞实验表明CS-SS-MSN-PTX 比PTX 具有更高的肿瘤抑制作用㊂结论　CS-SS-MSN-PTX 兼具氧化还原和pH 敏感的双重响应释药特性,可作为抗肿瘤药物PTX 的理想载体㊂关键词:壳聚糖;介孔二氧化硅;A549;氧化还原;pH ;紫杉醇中图分类号:R944.9 文献标志码:A 文章编号:2096-305X (2020)02-0006-06The Study of the Preparation and Release of Paclitaxel Nanoparticles Loaded with SiliconDioxide and Modified with Chitosan and Their Effects on A549CellsCao Yanxia 1,2,Wu Chao 1,An Yu 3(1.Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000China;2.The Second Hospital of Chaoyang,Chaoyang 122000China;3.Jinzhou Branch of Liaoning Radio and Television University,Jinzhou 121000China)Abstract :Objective　To establish a drug delivery system of mesoporous silica nanoparticles modified by chitosan and loaded with paclitaxel,and investigate the drug release performance of its redox and pH dual-responsive drug release property and its inhibi⁃ting effect on A549cancer cells.Methods　Due to the fact that silane coupling agent and ion can be combined,the preparation ofdrug carrier was done through introducing sulfydryl,carboxyl with disulfide bond and chitosan into mesoporous silica nanoparticles and then the drug delivery system was established with paclitaxel-loaded PLGA via absorption.CS-SS-MSN-PTX was fully characterized by such technologies as transmission electron microscopy,differential scanning calorimetry and fourier transform infrared spectroscopy.The vitro release experiments were conducted to investigate the responsive realize behavior under different conditions and the vitro cells experiments were conducted to investigate the toxic effect of CS-SS-MSN-PTX on A549cells.Results　Mean particle size of CS-SS -MSN was 162.5nm,and drug loading efficiency was 25.32%.The vitro release results indicated that after 72h,the cumulative re⁃lease amount of CS-SS-MSN-PTX was 21.04%±1.85%in pH7.4PBS without addition of GSH and 43.00%±1.36%in pH5.0PBS.The cumulative release amount of PTX was 80.90%±2.23%in pH5.0with addition of GSH.The vitro cell experiments dem⁃onstrated that the tumor inhibiting effect of CS-SS-MSN-PTX is more powerful than PTX.Conclusion　The study has proved that CS -SS-MSN-PTX has both Redox and pH dual-responsive drug release property and could be used as a promising carrier for cancer ther⁃apy.6锦州医科大学学报J Jinzhou Medical University2020Apr.41(2)Key words:chitosan;mesoporous silica;A549;redox;pH;paclitaxel 近几十年,人们研发将抗癌药物选择性输送至肿瘤组织的药物递送系统(DDS)已取得一定成就,然而,避免药物在靶点之前提前释放以及药物经肿瘤细胞摄取后能够快速释放是提高药物治疗效果和降低毒副作用亟待解决的关键问题[1]㊂基于肿瘤内部或外部环境因素特点(诸如pH[2-3]㊁氧化还原[4-5]㊁酶[6-7]㊁温度[8]等)研发刺激响应型的智能DDS引起广泛关注㊂介孔二氧化硅纳米粒(MSN)具有表面积大㊁孔径可调㊁生物相容性好及表面易于修饰等优势,作为刺激响应性DDS的药物载体表现出巨大潜力㊂研究表明大多数肿瘤细胞内部环境具有两个特点:(1)肿瘤细胞胞浆中谷胱甘肽(GSH)浓度至少比正常细胞高3倍[3,9-10]9428-9439,二硫键在细胞内液体中易被GSH 裂解;(2)肿瘤细胞的pH值(5.0~7.0)低于正常细胞的pH值[11-12]㊂这对于研发氧化还原和pH 双重刺激响应性DDS具有重要意义㊂壳聚糖(CS)是一种具有良好生物相容性和生物可降解性的阳离子聚合物,具有良好的生物相容性㊁生物降解性和高度的pH敏感性[2,13-14]1-16㊂因此,本研究设计CS-SS-MSN作为难溶性广谱抗肿瘤药物PTX 的药物载体实现PTX在肿瘤细胞中双重刺激响应性释放,旨在改善PTX的水溶解度和提高其生物利用度㊁降低其对正常组织细胞的毒副作用㊂探索该递送系统对A549细胞的体外抗肿瘤效果㊂1　仪器与材料AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)㊁KQ-250B型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)㊁DF-101S恒温磁力搅拌器(郑州市亚荣仪器有限公司)㊁TG22-WS台式高速离心机(上海赵迪生物科技有限公司)㊁JEM-1010透射电镜(日本电子株式会社)㊁BT-Zeta100型Zeta电位纳米粒度分子量分析仪(丹东百特仪器有限公司)㊁IRAffinity-1红外光谱仪㊁LC-2030高效液相色谱仪(日本岛津公司)㊁HS-DSC-101差示扫描量热仪(上海和晟仪器科技有限公司)㊁HBS-1096酶标分析仪(深圳良谊仪器有限公司)㊁Cyt⁃oFLEX流式细胞仪(贝克曼柯尔特商贸(中国)有限公司)㊁ZEISS LSM700激光共聚焦显微镜(上海莱瑟光谱仪器分析技术有限公司)㊂紫杉醇PTX(纯度≥98%,西安天丰生物科技有限公司,批号批号:20151015),壳聚糖(纯度≥98%,山东福瑞达生物化工有限公司),十六烷基三甲溴化铵(CTAB),正硅酸乙酯(TEOS),3-巯基丙基-三甲氧基硅烷(MPTMS)(阿拉丁)㊁十二烷基硫酸钠(SDS)㊁谷胱甘肽(GSH)(国药集团化学试剂有限公司),甲醇(色谱醇,天津光复精细化工有限公司),噻唑兰(MTT),Hoechst 33342,罗丹明鬼笔环肽,异硫氰酸荧光素(FITC),胰酶,RPMI-1640培养基(北京鼎国昌盛生物科技有限公司),Annexin V-FITC凋亡试剂盒(南京建成生物工程研究所),其余试剂为市售分析纯㊂2　方法与结果2.1　CS-SS-MSN的制备[7,15]147-1562.1.1　MSN-SH的制备取1g CTAB㊁200mL去离子水和80mL氨水溶液置于锥形瓶,混合溶液在室温条件下搅拌30 min至混合均匀,然后在20min内滴加5mL TEOS㊂搅拌12h后将混合物离心,沉淀物经水洗3次后干燥,产物在550℃的空气氛围下煅烧5h 即得MSN㊂取适量MSN分散于60mL无水乙醇中,再加入1mL MPTMS㊂77℃的N2氛围下回流12h,沉淀物经无水乙醇洗涤3次后干燥,即得到巯基功能化MSN(MSN-SH)㊂2.1.2　MSN-SS-COOH的制备将2,2’-二吡啶基二硫醚溶于THF中,然后加入NaHCO3溶液20mL和3-硫基丙酸的THF溶液10mL,搅拌4h后蒸发除去混合物中的THF,经二氯甲烷洗涤3次后,并调节pH至2.0~3.0进行沉淀㊂通过乙酸乙酯萃取,干燥后即得白色沉淀物(Py-SS-COOH)㊂然后将MSN-SH分散在25 mL无水乙醇中,加入50mg Py-SS-COOH,室温搅拌24h,离心收集产物,经无水乙醇洗涤3次后干燥㊂即得产物MSN-SS-COOH㊂2.1.3　CS-SS-MSN的制备将0.2g CS溶于2%醋酸溶液中搅拌4h至CS 完全溶解㊂然后加入MSN-SS-COOH搅拌24h,混合物经离心,沉淀物经蒸馏水和无水乙醇各洗涤3次,干燥即得CS-SS-MSN㊂2.1.4　载药采用吸附平衡法制备进行载药㊂取200mg CS -SS-MSN/MSN混悬于PTX的二氯甲烷溶液中(2 mL,100mg/mL),超声分散后搅拌24h㊂产物经7曹艳瑕,等:壳聚糖修饰二氧化硅载紫杉醇纳米粒的制备㊁释放及对A549细胞作用研究离心㊁干燥,即得CS-SS-MSN-PTX/MSN-PTX㊂精密称量5.0mg CS-SS-MSN-PTX/MSN-PTX置于10mL容量瓶,加甲醇溶解并稀释至刻度㊂静置1h,离心,取上清液为供试品,HPLC法测定PTX 浓度并计算载药量㊂2.2　表征2.2.1　TEM采用透射电子显微镜观察MSN-SH的形貌和介孔结构㊂2.2.2　FT-IR采用傅立叶红外分光光谱仪检测CS -SS-MSN-PTX的修饰情况㊂2.2.3　DSC采用差示扫描量热法检测PTX在CS-SS-MSN-PTX中存在状态㊂2.3　体外响应性释放实验2.3.1　pH和氧化还原响应性体外释放度考察按照‘中华人民共和国药典“2015版释放度测定法第二法㊂考察CS-SS-MSN-PTX的pH和氧化还原响应性释放㊂精密称量相当于3.0mg PTX 的PTX㊁MSN-PTX㊁CS-SS-MSN-PTX分散于pH =7.4PBS㊁pH=5.0PBS㊁pH=7.4PBS(10mM GSH)和pH=5.0PBS(10Mm GSH)4种不同释放介质㊂释放条件如下:温度为37.0℃,转速为100rpm㊂投药后按照预定时间(1㊁2㊁4㊁6㊁8㊁12㊁24㊁36㊁48㊁72h)取样4mL,取样后补充等量空白释放介质㊂通过HPLC法对PTX进行定量分析,计算PTX的累积释放度㊂2.3.2　色谱条件色谱柱为Agilent TC-C18(250mm×4.6mm, 5μm);流动相为甲醇-水(65∶35);流速为1 mL/min;检测波长为227nm,柱温为30℃,进样量为20μL㊂2.4　体外细胞实验2.4.1　细胞培养A549细胞置于1640培养基培养(10%胎牛血清㊁100U/mL青霉素和1%链霉素)㊂培养环境:温度为37℃,5%二氧化碳㊂每隔两天更换1次培养基㊂细胞传代过程中采用0.25%胰蛋白酶进行消化㊂2.4.2　细胞摄取实验首先采用FITC对CS-SS-MSN进行标记㊂具体方法:将2mg FITC分散在2mL乙醇中并搅拌至完全溶解,然后将100mg CS-SS-MSN分散于FITC乙醇溶液(1mg/mL),避光搅拌24h后,离心收集产物,产物经无水乙醇洗涤至上清液无色,即得FITC-CS-SS-MSN㊂将细胞密度为5×104的A549细胞接种于共聚焦皿㊂配制50μg/mL FITC-CS-SS-MSN混悬液加入共聚焦皿,在37℃培养1㊁2h后弃去培养基,PBS洗涤3次,经4%多聚甲醛溶液固定10min㊂0.1%Triton X-100于4℃培养10min,1%的白蛋白在37℃封闭30min后染色㊂最后荧光共聚焦显微镜下观察A549细胞对FITC-CS-SS-MSN的摄取情况㊂2.4.3　细胞毒性实验将细胞密度为1×104的A549细胞接种于96孔板,37℃孵育24h㊂精密称取MSN㊁CS-SS-MSN㊁PTX㊁MSN-PTX和CS-SS-MSN-PTX(相当于1mg的PTX),将样品分散于2%HPMC,加入适量RPMI-1640培养基稀释成不同浓度药物溶液,各浓度设置6个复孔,各复孔加100μL的药物溶液,同时以空白培养基作为对照㊂培养48h 后各孔加5mg/mL MTT溶液20μL,孵育4h弃去培养基,加150μL DMSO,通过酶标仪在OD=492 nm处对细胞活率定量分析㊂3　结果与讨论3.1　CS-SS-MSN-PTX的制备3.1.1　CS-SS-MSN的制备通过在MSN表面修饰二硫键与CS制备的CS-SS-MSN见图1㊂首先,采用硅烷偶联剂MPTMS 使MSN表面修饰巯基制备MSN-SH㊂进一步利用Py-SS-COOH和巯基间的交换反应制备MSN-SS-COOH㊂最后通过MSN的羧基与CS的氨基之间的酰胺化反应将CS以共价键连接到MSN的表面㊂3.1.2　载药通过HPLC对载药量进行定量分析㊂MSN-SH -PTX载药量为27.76%±2.07%,CS-SS-MSN-PTX的载药量为25.32%±2.36%㊂CS-SS-MSN-PTX载药量稍有减少的原因归结于修饰过程中CS 封堵MSN部分介孔孔道㊂3.2　表征3.2.1　TEM通过TEM对制备的MSN-SH的形貌进行表征㊂见图2,MSN-SH呈单分散的球形颗粒,介孔结构清晰,粒径分布约为130nm㊂丰富的介孔结构提供足够的空间来容纳药物分子并有效限制药物粒径,一定程度上改善水难溶性药物PTX的溶解度和溶出速率㊂8锦州医科大学学报　2020年4月,41(2)图1　MSN-SS-CS的制备流程示意图图2　MSN-SH 的透射电镜图3.2.2　FT-IR通过红外光谱仪对CS-SS-MSN 的合成过程进行表征㊂见图3,与MSN-SH 相比,羧基特征峰在1718cm -1处出现表明MSN 表面成功引入Py -SS -COOH㊂另外酰胺键特征峰在1650cm -1处出现,1718cm -1特征峰减弱表明羧基基团的显著减少是与CS 的氨基发生酰胺化反应,表明CS -SS -MSN 成功被制备㊂图3　MSN-SH ㊁MSN-SS-COOH 和CS-SS-MSN 的红外光谱图3.2.3　DSC通过差式扫描量热法对样品PTX㊁MSN -SH㊁CS-SS-MSN㊁MSN-SH-PTX㊁CS-SS-MSN-PTX㊁PM (MSN-SH 和PTX 物理混合)和CSPM (CS -SS-MSN 与PTX 的物理混合)进行检测,结果见图4㊂结果表明:PTX 的熔融吸热峰在223℃,同时该熔融吸热峰在PM 和CSPM 样品中可见,表明将PTX 和MSN-SH㊁CS-SS-MSN 物理混合方式未能改变PTX 的晶型状态,然而空白载体和载药系统中均未见PTX 的熔融吸热峰,表明PTX 以无定型状态负载于MSN-SH㊁CS-SS-MSN 的介孔结构㊂无定型状态的水难溶性药物PTX 无晶格能的束缚,其溶解度和溶出速率将得到显著改善㊂图4　PTX ㊁药物载体和载药体系的DSC 曲线图3.3　体外响应性释放实验通过两种pH =7.4和pH =5.0的PBS 中是否添加10mM 的GSH 作为不同的释放条件来测定MSN-SH-PTX 和MSN-SS-CS-PTX 中PTX 的累积释放度,评价MSN-SS-CS-PTX 的氧化还原和pH 双重响应性药物释放特性,结果见图5㊂MSN-SH -PTX 在pH =7.4和pH =5.0的PBS 中72h 药物累积释放量分别为82.62%±2.85%和83.79%±2.66%㊂表明MSN -SH 显著改善水难溶性药物PTX 的溶出速率,进一步验证了DSC 的结果㊂在不添加10mM GSH 的情况下,MSN-SS -CS -PTX 在pH =5.0的PBS 中累积释放量为43.00%±1.36%显著高于pH =7.4的21.04%±1.85%,表明MSN-SS-CS-PTX 在酸性环境中有利于PTX 的释放,MSN-SS-CS-PTX 表现出敏感pH 响应药物9曹艳瑕,等:壳聚糖修饰二氧化硅载紫杉醇纳米粒的制备㊁释放及对A549细胞作用研究释放特性主要是源于MSN 表面经CS 修饰后具备CS 的特性,在酸性条件下CS 膨胀溶解,从而打开MSN 的介孔孔道促进负载的PTX 释放㊂而在中性条件无此特性,CS 对负载的PTX 产生屏蔽作用,阻碍PTX 释放㊂此外,在添加10mM GSH 的情况下,PTX 的释放速率和累积释放度进一步显著增加,在pH =5.0为80.90%±2.23%和pH =7.4为35.18%±2.09%㊂同比无GSH 组,MSN-SS -CS -PTX 表现出敏感氧化还原响应性药物释放特性㊂这是因为GSH 将MSN-SS-CS-PTX 的-SS-还原为-SH,二硫键的裂解导致修饰在MSN 表面的CS 脱落,使负载PTX 直接暴露在释放介质中,通过MSN 的孔道更快更直接的释放㊂总之,基于肿瘤细胞中的pH 低于正常细胞中的pH,肿瘤细胞内GSH 的浓度显著高于正常细胞中的水平,MSN-SS -CS-PTX 通过二硫键和CS 的氧化还原和pH 响应性调控PTX 在到达肿瘤部位之前释放和到达肿瘤细胞内快速释放的特性对于提高PTX 生物利用度和降低其毒副作用具有重要意义㊂图5　MSN-SS-CS-PTX and MSN-SH-PTX 的累积释放率pH =7.4PBS (A )和pH =5.0PBS (B )3.4　细胞实验3.4.1　细胞摄取实验通过CLSM 观察A549细胞在1㊁2h 对FITC-MSN-SS-CS 的摄取情况㊂结果见图6,根据图中荧光变化的情况表明FITC-MSN-SS-CS 能够通过细胞膜进入细胞质,且呈时间依赖性㊂图6　A549细胞摄取的激光共聚焦图像3.4.2　细胞毒性实验通过MTT 法考察系列浓度的空白载体MSN -SH 和MSN-SS-CS 对A549细胞的作用结果评价空白载体对A549细胞的生物相容性㊂结果见图7(A),A549细胞与浓度(5~500μg /mL)的MSN-SS-CS 和MSN-SH 孵育48h 后表现出轻微的毒性,但细胞存活率均高于80%,表明空白载体MSN-SS-CS 和MSN-SH 对A549细胞具有良好的生物相容性㊂通过系列浓度的PTX㊁MSN -SH -PTX 和MSN-SS-CS-PTX 对A549细胞的细胞抑制率评价细胞毒性,结果见图7(B)㊂PTX㊁MSN -SH-PTX 和MSN-SS-CS-PTX 共同孵育的A549细胞在5~500ng /mL 的PTX 表现出细胞毒性呈浓度依赖性,且在同一浓度条件的细胞抑制率情况为MSN-SS-CS-PTX>MSN-SH-PTX>PTX㊂这是基于实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR 效应),MSN -SS-CS-PTX 和MSN-SH-PTX 的纳米效应较PTX更易浓集于A549细胞,更重要的是MSN-SS-CS-PTX 在CS 和二硫键的作用下避免了PTX 在进入A549细胞内提前释放,进一步提高A549细胞内PTX 浓度,导致MSN-SS-CS-PTX 对A549细胞抑制效果优于MSN-SH-PTX㊂01锦州医科大学学报　2020年4月,41(2)图7　空白载体及载药系统对A549的细胞存活率和抑制率4　结论本研究成功制备氧化还原和pH双刺激响应型药物递送系统MSN-SS-CS-PTX,PTX负载到MSN-SS-CS的介孔结构中,其溶解度和溶出速率得到显著改善㊂体外释放结果表明MSN-SS-CS-PTX 显示出氧化还原和pH双刺激响应性药物释放特性㊂细胞实验结果表明MSN-SS-CS-PTX对A549表现出显著的抑制作用㊂综上所述MSN-SS-CS是具有氧化还原和pH双刺激响应性释放的药物载体,为改善疏水性化疗药物疗效及降低毒副作用提供有效解决途径㊂参考文献:[1]　Fan W,Yung B,Huang P,et al.Nanotechnology for multimo⁃dal synergistic cancer therapy[J].Chem Rev,2017,117(22):13566-13638.[2]　Zhao RR,Li T,Zheng GR,et al.Simultaneous inhibition ofgrowth and metastasis of hepatocellular carcinoma by co-deliveryof ursolic acid and sorafenib using lactobionic acid modified andpH-sensitive chitosan-conjugated mesoporous silica nanocomplex[J].Biomaterials,2017,143(2):1-16.[3]　Jiang K,Chi T,Li T,et al.A smart pH-responsive nano-car⁃rier as a drug delivery system for the targeted delivery of ursolicacid:suppresses cancer growth and metastasis by modulatingP53/MMP-9/PTEN/CD44mediated multiple signaling pathways[J].Nanoscale,2017,9(27):9428-9439.[4]　Lin JT,Liu ZK,Zhu QL,et al.Redox-responsive nanocarri⁃ers for drug and gene co-delivery based on chitosan derivativesmodified mesoporous silica nanoparticles[J].Colloids Surf BBiointerfaces,2017,155:41-50.[5]　Liu JJ,Guo XM,Luo Z,et al.Hierarchically stimuli-respon⁃sive nanovectors for improved tumor penetration and programedtumor therapy[J].Nanoscale,2018,10(28):13737-13750.[6]　Nairi V,Magnolia S,Piludu M,et al.Mesoporous silica nan⁃oparticles functionalized with hyaluronic acid.effect of the bio⁃polymer chain length on cell internalization[J].Colloids Surf BBiointerfaces,2018,168:50-59.[7]　ZHAO QF,LIU J,ZHU WQ,et al.Dual-stimuli responsivehyaluronic acid-conjugated mesoporous silica for targeted deliveryto CD44-overexpressing cancer cells[J].Acta Biomater,2015,23:147-156.[8]　Liu XM,Yang TS,Han YF,et al.In situ growth of cus/SiO2-based multifunctional nanotherapeutic agents for combined pho⁃todynamic/photothermal cancer therapy[J].ACS Appl MaterInterfaces,2018,10(37):31008-31018.[9]　Cai X,Yang X,Wang F,et al.Multifunctional pH-respon⁃sive folate receptor mediated polymer nanoparticles for drug deliv⁃ery[J].Journal of biomedical nanotechnology,2016,12(7):1453-1462.[10]　Zhang P,Wang J,Huang H,et al.RuNH2@AuNPs as two-photon luminescent probes for thiols in living cells and tissues[J].Biomaterials,2014,35(32):9003-9011. [11]　Cai XQ,Yang XY,Wang FC.et al.Multifunctional ph-re⁃sponsive folate receptor mediated polymer nanoparticles for drugdelivery[J].Biomed.Nanotechnol,2016,12(7):1453-1462.[12]　Shah PV,Rajput SJ.Synthesis ofchitosan capped mesoporoussilica nanoparticles:a pH responsive smart delivery Platform forraloxifene hydrochloride[J].AAPS PharmSciTech,2018,19(3):1344-1357.[13]　Ramasamy D Li,Puhakka V,Iftekhar S,et al.N-and O-ligand doped mesoporous silica-chitosan hybrid beads for the ef⁃ficient,sustainable and selective recovery of rare earth elements(REE)from acid mine drainage(AMD):Understanding thesignificance of physical modification and conditioning of the pol⁃ymer[J].Hazard Mater,2018,348:84-91. [14]　Zhang S,Xu L,Liu H,et al.Adual template method for syn⁃thesizing hollow silica spheres with mesoporous shells[J].Ma⁃terials Letters,2009,63(2):258-259.[15]　Liu H,Wang G,Park J,et al.Electrochemical performanceofα-Fe2O3nanorods as anode material for lithium-ion cells[J].electrochimica acta,2009,54(6):1733-1736.收稿日期:2020-01-0211曹艳瑕,等:壳聚糖修饰二氧化硅载紫杉醇纳米粒的制备㊁释放及对A549细胞作用研究。

壳聚糖修饰的PLGA纳米粒作为蛋白多肽类药物载体的研究

２．２纳米粒的制备
采用改良溶剂挥发法制备纳米粒…］：将２０ｍｇＢＳＡ溶于０．５ｍＬ磷酸盐缓冲液（ｐＨ值为７．２）中，转入ＰＬＧＡ的二氯甲烷溶液中，超声形成初乳，将初乳
转入２０ｍＬ１％ＰＶＡ溶液中，再次超声形成复乳，搅拌
４ｈ，待有机溶剂挥发后１８，０００ｒ／ｍｉｎ离心收集纳米粒，冷冻干燥即得ＰＬＧＡ
ＮＰ。
２．２．１吸附法修饰纳米粒根据前期的研究工作【１１。，在上述制备ＰＩ，ＧＡ纳米粒的过程中，０．５％ＰＶＡ水溶液中含１００ｍｇＣＳ醋酸溶液，一起作为外水相。其余步骤和方法同前。２．２．２共价交联法修饰纳米粒称取１００ｍｇ制备好的ＰＩ。ＧＡＮＰ，加入ＰＢＳ（ｐＨ５．ｏ）中分散均匀，加入ＥＤＣ活化纳米粒表面的羧基，然后加入１００ｍｇＣＳ，室温搅拌反应２４ｈ，离心收集纳
米粒。
＊基金项目：国家重大科学研究计划资助项目（２００６ＣＢ９３３３００）；新乡医学院省级重点学科开放课题资助项目（ＺＤ２００９４４）
收到初稿Ｅｔ期：２０ｌｏ—０４—２２收到修改稿日期：２０１０１２—１４通讯作者：陈红咐，张其清
作者简介：陈红丽（１９７８一），女，河南安阳人，博士，讲师。师承张其清教授，从事生物医用材料和纳米药物载体的研究。
构成及键台状卷等＾面的信息，ＰＬＧＡＮＰ表面来十龟测到氨元素信号，面ＡＤＣＳＮＰ及ＣＢＣＳＮＰ均检测到氟元素的信号（罔２）。由于所用材料中只有ＣＳ含有
万方数据
助
锨
材
料
２０ｌ１年第２期（４２）卷
表１纳米粒性质表征
Ｔａｂｌｅ１Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｏｆｔｈｅｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ纳米粒
壳聚糖cs是自然界存在唯一带正电荷的天然多糖具有良好的生物相容性可生物降解性和组织黏附性被用作化学药物抗体蛋白多肽及基因类药物的载体710本文以plga为载体材料以牛血清白蛋白bsa为多肽蛋白质模型药物采用溶剂挥发法制备了plga纳米粒选择cs分别采用直接吸附法修饰纳米粒adcsnp以及共价联接法修饰纳米cbcsnp粒表面对纳米粒的理化性质及bsa的包封率释药性质等进行了考察对两种方法修饰的纳米粒中bsa的构型变化比较研究为不同修饰方式制备的纳米粒作为蛋白多肽类药物载体的研究提供了参考依21主要原料与仪器plga末端未封端mw为105050山东省医疗器械研究所壳聚糖低分子量脱乙酰度85sigma牛血清白蛋白6300065000北京鼎国生物有限公司bca白检测试剂盒pierce其余试剂均为分析纯

叶酸壳寡糖修饰的PLGA紫杉醇纳米粒的制备与表征

叶酸壳寡糖修饰的PLGA紫杉醇纳米粒的制备与表征邓艾平;王奕;胡振夏;符旭东【摘要】目的制备叶酸受体介导的靶向肿瘤细胞的叶酸耦联壳寡糖的聚合物纳米粒.方法用1-乙基-(3-二甲氨基丙基)-碳酰二亚胺(EDC)活化叶酸上的羧基,与壳寡糖上的氨基连接合成叶酸壳寡糖(F-CS),以端羧基聚乳酸羟基乙酸共聚物为原料制备纳米粒(PLGA-NPs),用EDC活化PLGA-NPs表面的羧基,使其与叶酸壳寡糖上的氨基连接制备成叶酸壳寡糖的PLGA纳米粒(F-CS-PLGA-NPs).采用紫外和红外光谱法对F-CS和F-CS-PLGA-NPs进行定性分析,紫外分光光度法测定叶酸的耦联率,扫描电镜观察F-CS-PLGA-NPs的形态,激光粒度仪测定粒径及Zeta电位,HPLC测量载药量.结果成功制备F-CS和F-CS-PLGA-NPs,其叶酸耦联率分别为24.39%和8.87%,F-CS-PLGA-NPs的粒径为(321.00±0.76) nm,电位为(22.60±0.26) mV,载药量(5.10±0.25)%.结论 F-CS-PLGA-NPs的制备工艺可行.【期刊名称】《医药导报》【年(卷),期】2013(032)012【总页数】4页(P1630-1633)【关键词】叶酸;壳寡糖;PLGA;纳米粒【作者】邓艾平;王奕;胡振夏;符旭东【作者单位】武汉市中心医院药剂科,武汉,430014;武汉市中心医院药剂科,武汉,430014;广州军区武汉总医院药剂科,武汉,430070;广州军区武汉总医院药剂科,武汉,430070【正文语种】中文【中图分类】R944.9紫杉醇(paclitaxel)临床主要用于卵巢癌和乳腺癌的治疗，使用较多的是紫杉醇注射剂，由于缺乏靶向性，副作用较大[1]，且患者首次化疗后，体内残存的肿瘤细胞易对紫杉醇产生极度耐药[2]。

因此构建一种既可减少不良反应又能减小耐药性发生的主动靶向纳米药物载体具有重要的意义。

壳聚糖药用纳米粒子的制备及性能研究

壳聚糖药用纳米粒子的制备及性能研究张金秋;包木太;刘占军【期刊名称】《青岛科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(032)006【摘要】应用壳聚糖与甲基丙烯酸甲酯(MMA)通过自由基聚合反应,以硝酸铈铵为引发剂合成一种功能新颖的药用纳米粒子,作为药物的载体材料,与药物结合后可以调节药物释放速度,减少给药次数,从而增加药物治疗的安全性、高效性和可靠性.研究结果表明,硝酸铈铵可以较好地引发接枝反应,当反应温度为50℃,反应时间为4h,壳聚糖0.6g、甲基丙烯酸甲酯6 mL、硝酸铈铵0.9g、1％醋酸300 mL时,合成的纳米粒粒径最小,平均粒径在179 nm左右.体外溶出实验表明,当n(阿司匹林):n(壳聚糖)=1:1时,制备出的纳米粒载药量、包封率较高,可达72.1％,载药纳米粒在16h内对药物有良好的缓释作用,具有较好的应用前景.%Chitosan and methyl methacrylate(MMA) were prepared into novel-functional medical nanoparticles through radical polymerization. Nanoparticles loaded with medicine can regulate degree of releasing, and reduce deliver time, in order to increase safety, high-effect and dependment of medication as a carrier material of medicine. It is showed that ammonium ceric nitrate is a good initiator in graft reaction. The grain diameter of compounded nanoparticle is minimized into 179 nm on average when temperature is 50 ℃ , reacting time 4 h, chitosan 0.6 g, MMA 6 mL, ammonium ceric nitrate 0. 9 g, and 1% acetic acid 300 mL. The vitrorelease test shows that the drug-loading rate and envelop rate is up to 72. 1%, and nanoparticlesworks well in sustained-releasing medicine when the proportion of aspirin and chitosan reaches 1:1.【总页数】5页(P551-555)【作者】张金秋;包木太;刘占军【作者单位】中国海洋大学海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室,山东青岛266100;中国海洋大学海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室,山东青岛266100;河北联合大学药学院,河北唐山063000【正文语种】中文【中图分类】O636.1【相关文献】1.金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的制备与释放性能研究 [J], 王莹;张龙;刘天晴2.印楝素/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖纳米粒子的制备、性能与表征 [J], 殷旭东;张子勇3.Zn2＋离子印迹Fe3 O4-壳聚糖纳米粒子的制备及对Zn2＋吸附性能的研究 [J], 陈志军;郝营;杨清香;张翔;齐连怀;汤凯;朱海燕;王丹4.苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖纳米粒子的制备及性能表征 [J], 殷旭东;张子勇5.壳聚糖包裹紫杉醇纳米粒子的制备及性能研究 [J], 李芳;李艳;李佳咛;牛苏梅;马倩倩;巴秋杰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

壳聚糖修饰的神经毒素纳米粒的制备及体外释放研究

壳聚糖修饰的神经毒素纳米粒的制备及体外释放研究柴国宝;魏颖慧;冯健;程巧鸳;李范珠【期刊名称】《中国药科大学学报》【年(卷),期】2009(40)2【摘要】目的:制备粒径小、形态均匀、包封率较高、带稳定正电荷的神经毒素纳米粒并研究其体外释放行为。

方法:选用聚乳酸为载体,壳聚糖为修饰物,采用复乳法制备神经毒素纳米粒,在单因素试验的基础上结合正交试验优化纳米粒的制备工艺,并对其体外释药特性进行研究。

结果:采用优化方法制备的纳米粒粒径较小(140.5nm),形态规则,大小均匀,包封率高(83.5%),Zeta电位为+30.5mV;体外释药行为符合Weibull方程。

结论:建立的制备工艺可行,所得纳米粒包封率高,大小均匀,体外释药具有明显的缓释特征。

【总页数】4页(P116-119)【关键词】神经毒素;纳米粒;壳聚糖;复乳法;体外释放【作者】柴国宝;魏颖慧;冯健;程巧鸳;李范珠【作者单位】浙江中医药大学药学院【正文语种】中文【中图分类】R944【相关文献】1.更昔洛韦壳聚糖纳米粒眼用温敏型原位凝胶的制备与体外释放度研究 [J], 张静静;王柏2.载纳豆激酶的三甲基壳聚糖纳米粒的制备及体外释放度研究Δ [J], 廖杰;任晓婷;尹宗宁3.麦胚凝集素修饰的 EGCG-明胶-壳聚糖纳米粒的制备、表征及体外抗肿瘤活性研究 [J], 陈婷;李国源;毕春洋;李俊松;乔宏志4.壳聚糖修饰二氧化硅载紫杉醇纳米粒的制备、释放及对A549细胞作用研究 [J], 曹艳瑕; 吴超; 安宇5.壳聚糖修饰二氧化硅载紫杉醇纳米粒的制备、释放及对A549细胞作用研究 [J], 曹艳瑕; 吴超; 安宇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

壳聚糖γ-聚谷氨酸负载溶菌酶复合纳米粒子制备及抗菌性能研究【开题报告】

毕业论文开题报告高分子材料与工程壳聚糖/γ-聚谷氨酸负载溶菌酶复合纳米粒子制备及抗菌性能研究一、选题的背景和意义壳聚糖（chitosan）又称可溶性甲壳质、甲壳胺、几丁聚糖等，是由自然界广泛存在的甲壳质经脱乙酰反应后得到，其化学名称为β-(1，4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，是一种线性多糖。

壳聚糖作为一种带正电荷的天然多糖，其具有无毒、无刺激性、无致敏性、无致突变作用，降解产物为低分子壳寡糖和葡萄糖胺，具有良好的生物相容性和生物降解性。

壳聚糖是应用广泛的新型药用辅料之一，作为药物载体可以控制药物释放、增加药物吸收、降低药物毒副作用，提高疏水性药物对细胞膜的通透性和药物的稳定性及改变给药途径，还可以加强制剂的靶向给药能力。

在药物载体等研究领域壳聚糖将具有广泛的应用前景。

γ- 聚谷氨酸是一种生物可降解大分子，在生物体内能降解为谷氨酸而直接被吸收，生物相容性优良、低免疫原性、无毒副作用，这是其他材料所不可比拟的；水溶性极好，可增加药物的溶解性；主链上存在大量易修饰的羧基，可以提高载药量，也可以进行功能化修饰，形成性能更佳的衍生物；为弱阴离子型聚合大分子，能够在血液循环中保留较长时间，对靶向给药具有重要意义。

二、研究目标与主要内容（含论文提纲）壳聚糖/γ-聚谷氨酸因其具有良好的生物学特性而成为药物载体研究的热点。

药物经过壳聚糖/γ-聚谷氨酸负载后，不仅能够达到缓释控释的目的，还能够改变药物的给药方式，以此减少给药次数，降低药物不良反应，提高药物生物利用度。

本论文旨在研究：（1）壳聚糖/γ-聚谷氨酸负载溶菌酶复合纳米粒子的可行性；（2）壳聚糖/γ-聚谷氨酸负载溶菌酶复合纳米粒子的载药量和包封率；（3）壳聚糖/γ-聚谷氨酸负载溶菌酶复合纳米粒子的药物释放率。

论文提纲：1前言1.1研究背景1.2研究方案2实验部分2.1药品与仪器2.2实验步骤2.2.1找到壳聚糖和聚谷氨酸混合不出现凝胶的最佳比例2.2.2聚谷氨酸和溶菌酶相互作用制备纳米2.2.3 再包裹纳米粒子的制备方法一2.2.4再包裹纳米粒子的制备方法二2.2.5再包裹纳米粒子的制备方法三2.2.6测定载药量和包封率2.2.7体外释放2.2.8红外光谱分析2.2.9热分析3结果与讨论4结论5参考文献6致谢三、拟采取的研究方法、研究手段及技术路线、实验方案等壳聚糖分子中存在氨基和羟基，它们均具有较高的反应活性。

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用于负载 DNA 分子。 Yamomo to 等 [ 12 ] 利用此方法制备了此种纳米微球用于黏附型肺黏膜降钙素给药 ,并且证明可以促进药物的吸收并且增加药物作用时间。壳聚糖修饰的阳离子 PLGA 纳米微球 ,并以化学键合的方式用于负载水溶性蛋白药物的纳米微球的报道尚未出现。
本文以溶菌酶为模型蛋白 ,将改性 PLGA 与溶菌酶通过化学键结合并以 CHS修饰得到一种新型阳离子纳米微球 ,达到增大纳米微球的包封率、载药量并促进蛋白类药物吸收的目的。
取 240μL 的 Lysozyme - PLGA 的 DM SO 溶液 , 配成 6mL , PLGA 质量浓度为 5mg /mL 的油相溶液 , DM SO ( 40% ) 、二氯甲烷 ( 4315% ) 和丙酮 (1615% ) ,后将油相溶液加入到 24 mL 含 1%的 PVA , 013% CHS的水相溶液中 [ 9 - 11 ] ,冰浴间断超声 (每 5 s间断 5 s) 20次 250W 分散后置于 40 ℃磁力搅拌 115 h之后用去离子水高速离心清洗干净 ,冻干保存。 11312 双乳化法
1 实验部分
111 原料和仪器溶菌酶 , 18000 U /mg浙江长兴艾格生物制品有
限公司 ;溶壁微球菌 ,中科院微生物所 ; PLGA (聚乳酸与羟基乙酸物质的量比 50 ∶50,分子量 8000) ,分析纯 ,济南岱罡生物科技公司 ; PVA 2124 (水解度 99% ,聚合度 2400 ～ 2500 ) , CHS (平均分子量 360000脱乙酰度大于 90% ) ,分析纯 ,北京化学试剂公司 ;二环己基碳二亚胺 (DCC) ,分析纯 ,上海化学试剂公司。
·41·
微球的团聚现象。 213 纳米微球粒度分析及制备条件的优化
纳米微球粒度分析结果如图 3所示。试验中所得纳米微球粒径 φ分布在 (450 ±50) nm 之间 ,分布较为均一。
图 3 纳米微球粒度分析结果 Fig. 3 Nanosphere particle size analysis
将 6m g溶菌酶溶于 1mL 011mol/L 的 PB S溶液中形成内水相 ,加入油相中冰浴间断超声 (每 5 s间断 5 s, 15次 250W )形成初乳 ,其他步骤与单乳化法相同。
在制备没有被壳聚糖修饰的单乳化法、双乳化法纳米微球时 ,外水相不添加壳聚糖。 114 纳米微球药物释放试验
取 10mg冻干后的纳米微球 ,分别以不同 pH 值缓冲液 10 mL 分散 ,之后取 3mL 在粒度 Zeta电位分析仪上测表面 ζ电位以及粒度分析。 116 纳米微球包封率载药量的测定
将 10mg冷冻干燥后的纳米微球溶于 4mL DM 2 SO ,以不同浓度溶菌酶的 DM SO 溶液做标准 ,测量 280 nm 光吸收。
引言
聚乳酸 2羟基乙酸共聚物 ( PLGA )微粒广泛用于蛋白、多肽、核酸等生物大分子给药 [ 1 - 2 ] 。由于 PL2 GA 纳米微球表面缺乏可用于共价修饰的基团 ,所以难以在表面负载生物活性物质如 DNA、配体和疫苗等 [ 3 - 4 ] ,不易于通过受体或抗体进行靶向给药。因此 ,人们尝试用不同方法将 PLGA 表层包裹不同的聚合物以达到物理改性 PLGA 微球表面的目的。如阳离子表面修饰是基于 PLGA 表层负电荷而设计的 ,这种方式使 PLGA 的表面活化成为可能 [ 5 ] 。将壳聚糖 (CHS)选做纳米微球表面修饰材料是因为它具有阳离子电荷 , 生物可降解 , 黏膜黏附性等特性 [ 6 ] 。壳聚糖包裹的颗粒尤其适于生物大分子的传递 [ 7 ] 。壳聚糖强大的正电荷会对细胞黏膜产生危害 ,而壳聚糖包裹在纳米微球表面上只占加入壳聚糖量的很小一部分 [ 8 ] ,所以将壳聚糖包裹在 PL2 GA 纳米微球表面相对于直接利用壳聚糖作为载药纳米微球对细胞的伤害要小很多。
将 10 mg干燥的纳米微球分散于 10 mL pH412 醋酸醋酸钠缓冲液中于 37 ℃低速搅拌 , 20 d内每天取样。取样时将纳米微球分散液高速离心 ,然后再以相同条件分散微球 ,清液冷冻干燥浓缩后测量溶菌酶活性 [ 14 ] 。 115 纳米微球的表征
将冻干后的纳米微球用去离子水分散后涂于玻片上 ,干燥后喷金处理 ,用 S24700 冷场发射扫描电子显微镜观察。
第 37卷第 2期 2010年
北京化工大学学报 (自然科学版 ) Journal of Beijing University of Chem ical Technology (Natural Science)
Vol. 37, No. 2 2010
壳聚糖修饰的 L ysozym e - PL GA阳离子纳米药物的制备与表征
40 40 2550 1625 925
10 5 2000 2175 175
0 1615 825 3350 2525
2800 450
溶解 ,而油相中丙酮体积分数过大会导致微球团聚。各因素最佳水平分别为 DM SO 占油相体积分数为 40% , 丙酮为 1615% , PLGA 油相质量浓度为 5mg/mL。按照优化的条件重复试验 ,所制得 CHS Lysozym e - PLGA - NP 粒径平均为 450 nm 符合要求。综上 ,油相溶液黏度越低所得微球粒径越小 ,这与 Yang等 [ 16 ]的研究结果相同。 214 纳米微球的包封率与载药量
Kumar等 [ 9 - 10 ]已成功利用 CHS修饰 PLGA 制备阳离子纳米微球并用于负载 DNA 分子。官习鹏等 [ 11 ]也利用此方法制备了阳离子 PLGA 纳米微球 ,
收稿日期 : 2009 - 04 - 24 第一作者 : 女 , 1982年生 ,硕士生 3 通讯联系人 E2mail: jingchunchen@ hotmail. com
图 2 外水相不同 pH值 ζ电位的变化 Fig. 2 Variation of theζpotential of the nanospheres
w ith the pH of the aqueous phase
第 2 期阎晓霏等 : 壳聚糖修饰的 Lysozyme - PLGA 阳离子纳米药物的制备与表征
以优化了的条件制得的纳米微球包封率为 8718%载药量为 1417% ,而以双乳化法方法制备的纳米微球 ,其他条件与本试验相同的情况下所得包封率仅为 4110%。壳聚糖的修饰对包封率和载药量的影响不显著。
在以双乳化法方法制备 PLGA 纳米微球的情况中 ,影响包封率与载药量的因素有很多 ,如水相油相的比例、PLGA 的质量浓度、油相中个溶剂含量的不同、药物与 PLGA 的质量比等都会影响纳米微球的包封率和载药量 [ 17 ] 。而本文通过单因素对比实验发现 ,影响药物包封率的因素只有药物与 PLGA 的质量比这一个因素 ,推测其原因是蛋白与 PLGA 结合的程度直接决定了纳米微球的包封率。
油相中影响成球的因素主要有 PLGA 质量浓度、DM SO 的体积分数、丙酮的体积分数。选用 3因素 2水平正交表进行试验设计正交试验的各因素水平见表 1。以 CHS - Lysozym e - PLGA - NP粒径为评价指标 ,对工艺进行分析结果如表 1 所示。从表 1极差数据可知 , 3个自变量对应变量的影响从大到小依次为 φ丙酮 >φ (DM SO ) >ρ( PLGA ) 。当 DM SO 体积分数低于 40 %时 , Lysozym e - PLGA不能完全
·40·
北京化工大学学报 (自然科学版 ) 2010年
过程 [ 13 ] 。将 1 g PLGA 溶于 3 mL DM SO 加入 9 mg DCC 于室温活化 2 h。将活化后的 PLGA 慢慢滴入含有 200mg溶菌酶的 5mL DM SO 溶液中 ,继续反应 4 h低温保存待用。 113 纳米微球的制备 11311 单乳化法
212 纳米微球表面 ζ电位图 2为外水相不同 pH 值对 ζ电位的影响。当
纳米粒处于 pH412 的环境中 ,ζ电位可达到 4215 mV ,并且 ,ζ电位随着 pH 的升高而下降 ,当 pH710 时 ,达到 1315 mV ,当纳米球处于 pH8 的环境下 ,发生团聚 ,说明此时 ζ电位接近零点 ,体系处于不稳定状态。所得最高 ζ电位低于官习鹏 [ 11 ]试验中所得结果 ,推测原因应为所用壳聚糖分子量不同。有研究表明 ,随着 CHS分子量的降低 ,ζ电位呈下降趋势 ,当分子量小于 16000时 ,ζ电位在 pH412左右时下降至 3416 mV[ 11 ] 。 Guo 等的研究结果表明 ,壳聚糖的质量分数也会影响表面 ζ电位 ,随着壳聚糖的质量分数增大 ,表面 ζ电位逐渐增大 ,当增大到一定质量分数时 ,ζ电位达到最高值 ,之后 ζ电位不会随壳聚糖质量分数增大而增大。达到最大 ζ电位的最小质量分数在 013%左右 ,出现位置与壳聚糖分子量有一定关系 [ 8 ] 。所以本文选用 013%为壳聚糖用量。通过 CHS的修饰作用 ,使纳米微球表面负载正电荷而增大了体系的稳定性 ,从而极大降低了纳米
阎晓霏陈劲春 3
(北京化工大学生命科学与技术学院 , 北京 100029)
摘要 : 通过二环己基碳二亚胺将聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物 ( PLGA)活化 ,又与溶菌酶进行化学键合 ,再采用单乳化 2溶剂挥发技术制备表面带正电荷的壳聚糖 (CHS) PLGA 纳米微球。对纳米微球制备条件进行了优化。结果表明在 ρ(CHS) = 3mg/mL ,ρ( PLGA ) = 5mg/mL ,溶菌酶与 PLGA 的质量比为 012的条件下 ,得到的纳米微球包封率为 8718% ,载药量为 1417%。微球粒径 φ可控制在 (450 ±50) nm 之间 ,在 pH = 4时 ,纳米微球表面 ζ电位为 4215 mV。 SEM 图像显示经 CHS修饰的 Lysozyme - PLGA 的纳米微球形状规整。药物释放试验显示纳米微球在 20 d后释放达到 70% ,且释放曲线规整。关键词 : PLGA; 壳聚糖 ; 化学键合 ; 纳米微球 ; 阳离子中图分类号 : R943; R94419