实验七 鸡马立克氏病的琼扩试验
马立克病的实验室诊断(琼扩试验)
方法步骤
（一）1%琼脂平板制备 （二）加样 （三）反应 （四）结ห้องสมุดไป่ตู้分析
（一）1%琼脂平板制备 琼脂平板制备
制板： 用8～10%氯化钠溶液配制1%琼脂溶液，电炉加热使充分溶化后， 倒入直径90 mm培养皿，制成厚度为2.5～3mm琼脂平板；平置， 在室温下冷却凝固后打孔。 打孔： 在琼脂板上按7孔一组的梅花形打孔（中间1孔，周围6孔），孔径 5mm，孔距2～5mm，将孔内的琼脂用针头斜面向上轻轻将琼脂挑 出，勿伤边缘或使琼脂层脱离皿底。 封底： 用酒精灯轻烤平皿底部至微烫，封闭孔底部，以防侧漏。 编号：将周边孔编号1～6
（五）注意事项
上述方法可用于20日龄以上鸡羽髓MDV抗原检测 和1月龄以上鸡的血清抗体检测
课后作业
1.写出实习报告； 2.掌握鸡马立克病的实验室诊断方法
2．检测血清抗体（被检鸡血清） 向中央孔滴加标准琼扩抗原 向周边孔滴加待检血清和有一孔加阳性血清 均以加满而不溢出为度
（三）反应
将加样后的琼脂平皿加盖后倒置平放于加盖的湿盒内， 置37℃温箱中孵育，8～24h内观察并记录结果。
（四）结果分析
被检样品孔与中心孔之间形成清晰的沉淀线，并与周 边已知抗原和阳性血清孔的沉淀线互相融合者，判为 阳性 不出现沉淀线的判为阴性； 已知抗原与阳性血清之间所产生的沉淀线末端变向被 检样品孔内侧时，则该被检样品判为弱阳性。 有的被检材料可能会出现两条以上沉淀线，其中一条 与已知抗原——阳性血清的沉淀性融合者，仍判为阳 性。
技能训练9 马立克病的实验室诊断 （琼扩试验）
实训目标
掌握鸡马立克病的实验室诊断方法
仪器材料
10×100mm试管若干只、玻璃棒（直径6～8mm、圆头长 约16cm）4～6只。胶头吸管18～20只、烧杯或搪瓷缸4～ 6 个 ， 玻 璃 平 皿 、 精 制 琼 脂 粉 、 打 孔 器 （ 直 径 3 mm和 6mm）、8%pH7.2～7.4的钠、钾磷酸盐缓冲液、标准抗 原、阳性血清等
一起鸡马立克氏病的诊断及建议
______________________________________H 畜牧啓医一起鸡马立克氏病的诊断及建议张成英■>,袁晓娟2（1.锦屏县饲草饲料站摘要：鸡马立克氏病是由疱疹病毒引起的一种淋巴组织增 生性疾病，其特征是病鸡的外周神经、性腺、虹膜、各种脏器、肌肉和皮肤等部位的单核细胞浸润和形成肿瘤病灶。
文章结合黔东南州本地一起鸡马立克氏病的发病情况、临床特征、病理剖 解、实验室诊断分析等内容，总结了一些建议，为临床观察鸡马 立克氏病防控提供参考。
关键词：鸡马立克氏病;诊断；建议近年来,根据贵州省、黔东南州政府相关扶贫政策，黔东南州大力发展林下养鸡，养禽业面临的问题日益凸显，鸡马立克氏病已成为危害养禽业的主要传染病之一。
鸡马立克氏病又名神经淋巴瘤病，是由马立克氏病病毒引起鸡的一种高度接触性传 染性肿瘤疾病，以淋巴组织增生和肿瘤形成为特征咱1」，发病率和 死亡离率较高,尤其是林下鸡,由于放养面积大,消毒存在困难,土壤中存在许多诱发该病的因素，严重危害鸡群健康，给养殖户 带来很大的经济损失和防控困难。
下面结合黔东南州一例林下 鸡病例为该病提供一些参考。
1发病情况经过调查询问，该鸡场2019年5月8日进鸡苗7500只，5 月18日开始发病,岀现零星死亡,7月26日开始递增死亡，开始以每天10~20只死亡，陆续增加到每天死亡100只左右。
据饲养者反映，从鸡群陆续发病以来，对鸡群使用过氟苯尼考、盐酸多 西环素、阿莫西林、抗病毒药物进行拌料饲喂，连用4d 无效。
疫苗接种程序：1日龄未接种马立克氏疫苗,7日龄接种了新城疫+ 支气管二联苗，14日龄接种法氏囊疫苗,21日龄接种新城疫IV系疫苗。
2临床症状发病鸡精神萎靡，垂翅、缩颈，似神经症状，有的病鸡鸡冠呈紫红色,有些病鸡翅膀、颈部、背部皮肤上羽囊肿大，个别鸡瞳 孔缩小，病鸡食欲不振,采食明显减少、形态消瘦并伴有腹泻、最后衰竭而死。
3病理剖解此次总共剖解10只鸡,5只活鸡（即将死亡）,5只死鸡，可 见明显病理变化。
鸡马立克氏病
症状
• 潜伏期较长，一般在一个月以上。于10周龄开始 出现症状，可早至3-4周龄者。根据临床表现可分 为4型。
• 1．神经型：主要侵害外周神经，最常见的是坐骨 神经，特征症状是劈叉姿势，亦可见跛行、瘫痪， 往往发现较晚，特别是笼养鸡。一般都是一侧重、 一侧轻。亦可见垂翅或斜颈，均为不可逆性。迷 走神经受损时则素囊肿胀，呼吸困难、腹泻。病 程较长者则表现消瘦、贫血，体重极轻，羽毛蓬 松干燥无润泽。精神良好。
病原
• 3．血清型：MDV共分三个血清型，I型为强毒、 超强毒及其人工致弱株（CVI988，荷兰），2型 为天然无毒株（SB-1、301B/1），3型为火鸡疱 疹病毒（HVT） 。
• 4．致病性及免疫特点：主要是靠细胞免疫。 • HVT对火鸡有轻微致病性，对鸡无毒。可用作疫
苗。MDV及HVT属终身感染，因此属于带毒免疫。 HVT只能防止肿瘤的形成，但不能阻止MDV强毒 感染。
病鸡精神沉郁、食欲不振，渐进性消瘦
贫血，鸡冠苍白，皱缩无光
下痢，多排出黄白色、或白色与绿色混杂的稀便
症状
• 3．眼型：单侧或双侧虹膜角膜颜色变浅， 以后消退，由金色变为灰白色，呈同心圆 或点状，故也叫“灰眼病”，瞳孔边缘不 整齐，严重者瞳孔只剩下一个针尖状孔。
眼型可见虹膜增生，瞳孔变小，边缘不整
虹膜增生呈同心环状或斑点状以至弥漫 的灰白色，瞳孔边缘变得不齐，缩小。
症状
• 4．皮肤型MD：比较少见。其病理变化特 征为：以皮肤的羽毛囊为中心，形成半球 形隆起的肿瘤，其表面有时可见鳞片状棕 色痂皮。
皮肤型病鸡可见全身毛囊肿瘤性增生
常见大小不一的弥漫性肿瘤结节
皮肤表面有弥漫性肿瘤结节颈部皮肤肿瘤，已感染破溃
动物传染病学（彭大新）实验一鸡白痢的检疫
实验一鸡白痢的检疫（一）实验目的熟悉和掌握鸡白痢的血清学检疫方法。
（二）实验原理快速全血平板凝集反应（三）实验准备1.抗原：鸡白痢全血凝集反应抗原，由农业部中国兽药监察所购得，或其他来源的合格产品。
抗原为福尔马林灭活的细菌悬液，每毫升含菌100亿。
2.用具：洁净玻璃板、干净纱布、7#或9#注射针头、75%酒精棉球、酒精灯、移液器、手电筒。
（四）实验步骤1.先将抗原瓶充分摇匀，用移液器吸取抗原20 μL，垂直滴于玻片上；2.用注射针头刺破鸡的翅静脉或冠尖，以移液器吸取血液一满环(约0．02m1)混入抗原内；3.随即搅拌均匀，并使散开至直径约2cm为度；4.用手电筒反照玻璃板，仔细观察并判定。
（五）结果分析1.抗原与血清混合后在2min内发生明显颗粒状或块状凝集者为阳性。
2.2分钟以内不出现凝集，或出现均匀一致的极微小颗粒，或在边缘处由于临干前出现絮状者判为阴性反应。
3.在上述情况之外而不易判断为阳性或阴性者，判为可疑反应。
（六）注意事项1.抗原应在2～15℃冷暗处保存，从杀菌之日算起有效期6个月。
2.本抗原适用于产卵母鸡及1年以上公鸡，幼龄鸡敏感度较差。
3.本试验应在20℃以上室温中进行。
4.手电筒反照可以不分阴晴天或白昼。
5.每次使用金属管可以用酒精棉球擦干、消毒。
6.使用酒精灯要特别注意安全：防鸡翅掀翻酒精灯或防工作服碰到火焰。
（七）思考题1.试比较鸡白痢检疫的全血平板凝集反应与血清平板凝集反应的异同点。
2.我国绝大多数鸡群鸡白痢的阳性率比较高，试分析其原因和拟定防制对策。
实验二巴氏杆菌病的实验室诊断（一）实验目的初步掌握巴氏杆菌病的微生物学诊断步骤和方法。
了解巴氏杆菌病的病理变化。
（二）实验准备染色液：美兰染色液、瑞氏染色液、革兰氏染色液（草酸铵结晶紫、革兰氏碘液、95%酒精、沙黄水溶液）、用具：搪瓷盘、碘酊棉、75%酒精棉、组织镊、手术刀（带柄）、普通剪刀、塑料洗瓶、纱布、酒精灯、载玻片、吸水纸（载玻片大小）、铂耳、显微镜、擦镜纸、染色废液缸、甲苯、镜油、血培养基平板、巴氏杆菌病死鸡（三）实验步骤1、分离培养（划线培养）①无菌解剖病死鸡暴露胸腹腔，露出其心、肝、肺等。
鸡马立克氏病
十、预防MD应采取措施
克服母源抗体的干扰增加2-3个剂量；HVT+ACM；世代交替用 不同的疫苗株；选用二价或多价疫苗；首免2周后进行二 免。
严格遵守疫苗使用方法专用的稀释液；不混合注射和加抗生 素；1h内用完，冰箱内保存稀释疫苗；剂量准确；注射器 消毒。
病；肉仔鸡多在40日龄之后发病。 本病的发生与饲养管理条件有密切关系、无季节性。
四、临床症状
潜伏期1-3个月。 根据病变发生的主要部位和症状，可分为4种类型:内脏型、
皮肤型、神经型、眼型 内脏型多呈急性暴发，常见于幼龄鸡群，开始以大批鸡精神
委顿，食欲下降，明显消瘦为主要特征，几天后部分病鸡 出现共济失调，呆顿常缩颈蹲在墙角下。病鸡羽毛松乱无 光泽，皮肤苍白，排绿色稀便。部分病鸡死前无特征临床 症状，很多病鸡表现脱水、消瘦和昏迷。
尔马林、2%火碱将其灭活。
二、病 原
比较 致瘤性 引起动物早期死亡 引起免疫抑制 淋巴细胞增多 病毒血症 鸡胚感染 抗原的侵袭力 免疫能力 细胞培养
蚀斑 脱离细胞
1 +++
+ + + ++ + + + 鸡、鸭胚成纤维细胞 中等大小 细胞结合毒不能冻干
2 + + + + 鸡、鸭胚成纤维细胞 大 细胞结合毒不能冻干
九、MD免疫失败的原因
环境中存在强毒和超强毒株 雏鸡感染其他的疾病：如CAA,注射疫苗时带入其他
的病原菌（重要的是绿脓杆菌） 母源抗体的干扰 免疫剂量不足 免疫抑制因素：免疫系统疾病、饲养管理不善
十、预防MD应采取措施
严格保证疫苗的质量及运输过程中的保管：马立克氏病冻干 疫苗应冷藏于2～8℃的冰箱，细胞结合苗应保存于特制的 液氮罐中，疫苗稀释液应保存于低于27℃的条件下，如果 保存不当，就会使疫苗免疫失效。 正确选择疫苗的种类：祖代、父母代、商品代疫苗采用交 叉免疫种类；疫区选用多价苗、液氮苗
琼扩试验检测马传贫试验步骤
马传染性贫血琼脂扩散试验-马传贫防治技术规范(2008)1．琼脂板的制备称取琼脂糖1.0g，加到100m1磷酸缓冲液（PBS）中，加入1％硫柳汞溶液1m1，使用电磁炉/沸水浴/电炉煮沸等方式使其充分融化。
冷至45℃～55℃时，将洁净干热灭菌直径为90mm的平皿置于平台上，每个平皿加入15～18ml，加盖待凝固后，把平皿倒置以防水分蒸发，放普通冰箱（4℃）中保存备用（保存时间不超过2周）。
2．操作(1)打孔在制好的琼脂板上按7孔一组的梅花形打孔(中间1孔，周围6孔)，孔径5mm，孔距3 mm （2～5mm）（如实图），将孔内的琼脂用注射针头斜面向上从右侧边缘插入，轻轻向左侧方向将琼脂挑出，勿伤边缘或使琼脂层脱离皿底。
(2)封底用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂板底部刚刚要溶化（手背感觉微烫手）为止，封闭孔底部，以防侧漏。
(3)加样用微量移液器或带有6～7号针头的0.25ml注射器，吸取“标准抗原”滴入中间孔，“标准阳性血清”分别加入对称的两个孔中（例如1和4孔，或者2和5），被检马血清按编号顺序分别加入另外4个外孔。
每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个滴头，避免污染。
(4)反应（扩散）加样完毕后，静置5～10min，然后将平皿轻轻倒置放入湿盒内，置于15-30℃条件下反应，逐日观察3天并记录结果。
3．结果判定(1)判定方法将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，若标准阳性血清(图中1和4号孔)与抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线，则试验成立。
阳性：当检验用标准阳性血清孔与抗原孔之间只有一条明显致密的沉淀线时，受检血清孔与抗原孔之间形成一条沉淀线；或者阳性血清的沉淀线末端向毗邻的受检血清的抗原侧偏弯者，此种受检血清判定为阳性。
阴性：受检血清与抗原孔之间不形成沉淀线，或者标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线向毗邻的受检血清孔直伸或向受检血清孔侧偏弯者，此种受检血清为阴性。
疑似：标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线末端，似乎向毗邻受检血清孔内侧偏弯，但不易判断时，可将抗原稀释2倍、4倍、6倍、8倍进行复试，最后判定结果。
鸡马立克氏病病毒的实验室诊断
鸡马立克氏病病毒的实验室诊断
从病鸡和许多外表正常的鸡体中都不难分离出病毒株。
供分离病毒用的首选样品是肿瘤细胞、肾细胞以及脾或周围血液的白细胞。
由于mdv在这些组织中是高度细胞结合性的，所以必须用全细胞作为接种物。
羽毛囊是从病鸡中分离完整病毒粒子的唯一良好来源。
被怀疑含有mdv的样品，可以用接种易感鸡、细胞培养物和鸡胚的方法来分离病毒。
雏鸡接种法：这是分离mdv最敏感的方法。
选择易感鸡，在1日龄或l周龄内用腹腔接种的途径进行感染，然后严格隔离饲养观察。
接种后经18 -21天，对试验鸡连同相应的阳性和阴性对照，进行有无感染迹象的检查。
试验应至少持续10周。
细胞培养法：这种方法的敏感性虽不如雏鸡接种法，但简单易行，仍很有实用价值。
首先要制备鸭胚成纤维细胞或鸡肾细胞的培养物，最适宜的接种物是白细胞、肿瘤细胞或血液。
5 - 14天出现典型的mdv 蚀斑，而对照培养物中不见这种变化，这就是分离到mdv的证据。
这种特征性的蚀斑，由圆形和梭形的折光性细胞和含有cowdrva型核内包涵体的多核细胞所组成。
鸡胚接种法：通过卵黄囊或绒毛尿囊膜途径接种病毒的鸡胚，分别于接种后4-6天或10-11天在绒毛尿囊膜上产生痘样病斑。
在实验室诊断中，md的血清学试验通常用琼脂凝胶免疫扩散试验，检测mdv抗原及其沉淀抗体。
用荧光抗体法或酶抗体法检查病鸡组
1。
鸡马立克氏病的临床症状、诊断方法及防控措施 - 养鸡技术
鸡马立克氏病的临床症状、诊断方法及防控措施-养鸡技术鸡马立克氏病是肉鸡养殖中最常出现的恶性肿瘤性疾病。
鸡马立克氏病属于疱疹病毒科,患病鸡主要特征为淋巴细胞组织增生,同时脏器器官以及周边神经、肌肉组织的单核细胞浸润现象或肿瘤现象。
是一种接触性的传染病。
其发病率和死亡率都较高，会引起鸡群大批死亡。
因此要对该病进行正常的诊断，并采取积极、有效的措施防控该病发生和传播。
下面我们一起来看一下鸡马立克氏病的临床症状、诊断方法及防控措施。
1、流行特点鸡是的易感群体，并且年龄越小的鸡越易感，尤其是初生雏鸡最为严重，母鸡比公鸡更易感。
不同品种的鸡都会感染此病，但是对该病的抵抗力以及感染后的发病率存在一定的差异。
该病通常在雏鸡阶段感染，中雏阶段发病。
饲养管理不良、营养物质缺乏、饲养环境卫生较差、寄生虫病，尤其是球虫病等都会增加该病的发病几率。
病鸡和带毒鸡是马立克氏病的传染源。
可以通过直接或间接的方式进行传播。
该病毒可附着在空气中的尘埃或者羽毛的碎屑上，通过呼吸道和消化道侵害鸡体。
还会通过病鸡的分泌物、排泄物传播。
其中病鸡皮肤上的羽囊上皮中含有该病毒最多，因此，病鸡脱落的毛屑含有较多的病毒。
另外，体外寄生虫也是该病的主要传播媒介。
雏鸡在感染此病毒后不会立即发病，随着病毒在体内的大量繁殖，从而侵害神经系统和内脏器官，最后形成肿瘤，一般蛋鸡在90~150日龄时发病。
2、临床症状神经型。
这是最常见的一个类型，因受损害的神经不同而表现出不同的临床症状。
其中以坐骨神经和臂神经最易受到侵害。
坐骨神经受损时病鸡的腿会发生麻痹，表现为劈叉姿势，或者卧地不起；当臂神经受损时病鸡的翅膀下垂；支配颈部的神经受损时则会出现斜颈或低头的现象；迷走神经受损时鸡的嗉囊麻痹、肿大、扩张，食物不能下行，呼吸困难；腹部神经受损时则会表现为腹泻。
一般情况下病鸡的精神状态不受明显影响，有食欲，但是却因吃不到饲料，喝不到水而脱水和衰竭，有的病例会出现厌食、贫血、昏迷等症状。
禽用琼扩抗原主要检测特点及其使用注意事项
２１ 应使 用质 量优 良的琼脂糖 ．
制备琼脂平板 时要 使琼脂粉充分融化 ，不要有颗粒物 ， 琼脂板凝 固后应无色透 明。采用 高盐溶液 （ 一般为含 ８ ％的
ＮＣ 溶液或含 ８ ａ１ ％的 Ｎ Ｃ 的 Ｐ Ｓ ０ １ ａ１ Ｂ ，． Ｍ，ｐ ７２ 配 制 琼 脂 ， ０ Ｈ ．）
确诊 时 还 需 结 合 疾 病 的 流 行 病 学 知 识 与 临 床 症 状 进 行 综 合
鸡 的母源抗体水平 ， 推算 确定接种 日龄。此方法现在 已经在
现地 被推广使用 ， 按雏 鸡总数 的 ０５ ． ％比例 采血 ， 分离 血清 ， 用琼扩试验检测 １日龄雏鸡 ＩＤ母源抗体 的阳性率 ， Ｂ 当雏鸡 Ａ Ｐ阳性率为 ４ ％时 ，０日龄和 ２ Ｇ ０ １ ８日龄各免疫一 次 ；若 阳
３ 小 结
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
基本上可以确定 强毒 的感染 。 鸡在接种法氏囊病疫苗或者感染法 氏囊病毒之后 ， 血清
沉 淀 抗 体 阳性 。 氏囊 病 琼 扩 抗 原 的 还 可 用 于测 定 １日龄 雏 法
琼 扩诊断方法 作为基层 使用的方法 ， 简单方便 ， 但也存 在敏感性不足 的缺 陷 ，因此 也仅 作为现地诊断的辅 助手段。
泛 的欢迎 。 本文对一些禽用病毒性疾病琼 扩方法检测 的主要 特点及操作注意事项 进行 了总结 。 １ 不 同琼扩诊断抗原检测 的主要特点 禽腺病毒 Ｉ 型琼扩抗 原液可以检测禽腺病毒 Ｉ 中不 同 群 血清型禽腺病毒的感染 。成鸡感染后 ， 沉淀抗体可 以持续很
长 的时 间 。雏 鸡 发 病 时 血 清 不 一 定 为 阳性 ， 般 在 一 月 龄 时 一
蛋种鸡马立克氏病的病理学诊断
发病 死亡鸡 １ ０只 ，频 死 期 鸡 ５只 。ＭＤ标 准 ｌＡ） 性 腺 肿 瘤 比较 常 见 ， 泡 停 止 发 育 ， 巢 被 － 。 卵 卵
琼 扩 抗 原 、标 注 阳 性 血 清 由吉 林 农 业 大 学 预 防 兽 肿 瘤 组 织 代 替 呈 肉样 变 （ 图 １Ｂ） 见 一 。肌 胃 、 胃 、 腺
马 立 克 氏病 （ ｒｋ ｄｓａｅ ＭＤ） 由 马 立 克 １ ． 细菌学检测 Ｍａｅ ’ ｉ ｓ ， Ｓ ｅ 是 ．２ ２
无菌取心血作涂 片， 取肝、 、 脾
氏病 病 毒 （ ＭＤＶ） 起 鸡 的 一 种 高 度 接 触 性 传 染 性 肾作 触 片 ，革 兰 氏及 美 兰 染 色 镜 检 。 同 时划 线 接 引 肿 瘤疾 病 ， 以淋 巴组织 的增 生和 肿 瘤 形成 为 特 征“ 种 于 营 养 琼 脂 平 板 和 鲜 血 琼 脂 平 板 上 ，３ ￣ 养 。 ， ８ Ｃ培
皇班正 豳
２ １ 年 第 ８期 ００
总 第 ２ ９期 ６ 第 ３ ｌ巷
・
嗣 业 毛 ・
蛋 种 鸡 马 立 克 氏 病 的 病 理 学 诊 断
葛晨 霞 ， 晓庆 ， 董 王微微 ， 王龙 涛
（ 林农 业大 学动物 科 学技术 学 院， 林 长春 吉 吉
【 摘
Hale Waihona Puke １０ １ ） ３ １ ８ 要 】 ０ ０年 ３月 ， 者 于 吉林 农 业 大学 附属 兽 医院遇 见 一 例蛋 种 鸡群 发 性 肿 瘤 病 ， 送检 患鸡 常规 剖 ２１ 笔 对
・２ ５・
心 肾脏 的 浆 膜 面 和 皮 肤 上 见 大 小 不 一 ， 医 学 教 研 室 保 存 。主 要 仪 器 ： Ｅ Ｃ Ｍ２ ３ Ｌ Ｉ ＡＲ ２ ５切 片 脾 脏 、 肌 、 灰 白色 ， 地 稍 硬 实 的肿 瘤 结 节 （ 图 １ 。 氏 质 见 法 Ｃ） 机 、 ｔ Ａ一０ Ｍｏｉ Ｂ ３ ０显 微 镜 等 。 ｃ
鸡马立克氏病的诊断方法
2019年第08期鸡马立克氏病（MD ）是鸡的一种高度接触传染性的、由疱疹病毒引起的淋巴组织增生性疾病。
此病的特征是病鸡的外周神经、性腺、虹膜、各种脏器和皮肤单核细胞浸润，是淋巴瘤性质的肿瘤疾病。
本病最早在美国曾有过暴发，以后在荷兰、英国和许多国家发现此病，现在本病广泛流行于世界各个养禽国家，对养鸡业造成巨大经济损失。
在我国直至20世纪90年代，有不少地方发现本病的流行和危害。
后期开始对本病进行了研究，先后分离出了有良好致病力的京-1株强毒，研制出火鸡胞疹病毒（HVT ）冻干苗和同源弱毒预防疫苗，填补了我国有关马立克氏生物药品的空白，又研究出简便易行的血清学诊断方法。
这些成果已在全国各地推广应用，对控制本病减少危害起到了很好的作用。
1病毒分离人工接种病毒后1~2d 或接触感染后5d ，就可以从鸡体内分离出病毒。
分离病毒的时间与使用的病料有关。
如果从脾脏分离病毒，可在感染后5~7d 进行；如果从血液分离，可在1~2周进行；如果从羽毛囊分离，最好在3周进行，分离方法是从上述病料获得的淋巴细胞、白细胞或含细胞的羽髓浸提液，直接接种到CES 培养细胞或DEF 单层上，每天观察细胞病变，一般在5~14d 出现。
也可以用感染鸡的肾脏直接制备细胞培养物，还可将病毒细胞培养物接种于4~5d 的鸡胚卵黄囊，30%以上的胚在绒毛尿膜上可产生典型的痘斑。
如果接种于1周龄以内的易感鸡雏，至少应观察2~10周，然后进行有无病毒感染的检查。
2血清学试验鸡马立克氏病的血清学试验包括检查病毒抗原和沉淀抗体两方面。
可以用荧光抗体法或酶抗体法检查鸡组织中的病毒抗原或肿瘤特异性抗原，或用免疫扩散试验检查羽毛囊抗原。
同样，这些方法也可用于检测血清抗体。
此外，还可以用病毒中和试验检查中和抗体。
显然以免疫扩散法最为简单易行。
用已知的阳性血清做免疫扩散试验来检查羽毛囊抗原，操作简便。
只要从受检鸡身上拔下几根含羽髓的羽毛，用玻璃棒做适当的挤压浸提后，就可作免疫扩散试验。
鸡马立克氏病的诊断
鸡马立克氏病的诊断鸡马立克氏病（简称马立克氏病）是一种由马立克氏病毒引起的可怕传染病，该病毒主要感染家禽，尤其是鸡。
马立克氏病对家禽养殖业造成了严重的影响，因此准确、早期的诊断对预防和控制马立克氏病至关重要。
本文将介绍马立克氏病的诊断方法及其相关技术，以便于饲养员和兽医能够及时有效地诊断和防治该疾病。
我们来了解一下马立克氏病的临床表现。
患有马立克氏病的鸡主要表现为以下症状：厌食、蛋产量下降、呆滞、精神萎靡、发蓝、呼吸困难、腹泻、贫血、肿腹、饮水增加、黄疸等。
这些临床症状并不都同时出现，但一旦发现鸡出现上述症状的任何一种或几种，就有可能患有马立克氏病。
所以，在诊断马立克氏病时，兽医应该结合临床症状进行综合判断。
我们需要了解一下马立克氏病的实验室诊断方法。
马立克氏病的实验室诊断方法主要有几项：1. 病原学检测采用病毒分离培养技术，通过禽类细胞株诊断病毒，是马立克氏病诊断的一项重要方法。
应用PCR技术检测病毒的核酸也是一种常用的方法。
PCR检测方法的敏感性和特异性非常高，可以用来快速鉴定病毒。
2. 抗体检测在马立克氏病的诊断中，抗体检测是非常关键的一环。
可以通过ELISA（酶联免疫吸附测定法）和中和试验等方法检测血清中的特异性抗体水平，并可用于对马立克氏病的暴发情况进行监测。
3. 组织学检测组织学检测是通过组织病理学的方法，对鸡的相关组织进行病理学检查。
在病毒感染后，鸡的组织会产生不同程度的病变，如血管扩张、出血、淋巴细胞增加等，这些病变都可以通过组织学检测来进行诊断。
在实际操作中，一般结合以上几项检测手段，以提高诊断的准确性和可靠性。
无论是采用病原学检测、抗体检测还是组织学检测，都需要通过专业的实验室设备和技术人员进行操作，以保障诊断的准确性。
在饲养管理方面，饲养员还可以通过观察鸡舍环境、关注鸡的饮食情况和行为习惯等对鸡的健康状况进行监测。
一旦发现有鸡出现上述临床症状，应及时向兽医进行报告，并进行详细检查和诊断。
琼脂扩散试验操作方法及注意事项
４ ｍｍ） 。手 拿 一 张 正 方 形 白 纸 叠 成 三 角 形 ， 将 其 分 成 三 等 分， 然后打开 ， 在 白纸 上划 成 ７ 孔形 图案 ， 将 琼 脂 板 放 在 ７孔 形 图案 上 ， 用金属管打孔 ， 其孔 径 为 ３ ～４ ｒ ｎ ， 放 于 ４℃ 冰 箱 冷 却 后 ， 打 孔 的 效 果 较好 ； 掌握 好封底 温度 ， 温度 不宜 过高 ； 打孑 Ｌ 的孔径 、 孔 距 力 求准确 、 合适 ； 加 样 时 孔 中 的抗 原 和 血 清 必 须 加 满 而 又 不 能 外溢 ， 剂量要掌握准确 ， 不 要产生小气泡 ； 使 用 过 的 吸 头 和 未 使 用 过 的 吸 头应 分 开 放 ， 不 能 混用 ； 加样后 的琼脂 平板 ， 不 要 马 上倒 置 ， 以免 液 体 流 出 ， 并放人有盖的湿盒 内。
４ ｍＩ ｉ ｌ 。再 用 牙 签 剔 出孔 内的 琼 脂 。
用广泛 ， 特别适用于大量血清样 品的检测 和流行病学群 体 的
定 性 诊 断 。 缺点 是 需 要 时 间 过 长 ， 灵 敏 度 不 高 。琼 脂 扩 散 试 验 是 根 据 沉 淀试 验 的 原 理 ， 利用 可溶 性 抗 原 和 抗 体 在 半 固 体
《 上 海 畜牧兽 医通 讯 》 ２ ０ １ ３年 第 ６期
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琼 脂 扩散 试验 操 作 方 法及 注意 事 项
罗平 恒 朱凤 云
（贵州 省 畜 牧 兽 医 学 校 ５ ５ ０ ０ １ ８）
琼 脂 扩 散试 验 （ 简 称“ 琼 扩” ） 是ｌ 临床 中病 原 诊 断 和 抗 体
鸡马立克氏病的防治
肝 脏 、 脏 、 脏 、 巢 、 脏 、 胃 、 管 和 肠 系 脾 心 卵 肺 腺 肠 膜 、 肉等 器 官 组 织 。肿 瘤组 织是 由大 中小 淋 巴 肌
不 等 的 肿 瘤 ， 瘤 多 呈 结 节 状 ， 白色 ， 地 细 肿 灰 质
养 禽
马立 克氏病 （ ＭＤ） 由马立克 氏病 毒引起 是 的淋 巴细胞增生性传染病 。 主要发生于鸡 。 病毒 在鸡体 内可 以形成两种形式 的病毒粒子 ，一种 是细胞结合性病毒 ，存在 于肿 瘤细胞和被感染 于羽毛囊上皮细胞 内。后 者随皮屑的脱落污染 环境 ， 这种脱 离细胞的病毒有很强 的抵抗 力 ， 可 以在室温下存活 ４～８个月。本病 主要经 呼吸道 感染 ， 自然感 染时潜伏期很难确定 ， 一般认为鸡 只在幼雏期感染 ， ４周龄发病 ， ３～ 发病率和死亡 率在 ２～５ 龄时达到高峰 ，以后则逐渐减少 ， 月 局灶性增粗 。 病变的神经纤 维萎缩消失 ， 失去洁
１ 皮肤 型 ． ４
瘤结节 。
２ 病 理 变 化
防止雏鸡早 期感 染 ；②保证在 出雏后 ２ｈ内正 ４ 确接种有效疫苗 。
－ －＇
２ 神 经型 ． １
病鸡可见受害的神经呈弥漫性或
４一 －
－－ － ４－． ４－－ ４ － － ＂ － ＂ ４ － － ， － ＇ － ４－－ ４－ －
菌素 、 红霉 素 、 泰乐菌素 、 利高霉素 、 强力 霉素等。一般来说 ，
症状的鸡进 行救 治。笔者摸索 了一套简易方法 ， 即把患鸡倒
挂 ， 喉 腔 里 的粘 液 流 出 口 腔 外 ， 止 呼 吸 道 阻 塞 而 窒 息 死 让 防
亡， 同时用针线把伤 口进行缝 合 ， 防止肺脏 里的空气从伤 口
实验七鸡马立克氏病的琼扩试验
实验七鸡马立克氏病的琼扩试验（一）实验目的熟悉鸡马立克氏病的诊断方法和免疫接种要点。
掌握利用琼脂扩散试验诊断鸡马立克氏病（二）实验原理主要采用双向双扩散试验，即用已知抗原、阳性血清和待检血清在琼脂凝胶中进行免疫双扩散，室温下作用24小时，当已知扩原和阳性血清间出现明显沉淀线，扩原和待检血清间也出现沉淀线且与阳性血清沉淀线相连，表明待检血清中有相应抗体。
此方法也常用于法氏囊血清和小鹅瘟血清抗体的检测。
（三）实验准备用具：打孔器、16#针头、剪刀、镊子、酒精灯、打孔纸样、记号笔、洁净平皿。
（四）实验步骤(1) 1%琼脂糖平板制备1%琼脂粉+8%Nacl加蒸溜水，水浴加温使充分溶化后，加入培养皿，每皿约20ml；平置，在室温下凝固冷却后，将琼脂板放在预先印好的7孔形图案上，用打孔器按图形准确位置打孔，中央孔孔径为4mm，周边孔孔径为3mm，孔距均为3mm。
(2) 检测血清抗体(被检鸡血清) 向中央孔滴加标准琼扩抗原，向周边孔滴加待检血清和至少有一孔加阳性血清，均以加满而不溢出为度；将加样后的琼脂平皿加盖后平放于加盖的湿盒内，置37℃温箱中孵育，8～24h内观察并记录结果。
(3) 检测羽髓中MD V抗原向中央孔加MD阻性血清，向周边1、4孔加标准：MD琼扩抗原，向周边2、、5、6孔加待检羽髓浸液(加1～2滴蒸馏水在试管内挤压)，或直接插羽髓。
加样后将琼脂平皿置湿盒内，于37℃温箱孵育，8～24h内观察结果（五）结果分析1、被检样品孔与中心孔之间形成清晰的沉淀线，并与周边已知抗原或阳性血清孔的沉淀线互相融合者，判为阳性，不出现沉淀性的判为阴性；2、已知抗原与阳性血清之间所产生的沉淀线末端弯向被检样品孔内侧时，则该被检样品判为弱阳性。
3、有的被检材料可能会出现两条以上沉淀线，其中一条与已知抗原——阳性血清的沉淀线融合者，仍判为阳性。
鸡马立克氏病的诊断
鸡马立克氏病的诊断鸡马立克氏病，又称为传染性胃肠炎病毒(CV)感染病，是一种由鸡马立克氏病毒引起的传染病，是鸡、火鸡和鹌鹑的常见传染病，主要发生在全球范围内的饲养家禽中。
这种疾病会给家禽业造成严重的经济损失，因此对该病进行及时诊断和控制至关重要。
下面，我们将介绍鸡马立克氏病的诊断方法。
一、临床症状鸡马立克氏病的症状多种多样，但典型的临床症状主要包括以下几点：1. 消化道症状：家禽感染鸡马立克氏病后，常出现呕吐、腹泻、厌食、消瘦等消化道症状。
患鸡马立克氏病的家禽还常常出现排便异常，如粪便稀薄、呈黄白色等。
2. 神经系统症状：部分感染家禽会出现神经系统症状，如呈现头部抬高、颈部后弯等神经系统症状。
3. 呼吸系统症状：少数鸡马立克氏病感染家禽会出现呼吸系统症状，包括呼吸急促、咳嗽等。
二、病理学改变鸡马立克氏病感染家禽后，病理学改变也是该病的重要诊断依据之一。
典型的病理学改变主要包括以下几点：1. 胃肠道黏膜充血、水肿：感染鸡马立克氏病的家禽的胃肠道黏膜会出现充血、水肿等病理改变。
2. 肝脏病变：部分患病的家禽在病理学检查中可发现肝脏肿大、肝实质出血等表现。
3. 神经系统病变：严重感染的鸡马立克氏病家禽在病理学检查中可发现脑炎、脑膜炎等神经系统病变。
三、实验室诊断对鸡马立克氏病进行实验室检测，是确定病情的主要手段之一。
目前常用的实验室诊断方法主要有：1. 病毒分离：通过将可疑样本接种入胚传染性嗜脂乳病毒细胞，观察细胞内的病毒是否能够复制和产生病变，从而实现鸡马立克氏病病毒的分离。
2. 血清学检测：利用酶联免疫吸附测定等方法检测家禽血清中抗体水平，来确定鸡马立克氏病的感染情况。
3. PCR检测：利用多聚酶链式反应技术，通过扩增样本中的病毒核酸，来检测鸡马立克氏病病毒的存在。
四、病原学检测鸡马立克氏病的病原学检测主要是指对病原微生物的检测。
常用的病原学检测方法主要有：1. 病毒颗粒观察：在电镜下观察感染鸡马立克氏病的家禽的样本，如粪便、脑组织等，检测病毒颗粒的存在。
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实验七鸡马立克氏病的琼扩试验
（一）实验目的
熟悉鸡马立克氏病的诊断方法和免疫接种要点。
掌握利用琼脂扩散试验诊断鸡马立克氏病
（二）实验原理
主要采用双向双扩散试验，即用已知抗原、阳性血清和待检血清在琼脂凝胶中进行免疫双扩散，室温下作用24小时，当已知扩原和阳性血清间出现明显沉淀线，扩原和待检血清间也出现沉淀线且与阳性血清沉淀线相连，表明待检血清中有相应抗体。
此方法也常用于法氏囊血清和小鹅瘟血清抗体的检测。
（三）实验准备
用具：打孔器、16#针头、剪刀、镊子、酒精灯、打孔纸样、记号笔、洁净平皿。
（四）实验步骤
(1) 1%琼脂糖平板制备1%琼脂粉+8%Nacl加蒸溜水，水浴加温使充分溶化后，加入培养皿，每皿约20ml；平置，在室温下凝固冷却后，将琼脂板放在预先印好的7孔形图案上，用打孔器按图形准确位置打孔，中央孔孔径为4mm，周边孔孔径为3mm，孔距均为3mm。
(2) 检测血清抗体(被检鸡血清) 向中央孔滴加标准琼扩抗原，向周边孔滴加待检血清和至少有一孔加阳性血清，均以加满而不溢出为度；将加样后的琼脂平皿加盖后平放于加盖的湿盒内，置37℃温箱中孵育，8～24h内观察并记录结果。
(3) 检测羽髓中MDV抗原向中央孔加MD阻性血清，向周边1、4孔加标准：MD琼扩抗原，向周边2、、5、6孔加待检羽髓浸液(加1～2滴蒸馏水在试管内挤压)，或直接插羽髓。
加样后将琼脂平皿置湿盒内，于37℃温箱孵育，8～24h内观察结果
（五）结果分析
1、被检样品孔与中心孔之间形成清晰的沉淀线，并与周边已知抗原或阳性血清孔的沉淀线互相融合者，判为阳性，不出现沉淀性的判为阴性；
2、已知抗原与阳性血清之间所产生的沉淀线末端弯向被检样品孔内侧时，则该被检样品判为弱阳性。
3、有的被检材料可能会出现两条以上沉淀线，其中一条与已知抗原——阳性血清的沉淀线融合者，仍判为阳性。
4、一般每只受检鸡采6根血羽，其中若有一根血羽出现沉淀反应，则制定该鸡为阳性鸡。
（六）注意事项
1、琼脂用打孔器打孔后，一定要用16#针头在火焰上烧烫，对孔的底部进行封口，以防血清渗漏。
2、向孔中加血清或羽髓浸液时，均以加满而不溢出为度，否则会影响反应效果。
（七）思考题
1．鸡马立克氏病的诊断依据是什么?检测鸡羽髓抗原和血清抗体的意义何在? 2．MD疫苗免疫接种时应注意哪些问题?为什么?。