显微镜的七种观察方法

带宽对图象的影响
SWB: BP420-480
WB: BP450-480
WIB: BP460-490
NB: BP470-490
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多重染色标本的多色观察
FITC+Texas Red+DAPI
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三色滤色镜的特性曲线
激发
分色
吸收
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双重染色标本的单色和双色观 察
WU
WIB
DUAL BAND
DAPI+FITC
共轭面：吸收光线，直射光通过 补偿面：相位推迟，衍射光通过
物镜相 板
聚光镜环状光阑
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2 特点 鉴定活体细胞最实用、最经济的方法 3 缺点 需要光强高 切片不能太厚(5~10um) 盖片、载片需符合标准 最好配用单色滤光镜 操作较麻烦 荧光效果不如明场物镜
）
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显微镜的七种观察方 法
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按观察方法分七种
明场
DIC 暗场
荧光
Байду номын сангаас偏光
霍夫曼 相差
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显微观察方式
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按观察方法分 7-1
1.明场:照明光直接通过聚
光镜入射于试样，并透过试样后 进入物镜并最终被观察到。
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明场
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明场观察方式
常规观察方式 应用领域：
常规镜检、病理、染色标本 优点：
视野亮度高、均匀， 应用范围广， 操作简单，价格低， 物镜适用于荧光观察 缺点： 透明标本对比度低， 标本没有立体感
WIBA
WIG
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WIB
FITC+PI
单色滤色镜的特性曲线
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双色滤色镜的特性曲线
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现行显微镜特点和各种滤色镜
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分色镜
自由组合 激 发块
吸收滤色镜
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激发滤色镜
油 镜 应 使 用 荧 光 油
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的运用
光栏全开启
物镜光栏
减少杂散光干扰
光栏适当关小
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荧光的衰减
有衰减的标本
防衰减的方法
❖ 使用抗衰减剂 ❖ 选择衰减小的荧光素 ❖ 降低激发光强度 ❖ 降低标本中氧的浓度
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按观察方法分 7-2
2.暗场:照明光通过物镜外
围射于试样，来自试样的干涉及 衍射光进入物镜并最终被观察到。
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暗场
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1 原理 丁道尔(Tyndall)现象，微粒对斜射光反射或衍射，增 大了人眼可见性。 2 特点 观察到极其微小物体，分辨率可达0.02 ~ 0.004 um (明场0.4um)—”超显微“。 3 缺点 只能观察到物体存在、运动和外部形态 不方便调节 标本要求高（灰尘、盖片、载片）
偏振器1
自然光（多 振动面）
偏振器2
偏振光（单 一振动面）
各向同性：单折射体，光性质不因照射方向而改变，普 通气体、液体、非结晶固体等
各向异性：双折射体，光速度、折射率、吸收和振动面、
振幅随照射方向不同，晶体、纤维等
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应用： 矿物质、化学物品鉴别 鉴别纤维、染色体、淀粉粒、细胞中晶体 植物病理检验 鉴别骨骼、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿 瘤细胞、横纹肌和毛发等
荧光等 ❖ 发荧光量的测定对物质定性、定量分析
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荧光显微镜的种类
透射式
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荧光显微镜的种类
落射式
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荧光显微镜的主要部件
透射式
❖ 汞灯光源 ❖ 激发滤色镜 ❖ 吸收滤色镜 ❖ 暗场聚光镜
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落射式
❖ 汞灯光源 ❖ 激发滤色镜 ❖ 分色镜 ❖ 吸收滤色镜
落射荧光显微镜的构造
吸收滤色镜 激发滤色镜
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落射荧光显微镜的构造
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使用抗衰减剂的效果
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汞灯灯箱构造
灯室，上下、左右旋钮，聚光镜旋钮
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按观察方法分 7-4
4.偏光:有些物质在两个呈
一定夹角的偏光滤片之间可现呈 鲜明的对比，或根据双折射性能 和定向呈现颜色
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偏光
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1 原理
依据波动光学原理观察和精密测定标本细节,或透明物体改变光束的物理参数,以 此判别物质结构的一种显微镜
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❖ 偏光显微镜主要用于检测矿石,地质大学会用 到,特别是可以用来鉴定珠宝,另外可以检测生 物内骨骼,这个我还没有遇见实例,还可以检测 生物化学结晶,化学院用来观察结晶液像,其他 在纺织物品化学成分上检测上,物理芯片上等, 凡是观察双折射晶体会使用偏光显微镜 。
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按观察方法分 7-5
5.相衬（差）:利用光线通
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4 应用： 微小粒子、细菌形态观察 、细菌记数，透明标本观 察等
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按观察方法分 7-3
3.荧光:利用某些物质在受
到了紫外光或短波长的光激发照 射以后能够发射出比激发光波长 长的荧光的特性的观察方法
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荧光
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什么是荧光 ?
物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为 高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非 温度辐射光——冷光。即：物质吸收短波光，发 射出的长波光。
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荧光显微镜光源
• 汞灯光源:
提供激发光(U、V、B、G)
• 氙灯光源：
高峰值更宽，更稳定
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荧光显微镜激发透镜组
• 激发透镜组
吸收 滤色镜
（激发块）:
激发 滤色镜
发射光
入射光
• 激发滤色镜:
激发波长选择
分光 滤色镜
T%
nm .
BAND PASS
落射荧光显微镜各部件特性和 作用
• 分色镜:
T%
反射激发光,荧光透过 ＜A 反射
＞A 透过
A
nm
• 吸收滤色镜:
T%
荧光透过,阻挡杂光
＜B 阻挡
＞B 透过
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B A
nm
落射荧光显微镜各部件特性和 作用
分色镜: 反射激发光,荧光透过
T% ＜A 反射
＞A 透过
吸收滤色镜: 荧光透过,阻挡杂光
A
nm
T%
＞B ，＜C 透过
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AB
C
nm
滤色镜的选择
荧光素的特性
荧光素
激发波长 发射波长
DAPI
372
456
AMCA
350
450
Hoechst 33258
365
465
FITC
490
520
Acridine Orange
490
590
Acridine Yellow
470
550
CY3
552
565
TRITC
541
572 .
Propidium Iodide 530
615
滤色镜的特性
激发
分色
吸收
FITC+PI
显微镜荧光利用光源激发——光化荧光
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荧光的种类
自发（固有）荧光
二次荧光
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荧光的性质
❖ 吸收光，必需有激发光源 ❖ 荧光波长＞激发波长（损失热能） ❖ 荧光强度极小于激发光的强度 ❖ 有不同程度的衰减 ❖ 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、
荧光效率
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荧光显微镜的优点和用途
优点：
❖ 检出能力高（放大作用） ❖ 对细胞的刺激小（可以活体染色） ❖ 能进行多重染色 用途： ❖ 物体构造的观察——荧光素 ❖ 荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体
过分别处于聚光镜与物镜的一对互
补的光环后产生干涉（强度叠加或
减弱），即相位差转变成了光强差，
从而可清楚观察到使原来不易看清
的透明类样品（即相位物体，如活
细胞）。
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相 差（衬）
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相 差（衬）
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1 原理
利用被检物体的光程（折射率 x 厚度）差进行镜检，即利用干涉现象，将相位差 变为人眼可以分辨的振幅差