第四章发酵工程制药技术(全)

第四章 发酵工程制药技术
—— 微生物制药技术
概 述


发酵的定义：利用微生物细胞中酶的作用… 发酵工程制药技术又称为微生物制药技术 微生物发酵制药:是利用微生物进行药物研究、生产 和制剂的综合性应用技术科学。 研究内容包括:微生物制药用菌的选育，发酵以及产 品的分离和纯化工艺等。 研究范围:微生物菌体发酵、微生物酶发酵、微生物 代谢产物发酵、微生物转化发酵
黑曲霉
是制酱、酿酒、制醋的主 要菌种。是生产酶制剂 （蛋白酶、淀粉酶、果胶 酶）的菌种。生产有机酸 （如柠檬酸、葡萄糖酸 等）。农业上用作生产糖 化饲料的菌种。
青霉

可用于生产抗生素、 苯氧甲基青霉素酰化 酶等。
链霉菌

ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
是放线菌，生产葡萄糖异构 酶、抗生素等。
酵母菌

主要用于生产转化酶、丙酮酸 脱羧酶、醇脱氢酶；作为基因 工程的宿主菌，表述真核生物 的外源基因。


4.1.1 培养基 1、培养基的种类。 （1）孢子培养基：孢子培养基是供制备孢子用的。 要求此培养基能使微生物形成大量的优质孢子， 但不能引起菌种变异。生产中常用的孢子培养基 有麸皮培养基，大（小）米培养基，由葡萄糖 （或淀粉）、无机盐、蛋白胨等配制的琼脂斜面 培养基等。 （2）种子培养基：种子培养基是供孢子发芽和菌 体生长繁殖用的。培养基的组成随菌种的不同而 改变。 （3）发酵培养基：发酵培养基是供菌体生长繁殖 和合成大量代谢产物用的。



（4）生长因子：菌体自身不能合成，但对维持其 正常生长又不可缺少的物质，如：维生素、氨基 酸、嘌呤和嘧啶的衍生物、脂肪酸等。 （5）水：构成菌体细胞的主要成分、营养物质的 传递介质、参与许多代谢反应。 （6）产物形成的诱导物、前体和促进剂：某些胞 外酶的合成需要诱导物，前体被菌体直接用于合 成产物，促进剂能刺激菌株生长，提高发酵产量， 缩短发酵周期。
调查研究（包括资料查阅） ↓ 试验方案设计 ↓ 采样 ↓ 增殖条件摸索→ 第一次增殖培养 ↓ 第一次原种斜面→ 第一次平板分离 ↓ 第二次增殖培养 ↓ 第二次平板分离 ↓ 第二次原种斜面 ↓ 初筛（1株1瓶） ←定性或半定量测定
第三次平板分离 ↓ 第三次原种斜面 →第三次原种保藏 不纯 ↓ 复筛（1株3-5瓶） ↓ 第四次平板分离 ↓ 第四次原种斜面 ↓ 初步工艺条件摸索→ 再复筛 ←种子培养 ↓ 较优化菌株1-3株
生物诱变剂
噬菌体、转座因子
防护罩 防护衣 防护面罩
各种化学诱变剂常用的剂量和处理时间
诱变剂 诱变剂的剂量 处理时间
5～10min
缓冲剂
pH值4.5，1mol/L醋 酸缓冲液
中止反应方法
pH8.6，0.07 磷酸二氢钠
亚硝酸（HNO2） 0.01～0.1mol/L
硫酸二乙酯 （DES）
甲基磺酸乙酯 （EMS）
硫代硫酸钠或 大量稀释
硫代硫酸钠或 大量稀释 大量稀释
亚硝基胍（NTG） 0.1～1.0 mol/mL， 孢子3mg/mL 亚硝基甲基胍 （NMU） 0.1～1.0 mol/mL
大量稀释
氮芥
乙烯亚胺 羟胺 （NH2OH∙HCl） 氯化锂（LiCl） 秋水仙碱 （C22H25NO6）
0.1～1.0 mol/mL
2）、诱变选育
人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，具有 速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一 种主要方法，使用普遍。
诱发突变随机性大，必须与大规模的筛选工作 相配合才能受到良好的效果。
诱变育种的主要环节：
①以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的 微生物细胞悬浮液（细胞或孢子）以引 起绝大多数细胞致死的同时，使存活个 体中DNA碱基变异频率大幅度提高；

工业生产常用微生物
1、细菌 细菌是自然界中分布最广、数量最多的一 类微生物。 发酵工业生产中常用的细菌有：枯草芽孢 杆菌、乳酸杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌和 短杆菌等。 主要用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基 酸和肌苷酸等。

工业生产常用微生物



2、放线菌 放线菌因其菌落呈放射状而得名，在自然界中分布 很广。 目前，工业发酵生产中主要采用放线菌生产各种抗 生素，如：链霉素、金霉素、红霉素和庆大霉素等。 从微生物中发现的抗生素有60%以上是由放线菌产 生的。 3、霉菌 霉菌在自然界中分布很广，发酵工业常用的霉菌有： 根霉、毛霉、曲霉、青霉等，主要用于生产多种酶 制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。
① 出发菌株的遗传特性； ② 诱变剂； ③ 菌种的生理状态； ④ 被处理菌株的预培养和后培养条件； ⑤ 诱变处理时的外界条件等。
a) 选择合适的出发菌株 b) 采用分散状态的孢子悬浮液处理 c) 采用单核细胞（或核质体）处理
d) 注意微生物的生理状态
e) 适宜的诱变剂量
2、菌种的筛选：初筛-复筛


微生物转化发酵：微生物的转化就是利用微生物细 胞中的一种酶或多种酶将一种化合物转变成结构相 关的另一种产物的生化反应。包括脱氢反应、氧化 反应(羟基化反应)、脱水反应、缩合反应、脱羧反 应、氨化反应、脱氨反应和异构化反应等，这些转 化反应特异性强，反应条件温和，对环境无污染， 微生物转化制药最突出的例子则是甾族化合物的转 化和抗生素的生物转化等。 基因工程菌发酵：近年来，随着生物工程的发展， 尤其是基因工程和细胞工程技术的发展，使得发酵 制药所用的微生物菌种不仅仅局限在天然微生物的 范围内，已建立起了新型的工程菌株，以生产天然 菌株所不能产生或产量很低的生理活性物质，拓宽 了微生物制药的研究范围。
②用合适的方法淘汰负效应变异株，选出 极少数性能优良的正变异株，以达到培 育优良菌株的目的。
a. 出发菌株的选择
b. 菌悬液的制备
c. 前培养 d. 诱变 e. 变异菌株的分离和筛选
（1）诱变剂 物理诱变剂 化学诱变剂
乙基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍、 亚硝酸、氮芥等。
各种射线，如紫外线、X射线、 β 射线、γ 射线、α 射线和超 声波等
保藏及进一步做生产性能试 验或作为育种的出发菌株
某些必要试验和毒性试验等
（2）从自发突变体中获得菌株
变异是育种的基础。
自然突变是指自然条件下出现的基因变化。
自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来 的菌种，不能满足育种工作的需要。因而不能仅 停留在“选”种，还要进行“育”种。如通过诱 变剂处理菌株，就可以大大提高菌种的突变频率， 扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌 株 ——诱变育种。
初筛：诱变结束后的筛选可以采用传统的随机筛选， 也可以通过平板菌落筛选（推理筛选），即根据产 生菌的生物合成途径或遗传机制来设计筛选有效突 变型的方法 初筛发酵是能否产生抗生素的关键，需要选择适合 的发酵培养基和培养条件，以利于抗生素的合成。
初筛方式：
固体平板发酵——
便于大量筛选抗菌物质时采用。
液体振荡培养——
1:1000～1:10000 0.1～0.5％ 0.3～0.5％ 0.01～0.2％
5～10min
30～60min 数小时或生长过程 中诱变 加入培养基中，在 生长过程中诱变 加入培养基中，在 生长过程中诱变
NaHCO3
甘氨酸或大量 稀释
硫代硫酸钠或 大量稀释 大量稀释 大量稀释 大量稀释
2）影响诱变效果的因素
诱变育种 凡是利用诱变剂处理分散而均匀的微生物群 体，促进其基因发生突变的育种技术就称为 诱变育种。其中诱变剂是指能诱致基因突变， 明显提高基因突变频率的理化和生物因素。


目的——将产生菌的一些有益变异，通过不断 的筛选和培育，为研究和生产提供更多合乎需 要的高产优质新菌种。
自然选育
诱变育种





微生物菌体发酵：即以获得具有药用菌体为目的发酵。 如：帮助消化的酵母菌片和具有整肠作用的乳酸菌制剂等； 药用真菌，如香菇类、灵芝、金针菇、依赖虫蛹而生存的冬 虫夏草菌以及与天麻共生的密环菌等药用真菌；一些具有致 病能力的微生物菌体，经发酵培养，再减毒或灭活后，可以 制成用于自动免疫的生物制品。 微生物酶发酵：目前许多医药用酶制剂是通过微生物发酵制 得的，如用于抗癌的天冬酰胺酶和用于治疗血栓的纳豆激酶 和链激酶等。 微生物代谢产物发酵：微生物在其生产和代谢的过程中，产 生的各种初级代谢产物和次级代谢产物中许多是可以用于制 作药物的。 如初级代谢产物：氨基酸、蛋白质、核苷酸、类脂、糖类以 及维生素等；次级代谢产物：抗生素、生物碱、细菌素等。
第一节


微生物细胞的培养概述
工业生产常用微生物
当前发酵工业所用菌种的总趋势是从野生菌转向 变异菌，从自然选育转向代谢控制育种，从诱发 基因突变转向基因重组的定向育种。 工业生产上常用的微生物主要是细菌、放线菌、 酵母菌和霉菌，由于发酵工程本身的发展以及遗 传工程的介入，藻类、病毒等也正在逐步地变为 工业生产用的微生物。
第四章 4.1 微生物细胞培养概述
2、发酵培养基的组成。 （1）碳源：构成菌体及产物的碳架及能量 来源。 （2）氮源：构成菌体本身的含氮物及代谢 产物中的含氮物。 （3）无机盐：构成菌体原生质成分，酶的 组分或维持酶的活性，调节细胞渗透压， 参与产物生物合成等 。

第四章 4.1 微生物细胞培养概述
工业生产常用微生物
4、酵母菌 酵母菌为单细胞真核生物，在自然界中普 遍存在。 发酵工业常用的酵母菌有：酿酒酵母、假 丝酵母和类酵母等， 主要用于酿酒、制造面包、制造低凝固点 石油和生产脂肪酶，以及生产可食用、药 用和饲料用的酵母菌体蛋白等。

工业生产常用微生物



4、霉菌：霉菌在自然界中分布很广，发酵工业常 用的霉菌有：根霉、毛霉、曲霉、青霉等，主要 用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激 素等。 5、担子菌：担子菌就是人们常说的菇类。担子菌 资源的利用越来越引起人们的重视，如多糖、橡 胶物质、抗癌药物的开发等。 6、藻类：许多国家已把藻类用作人类保健食品和 饲料，如：螺旋藻；此外，某些藻类还能利用光 能将CO2转变为石油，如：单胞藻。