显微镜及制片技术
微生物学实验一 微生物制片及形态观察
实验一微生物制片及形态观察一、显微镜油镜的使用显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。
显微镜的种类很多，在实验室中常用的有：普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。
1. 结构光学显微镜是由光学放大系统和机械装置两部分组成。
光学系统一般包括目镜、物镜、聚光器、光源等；机械系统一般包括镜筒、物镜转换器、镜台、镜臂和底座等（图1－1）。
图1－1 光学显微镜结构图标本的放大主要由物镜完成，物镜放大倍数越大，它的焦距越短。
焦距越小，物镜的透镜和玻片间距离（工作距离）也小。
油镜的工作距离很短，使用时需格外注意。
目镜只起放大作用，不能提高分辨率，标准目镜的放大倍数是十倍。
聚光镜能使光线照射标本后进入物镜，形成一个大角度的锥形光柱，因而对提高物镜分辨率是很重要的。
聚光镜可以上下移动，以调节光的明暗，可变光栏可以调节入射光束的大小。
显微镜用光源，自然光和灯光都可以，以灯光较好，因光色和强度都容易控制。
一般的显微镜可用普通的灯光，质量高的显微镜要用显微镜灯，才能充分发挥其性能。
有些需要很强照明，如暗视野照明、摄影等，常常使用卤素灯作为光源。
2. 原理显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。
所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。
要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。
显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。
3. 使用方法1）低倍镜观察先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，转动反光镜，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。
减数分裂制片技术及显微观察
第二次分裂： 前期Ⅱ：染色体又开始明显缩短，而其包含的两条染色单体 分得很开，只是着丝点仍然没有分裂。 中期Ⅱ：染色体整齐地排列在分裂细胞的赤道板上，出现纺 锤体。 后期Ⅱ：染色体的着丝点分裂为二，两条姐妹染色单体在纺 锤体的牵引下分别移向两极。 末期Ⅱ：染色体分别到两极后，又重新出现核仁和核膜，同 时细胞质分裂为二，从而使一个母细胞分裂为四个子细胞， 称为四分体（四分孢子），每个子细胞内只含有原来母细胞 的半数的染色体（n）。
中期II染色体呈菊花状。 后期II染色体呈四堆。
七、实验作业 1. 制作具减数分裂图象的细胞学片子至少2
张。 2. 绘制精原细胞的分裂相2个。
实验报告 封面源自实验名称 一 实验目的
二 实验材料
三 实验简要操作步骤
四 实验结果
五 讨论
注意事项：
1）染色充分 1）制片时敲打均匀。
植物花粉减数分裂图1
植物花粉减数分裂图2
蝗虫精巢生殖细胞减数分裂标本观察
雄蝗虫的二倍体细胞为23条染色体， 性染色体为XO型。精原细胞：呈圆形 或卵圆形，核大色深，染色质呈团块状， 不规则排列。 减数分裂I
第一次减数分裂可分为前期Ⅰ、中 期Ⅰ、 后期Ⅰ和末期Ⅰ。 前期I：根据核的形态变化可以划分为 细线期、偶线期、粗线期、双线期和终 变期。
中期II:
后期II:
末期II:
中期Ii 极面观
后期II:
精细胞
减数分裂完成
精细胞与精子
三、实验材料
雄蝗虫精巢
四、实验仪器及用具
多媒体显微演示系统、显微镜、电子天平、 酒精灯、载玻片、盖玻片、镊子、刀片、吸 水纸、解剖针
显微制片中一些实用的小技巧
青
鸡
箱
冠
子
花
种
子
皮
种
表
皮
皮
表
细
皮
胞
细
胞
同等条件下 拍摄，大小 明显有区别。 但不是十分 稳定。
青葙子
鸡冠花子
在金相显微镜下放大到500倍
青葙子
鸡冠花子
再用电脑放大到1000倍的微性状，青葙子表皮细胞垂周壁呈 节节样，鸡冠花子表皮细胞垂周壁光滑，沟槽明显。
降香
又名：花梨木、降 香黄檀，来源：豆 科黄檀属植物降香 檀Dalbergia odorifera 心材
中药微性状观察方法的一些新的进展：
一、放大倍数更大从100倍到500倍，主要是利用金 相显微镜的内置光源的功能。 二、景深合成不用转到PHOTOSHOP，可以在显微 镜观察的过程中一步合成。
这是某型号的金相显微镜(包括普通和偏光)
这个“在Z轴的延伸”就是指 景深合成
速度明显 加快了
不同批次的鸡冠花子
最后一点的泡 沫可不切下， 让切片积在其 中和刀片上。
如果叶子小或 窄，可片叠在 一起夹着切。
叶子先泡软， 切成条，卷叠 起来夹着切。
用一稍粗一点的 棍扎一个洞，把植 物的茎塞进去（也 可把花、叶子等卷 成个棍形），可多 塞几根。
也可用打 洞法夹片
酸枣仁可塞可夹
怕切到手的同仁们，硬 的材料可以夹着刮。 北五味子这样切方便
这样的方法，有助于对药材显微的科学研究，也十分有助于 我们在检定工作中迅速找到我们需要看到的特征。
如果想要细粉，可用这一类细钢锉。
最后强调一下，清理锉的锈和残渣，最好用钢丝刷。
四、如何进行叶表面制片——磨片法
在叶、花、果实的表面显微观察时，往往最困难的 是如何获得足够薄的表面制片。
显微制片技巧
显微制片技巧显微制片技巧一、粉末制片法1．粉末的制备选取有代表性的样品适量，剪成长约0.1cm的小段，置50~60℃的烘箱中干燥（含挥发油的药材温度应更低，把持在30~40℃），然后用粉碎器粉碎，常用的粉碎器有冲窝、铁碾、微型粉碎机等。
粉碎后的粉末过50~60目筛，成药则应过100目筛，置清洁的瓶中备用。
制备粉末时应注意不得有其它的杂物混入，样品应全体过筛，不得留有残渣弃取，过筛后的粉末需充足混匀方可装片。
2．制片方法依据须要不同，可作成临时或永久制片。
（1）临时制片：作临时观察用，随用随作，通常仅能保留1~2周。
直接封片法不经任何处理，直接用于封藏液装片后即可视察。
常用的封躲液有如下几种：a．水：常用蒸馏水。
用于观察淀粉粒等多糖类物质，但易引起淀粉粒膨胀变形，欲测定粉粒大小时不宜用水作封藏剂。
b．稀甘油：用于观察糊粉粒、淀粉粒及其它多糖类物质，为显微制片中最常用的封藏剂。
经水合氯醛透化的电影多加稀甘油一滴，还可防止水合氯醛结晶的析出。
配制时应注意冬气象温低，粘度小，装片时易产赌气泡，可适当配浓一点，而夏天则相反，可配稀一点。
c． 50%甘油酒精：适用范畴同上，透明度较上者强。
d．甘油醋酸液：专用于观察淀粉粒的形态，是目前观察淀粉粒最幻想的封藏剂，可使淀粉粒坚持本来的状况而不膨胀变形，便于测定其大小。
e．乙醇：主要用于观察菊糖及橙皮柑结晶。
因乙醇易挥发，故装片后应立即观察，放置稍久则乙醇挥发产生大批汽泡。
f．水合氯醛：一般作为透明剂，在观察菊糖时，用其作为封藏液，不加热，装片后立即观察，往往能得到比乙醇装片更为幻想的后果。
方法：取干净载玻片，滴加封藏剂1～2滴，用解剖针或火柴杆挑取粉末少许与封藏剂混匀，然后用镊子夹住盖玻片的边沿中部或用食指及拇指拿住盖玻片的边沿，将其一侧边缘压在封藏液旁的载玻片上，慢慢放下至程度地位，用滤纸屑干净载片即可。
装片过程中应注意封藏液要适量，若不足则封藏液不能充斥盖片；过多则溢出盖片，使盖玻片浮动，并易将封藏液溢到盖玻片上面。
实验3减数分裂制片技术和显微镜观察
实验3 减数分裂制片技术和显微镜观察一、实验目的1. 学习花粉母细胞涂抹制片技术，观察细胞减数分裂时期染色体变化规律及特征并绘图。
2.观察花蕾或花药长度与减数分裂时期的关系。
二、实验原理减数分裂是生物在性母细胞成熟形成配子过程中发生的一种特殊有丝分裂，它包括连续两次的细胞分裂阶段，最终分裂为染色体数目减半的四个子细胞，从而发育为雌性或雄性配子（n）。
由于植物花药取材容易，操作和鉴定比较方便，故一般都取用花粉母细胞作为减数分裂制片材料。
在生物发育的适宜时期取样、固定、涂片等程序，便可在显微镜下观察到减数分裂过程中染色体的行为变化。
三、实验材料lily百合（2n=24）四、实验步骤（一）取材lily百合：通常花蕾长度18mm（花药长度8mm）时为花粉母细胞分裂始期。
花蕾约40mm（花药长17mm）时为减数分裂终期。
采集18-40mm不同长度的花蕾，固定，保存。
（二）制片从小花中取出花药1~3 枚置于载玻片 滴一滴醋酸洋红溶液 用镊子按压花药 去尽肉眼可见残渣 染色2分钟 盖上盖玻片 在低倍镜下寻找花粉母细胞 高倍镜下观察各分裂相细胞染色体的特征及变化规律.选择典型分裂相的临时片1~2张 在酒精灯火焰上缓缓烘干（不能沸腾！） 将玻片放入液氮罐，在液氮表面冷冻1分钟 取出玻片放在白纸上，手按盖玻片一边，用刀片从另一边将盖玻片揭开置于白纸上（有材料的一面朝上） 滴一滴中性树胶在载玻片上的材料处 原位盖上盖玻片→树胶凝固后镜检。
1. 取花药1枚（截）置载玻片中央2. 加1滴染色液3.用镊子按压，并镊除可见残渣4.放上盖玻片（三）显微镜观察先在低倍镜下寻找具分裂相的花粉母细胞，然后依次转换到高倍镜观察减数分裂各个时期染色体的行为和形态特征。
区分4 类细胞：1 形状较大，圆形，核大，着色较浅的是花粉母细胞。
2 形状较小、着色较深的是花药壁体细胞。
3 形状居中略呈扇形的是四分体的小孢子。
4 形状较大，内部透明并有明显外壳的是成熟的花粉粒。
显微镜的使用及涂片染色技术
明视野显微镜的原理及使用1、定义：通过聚焦镜汇聚到样品上，因而形成一个锥形的明亮光束并通过样品进入物镜的显微镜。
用于观察经染色或本身具备颜色的细胞、组织片等标本。
明视野显微镜是最通用的一种光学显微镜。
2、组成部件⑴机械系统部分①镜座显微镜的基本支架，由底座和镜臂组成。
②载物台支持被检标本的平台。
③镜筒空心的圆筒，装置于镜臂上端，上接目镜，下接转换器。
目前，显微镜多见斜筒式，特别是双镜斜筒的，使观察时眼睛不易疲劳，用起来方便。
④转换器位于镜筒的下端，是一个可以旋转的圆盘，用于装物镜。
镜检时，转动转换器转换物镜。
⑤调焦装置包括粗细调焦旋钮，是调节载物台上下移动的装置。
它是获得清晰图像的关键。
粗调只做粗略的调焦，对低倍观察仅用粗调就能获得清晰图像，在采用高倍镜和油镜时，粗调获得模糊物象后，还需细调才能看清物象。
⑵光学系统部分①物镜分为干燥系物镜（放大60倍以下的物镜）和油浸系物镜（放大100被的物镜）。
干燥系物镜和标本之间的介质是空气；油浸系物镜与标本之间必须加入香柏油才能观察到清晰物象。
物镜的放大倍数常有8×、10×、20×、40×、60×、100×。
一般光学显微镜仅有其中的3-4种。
②目镜插入镜筒上端，供眼睛观察物象用。
一般目镜镜筒越长，放大倍数越小。
常有3×、5×、8×、10×、15×等种数。
③集光器可以上下移动，以调节最适光度，附有的虹彩光圈，用于调节光线的强弱。
3、使用方法及注意事项。
⑴观察任何需要镜检的标本都可以先用低倍镜观察，找到目标物，然后旋动转化器转换成高倍镜观察，再适度旋转细调焦旋钮，就能观察到目的物象。
⑵油镜的使用镜检细菌及真菌菌体形态时需采用放大100被的油镜。
需要在标本与镜头之间滴加香柏油。
镜检完毕后，先用插镜纸将镜头上的香柏油擦去，再用擦镜纸蘸少许二甲苯，将镜头上残留的香柏油擦去，并将二甲苯擦去。
实验四：生物显微制片技术
生物显微制片技术一、实验目的：1．练习并掌握徒手切片方法2．初步掌握利用徒手切片制作永久切片的方法二、药品与器材普通生物显微镜、纱布、吸水纸、载玻片、盖玻片、培养皿、小烧杯、滴管、双面刀片、毛笔、镊子、解剖针、蒸馏水、青霉素瓶子、胡萝卜、植物幼叶；酒精、二甲苯、加拿大树胶或者中性树脂、FAA固定液三、实验内容（一）选材正常、软硬适中的植物器官或组织为材料，所取的新鲜材料应及时放入水中，以免徒手切片时萎蔫。
材料太硬时，可用 1.5％的氢氟酸或用甘油和70％酒精的等量混合液进行软化处理；材料太软时，可用马铃薯块茎、胡萝卜肉根等作支持物，把材料夹在其中进行切片。
一般直径不超过5mm，长度以15-25mm为宜。
（二）切片1．修材料（修夹持物）长3厘米宽0.5厘米，切面修平。
2．握材料、持刀片用左手的拇指、食指和中指夹住材料。
为防止切片时割伤手指，应使材料上端（切面）略高与食指，拇指略低于食指。
用右手的拇指和食指捏住刀片一端，置于右手食指之上，刀片和材料切面平行，刀刃放在材料左前方稍低于材料断面的位置。
3．切材料以均匀的力量和平稳的动作使刀刃自左前方向右后方斜滑拉切，注意不要直切，中途不停顿，拉切速度要快，不要推前拖后（拉锯式）切割，左手食指向下稍微移动，使材料略有上升，从而调动每张切片的厚度。
切片过程中右手不动，只是右臂移动，动作用臂力而不用腕力。
4．放材料切片要薄、平而完整，将切下的切片用毛笔刷蘸水从刀片上轻轻移入培养皿的清水中或直接将刀片浸没于水中使切片漂洗下来（三）制作临时装片1．擦玻片手指用力要均匀，否则易拭破。
2．滴蒸馏水在载玻片中央，滴加一、二滴清水3．选材料、放材料用镊子将材料放置在上面，用解剖针展平4．盖玻片盖盖玻片时，用镊子夹起盖玻片，使载玻片一边先放下，接触一边水，然后再轻轻放平，以免水中产生气泡，影响观察。
如仍有气泡，可用镊子加压盖玻片，将气泡赶出。
如水分过多，可用滤纸条将水吸干，如水分不足，可在盖玻片边沿用滴管加水少许。
显微鉴别制片流程
显微鉴别制片流程一、引言显微鉴别制片是一种常用的实验方法，用于观察和鉴定样品的微观结构和组成。
本文将介绍显微鉴别制片的流程和步骤。
二、材料准备在进行显微鉴别制片之前，需要准备一些基本的材料和设备，包括显微镜、载玻片、盖玻片、显微镜镜片液、吸水纸、刮片器等。
确保这些材料都是干净的，并做好消毒处理。
三、样品制备1. 样品的选择：根据需要鉴定的对象，选择合适的样品进行制备。
可以是生物组织、细胞、昆虫、植物等。
2. 样品的固定：将样品进行固定处理，常用的方法有乙醛固定、福尔马林固定等。
固定处理的目的是保持样品的形态结构和化学组成。
3. 样品的切片：将固定的样品切成薄片，常用的方法有手工切片和切片机切片。
切片的厚度通常在几微米到几十微米之间，根据需要进行调整。
4. 制片：将切好的样品片放在载玻片上，加入适量的显微镜镜片液，然后用盖玻片盖住样品，使样品均匀分布在载玻片上。
四、制片处理1. 倒置法：将制好的载玻片倒置放在吸水纸上，使吸水纸吸去多余的显微镜镜片液，然后轻轻擦拭载玻片的边缘，以去除多余的显微镜镜片液。
2. 加热法：将制好的载玻片置于加热板上，加热一段时间，使显微镜镜片液快速挥发，加快制片的干燥速度。
3. 固定法：将制好的载玻片放置在通气干燥器中，使其自然干燥，确保样品的完整性和稳定性。
五、显微镜观察1. 调节显微镜：将制好的载玻片放在显微镜的载物台上，调节显微镜的倍数和焦距，使样品清晰可见。
2. 观察样品：通过显微镜观察样品的细节和结构，可以使用不同的显微镜技术，如亮场显微镜、荧光显微镜、相差显微镜等，以获取不同的信息。
3. 记录结果：将观察到的结果进行记录和描述，包括样品的形态特征、细胞结构、组织构成等。
六、鉴别分析根据观察到的结果和已有的知识，对样品进行鉴别分析。
可以比对数据库中的标准样品，进行相似性分析和对比，确定样品的种类和属性。
七、结果解释根据鉴别分析的结果，对样品的性质和特点进行解释和阐述。
显微制片技巧
中药显微鉴定知识总结中药鉴定常用的鉴定方法有：（原植物、动物和矿物）鉴定法、性状鉴定法、显微鉴定法及理化鉴定法等。
显微鉴定法是利用显微技术对中药进行显微分析，以确定其品种和质量的一种鉴定方法。
显微鉴定主要包括组织鉴定和粉末鉴定，利用显微镜来观察药材的组织构造、细胞形状及内含物的特征、矿物的光学特性，和用显微化学方法，确定细胞壁及细胞内含物的性质或某些品种有效成分在组织中的分布等，用以鉴别药材的真伪与纯度甚至品质。
（一）显微制片方法显微鉴定时可根据检品的不同情况制作相应的制片，包括横切片或纵切片、表面制片、粉末制片、解离组织片、花粉粒与孢子制片、磨片制片、含粉末药材的制剂显微纸片等。
制作解离组织片时，解离液选择原则为：如样品中薄壁组织占大部分，木化组织少或分散存在，可用氢氧化钾法；如果样品坚硬，木化组织较多或集成较大群束，可用硝铬酸法或氯酸钾法。
（二）植物细胞壁和内含物的鉴别（1）细胞壁性质的鉴别：①木质化细胞壁加间苯三酚试液显红色或紫红色。
②木栓化或角质化细胞壁加苏丹Ш显橘红色至红色。
③纤堆素细胞壁加氯化锌碘试液显蓝色或紫色。
④硅质化细胞壁加硫酸无变化。
（2）细胞内含物性质的鉴别：①淀粉拉加碘试液显蓝色或紫色。
②糊粉粒加碘试液显棕色或黄棕色。
加硝酸汞试液显砖红色。
③脂肪油、挥发油或树脂加苏丹Ш试液显橘红色、红色或紫红色。
④菊糖加10%α-萘酚乙醇溶液，再加硫酸显紫红色并很快溶解。
⑤黏液加钌红试液显红色。
⑥草酸钙结晶加稀醋酸不溶解，加稀盐酸溶解而无气泡发生。
加硫酸逐渐溶解，析出结晶。
⑦碳酸钙结晶（钟乳体）加稀盐酸溶解，同时有气泡发生。
⑧硅质加硫酸不溶解。
（四）显微临时制片常用封藏试液显微鉴定所用试剂包括水、稀甘油、甘油醋酸试液及水合氯醛试液。
（五）扫描电子显微镜和偏光显微镜的应用扫描电镜已广泛应用于生物样品表面及其断面立体形貌的观察。
偏光显微镜主要用于观察和分析矿物类中药的光学性质。
（六）1、细胞壁性质的鉴别：木质化细胞壁：间苯三酚，显红色或紫红色;木栓化(角质化)细胞壁：苏丹Ⅲ号，加热后显红色;纤维素细胞壁：氯化锌碘试液，显蓝色或紫色;硅质化细胞壁：硫酸无变化 2、细胞内含物的鉴定淀粉粒：加碘试液，蓝色或紫色。
微生物基本操作规范之制片、染色及显微观察
规范操作基础培训
5 制片、染色及显微观察
主要内容：
➢§ 1 清洗、消毒和灭菌操作 ➢§ 2 培养基的制备 ➢§ 3 采样和取、制样 ➢§ 4 接种、分离纯化
➢§ 5 制片、染色及显微观察
➢§ 6 实验室安全基础知识
5.1 显微操作
显微镜是微生物检验中最常用的精密 光学仪器。
显微镜的种类很多，在实验室中常用 的有：普通光学显微镜、暗视野显微镜、 相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。
涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脱色→水洗→复பைடு நூலகம்→水洗 →干燥→观察
1．取培养物分别做涂片、干燥、固定，方法均与简单染 色的相同。
2．用草酸铵结晶紫染色1min后水洗。 3．加碘液媒染1min后水洗。 4．斜置载玻片，滴加95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现
紫色 为止，大约需时20~30s，随即水洗。 5．用蕃红染液复染1min，水洗。 6．用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低
细菌的大小与形态
细菌的测量单位： 微米(μm)
细菌的形态
球菌
杆菌
螺形菌
染色方法
(一)简单染色法
简单染色法又叫作普通染色法，只用一种 染料使细菌染上颜色，观察细菌的形态。
(二)复染色法 用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性
质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革 兰氏染色法和抗酸性染色法。
油晕不再扩大为止）； 4.用微调焦螺旋调至清晰。
注意：油镜的操作需要较强的关线，故需将光线 调至最强。
用10倍和/或40倍物镜为随后的高倍油镜（90倍 或100倍）选择合适的视野（油镜镜筒上通常刻有 H.I.OIL或OEL等标志）
光学显微镜制片步骤
光学显微镜制片步骤光学显微镜制片步骤是观察生物样品在显微镜下结构的关键过程。
以下是详细的步骤指南：1. 样品准备：在开始制片之前，需要准备待观察的样品。
样品可以是生物组织、细胞或其他微小结构。
确保样品新鲜且无污染。
如果可能，使用无菌技术处理样品以避免污染。
2. 载玻片准备：载玻片是用来放置样品的玻璃片。
首先，清洁载玻片，确保其表面无任何杂质。
然后，根据需要，可以选择在载玻片上涂上一层薄薄的粘附剂，以便更好地固定样品。
3. 样品安置：将准备好的样品放置在载玻片上。
对于细胞或组织样品，可能需要使用细针或刀片将其切割成更小的部分。
确保样品在载玻片上稳定，且不会在后续的染色和观察过程中滑落。
4. 滴加染色液：选择适合观察样品的染色方法。
染色液可以使样品中的不同结构呈现不同的颜色，从而提高显微镜下观察的对比度。
根据所使用的染色技术，向载玻片上滴加适量的染色液。
确保染色液覆盖整个样品，并等待染色液与样品充分反应。
5. 盖片安置：在完成染色后，将盖片放置在载玻片上，以封住样品并保护它免受污染。
盖片应该与载玻片紧密贴合，以确保没有空气泡干扰后续的观察。
6. 显微镜检查：现在可以开始使用显微镜观察样品了。
首先，调整显微镜的焦距，使样品清晰地呈现在视野中。
然后，根据需要调整光源强度和其他显微镜参数，以便更好地观察样品的结构和细节。
观察时，可以逐步增加放大倍数以查看更详细的特征。
通过遵循以上步骤，您应该能够成功地制备出可用于光学显微镜观察的样品。
请注意，每个步骤都很重要，因此请务必仔细执行每一步以确保最终观察结果的准确性。
植物制片的染色及显微化学鉴定方法
植物制片的染色及显微化学鉴定方法植物制片是植物解剖学研究的基础，主要包括了样品的采集、处理、包埋和切片等步骤。
制片的质量直接影响着后续染色和显微化学鉴定结果的准确性和可靠性。
以下是植物制片的一般步骤：1.采集样品：根据研究需要，采集符合实验要求的植物部件，如叶片、茎、花粉等。
2.处理样品：对采集到的植物样品进行初步处理，如去除杂质、保持新鲜等。
3.包埋样品：将处理后的样品进行包埋，使用适宜的包埋剂，如石腊、低熔点石蜡等。
4. 切片样品：将包埋好的样品进行切片，使用微tome等工具进行切割，制备出适当厚度的切片。
一旦制片完成后，接下来需要进行染色和显微化学鉴定。
染色方法可以增强显微镜下的观察效果，常见的染色方法包括常规染色和特殊染色。
1.常规染色方法：最常用的染色方法是使用苏丹精、碘红等生物染料，用于染色细胞壁、细胞核等常见组织结构。
常规染色方法可以提供植物组织的基本信息。
2.特殊染色方法：特殊染色方法主要用于特定的组织结构或化学物质的染色。
如使用苏木精-伊红染色对木质部和木质纤维进行染色，使用布氏染色对淀粉进行染色等。
显微化学鉴定方法是通过对制片样品进行特定试剂处理，以便于观察和检测特定化学物质的存在与否。
常用的显微化学鉴定方法包括：1.反应性染色：使用生化试剂或化学试剂与组织中的化学物质进行反应，产生特定的颜色或沉淀。
如使用碘酸钾溶液对淀粉进行碘反应形成蓝色物质。
2.酶反应：通过加入适当的酶试剂，使显色底物发生氧化还原反应，形成显色产物。
如使用过氧化氢试剂对过氧化物酶进行酶反应产生氧气和水。
3.化学反应：使用特定化学试剂，对特定化学物质进行识别。
如使用铁氰化钾试剂对根际紧矿质进行化学反应，生成蓝色的沉淀。
植物制片的染色及显微化学鉴定方法，通过染色和试剂处理等手段，可以使植物组织结构变得更加清晰和可见，从而更好地研究和识别植物的组织结构、化学成分和功能。
这些方法对于植物科学研究和植物学教学有着重要价值。
实验1显微镜的使用保养与中药临时制片技术
福尔马林（37％~40％甲醛） 5ml
冰醋酸
5ml
➢取材 材料分割成适当大小，直径必须小于
盖玻片。 ➢材料软化或冲洗
坚硬的干燥材料于稀甘油10％醋酸液中 煮至表面无气泡。
固定材料需在流水中冲洗12小时以上。
➢操作：取新鲜或已软化的中药材，用拇指及 食指和中指夹住材料，下端用无名指托住，另 外一只手持刀片，自左向右移动手腕，牵曳切 片。 ➢操作时材料的断面与刀口须经常用水湿润。 ➢以毛笔将切好的薄片移入在盛水培养皿 中浸泡。
➢装片 将切片以镊子夹出，置于滴加了甘油的载
玻片上，加上盖玻片；或滴加水合氯醛加热透 化，滴加稀甘油后加上盖玻片。
作业与思考 1、实验完成后应做哪些善后工作？ 2、由低倍镜转换成高倍镜后，调焦时应注意
什么？ 3.寻找被观察物时应如何操作？
4、进行粉末水合氯醛加热透化过程中，应注 意哪些关键问题？
一、显微镜的使用和保养
显微镜的结构 ➢镜座 ➢镜臂 ➢镜筒 ➢载物台 ➢光路系统：目镜、物镜、集光器、光源
物镜 ➢低倍镜：4×、10 × ——用于观察整体结构、寻找特定特征。 ➢高倍镜：40 ×、100 ×（油镜） ——用于观察特定细微结构与组织特征， 油镜较为少用。
使用注意与技巧 ➢先低倍后高倍，即先整体后局部 ➢之字形扫描式寻找需要观察的特征 ➢由低倍镜转成高倍镜后，只能使用微调 ➢高倍镜观察时，应通过控制光源强度、 集光器高低、虹彩光阑的张合，并结合 微调，使被观察物清晰。
天花粉粉末——石细胞
天花粉粉末——具缘纹孔Байду номын сангаас管
水合氯醛或乙醇装片 ➢适用于观察菊糖。 ➢装置液：水合氯醛或乙醇。 ➢不可加热，否则菊糖溶解。
党参菊糖（水合氯醛装置）
显微制片技巧
显微制片技巧显微制片技巧一、粉末制片法1．粉末的制备选取有代表性的样品适量，剪成长约0.1cm的小段，置50~60℃的烘箱中干燥（含挥发油的药材温度应更低，把持在30~40℃），然后用粉碎器粉碎，常用的粉碎器有冲窝、铁碾、微型粉碎机等。
粉碎后的粉末过50~60目筛，成药则应过100目筛，置清洁的瓶中备用。
制备粉末时应注意不得有其它的杂物混入，样品应全体过筛，不得留有残渣弃取，过筛后的粉末需充足混匀方可装片。
2．制片方法依据须要不同，可作成临时或永久制片。
（1）临时制片：作临时观察用，随用随作，通常仅能保留1~2周。
直接封片法不经任何处理，直接用于封藏液装片后即可视察。
常用的封躲液有如下几种：a．水：常用蒸馏水。
用于观察淀粉粒等多糖类物质，但易引起淀粉粒膨胀变形，欲测定粉粒大小时不宜用水作封藏剂。
b．稀甘油：用于观察糊粉粒、淀粉粒及其它多糖类物质，为显微制片中最常用的封藏剂。
经水合氯醛透化的电影多加稀甘油一滴，还可防止水合氯醛结晶的析出。
配制时应注意冬气象温低，粘度小，装片时易产赌气泡，可适当配浓一点，而夏天则相反，可配稀一点。
c． 50%甘油酒精：适用范畴同上，透明度较上者强。
d．甘油醋酸液：专用于观察淀粉粒的形态，是目前观察淀粉粒最幻想的封藏剂，可使淀粉粒坚持本来的状况而不膨胀变形，便于测定其大小。
e．乙醇：主要用于观察菊糖及橙皮柑结晶。
因乙醇易挥发，故装片后应立即观察，放置稍久则乙醇挥发产生大批汽泡。
f．水合氯醛：一般作为透明剂，在观察菊糖时，用其作为封藏液，不加热，装片后立即观察，往往能得到比乙醇装片更为幻想的后果。
方法：取干净载玻片，滴加封藏剂1～2滴，用解剖针或火柴杆挑取粉末少许与封藏剂混匀，然后用镊子夹住盖玻片的边沿中部或用食指及拇指拿住盖玻片的边沿，将其一侧边缘压在封藏液旁的载玻片上，慢慢放下至程度地位，用滤纸屑干净载片即可。
装片过程中应注意封藏液要适量，若不足则封藏液不能充斥盖片；过多则溢出盖片，使盖玻片浮动，并易将封藏液溢到盖玻片上面。
光学显微标本的制作技术
光学显微标本的制作技术【实验目的】了解光学显微镜切片制作技术的基本方法步骤。
【实验原理】采用光学显微镜研究一般生物体的内部结构，在自然状态下是无法观察清楚的，多数动、植物材料都必须经过某种处理，将组织别离成单个细胞或薄片，光线才能通过细胞。
为了适应这个需要，就产生了光学显微镜制片技术。
光学显微镜的制片技术方法可分为两大类：一类是非切片法，另一类是切片法。
非切片法，是用物理或化学的方法，使细胞彼此别离，如有别离法、涂布法、压碎法等。
非切片法的操作比较简单，能保侍细胞的完整，但是细胞之间的正常位置往往被更动，无法反映细胞之间的正常联系。
它可以与切片法配合使用，各取其长处。
切片法，是利用锐利的刃具将组织切成极薄的片层，材料须经过一系列特殊的处理，如固定、脱水、包埋、切片、染色等，过程十分繁复。
在制作过程中，还要经过一系列的物理和化学的处理，这些处理方法可根据各种不同材料的性质要求进行合理选择。
切片法虽然工序繁琐，技术复杂，但是，它最能保持细胞间的正常的相互关系，能较好和较长时间地保留细胞的原貌，所以仍然是光学显微镜的主要制片方法。
【实验仪器、材料和试剂】〔一〕仪器：石蜡切片机、恒温蜡箱、载玻片、盖玻片〔二〕材料：洋葱根或小鼠肝〔三〕试剂：乙醚、无水乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、重铬酸钾、锇酸、正丁醇、二甲苯、石蜡、甘油、鸡蛋、纱布、加拿大树胶、麝香草酚【方法与步骤】光学显微镜切片制作技术最简单的切片法是徒手切片，但是由于组织块往往十分柔软，18切削很困难，而且无法得到十分菲薄的切片，因此必须先用某些特殊物质渗入组织块的内部起支持作用，并将整个组织块包住，然后再用精密的切片机制作切片，才能获得良好的效果。
这种方法称为包埋法，包埋的物质称为包埋剂。
常用的包埋剂有石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等，水和塑料也可作为包埋剂。
根据包埋剂的不同，分别有石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切片等，它们各有长处，可以根据需要选用，但是使用得最多的还是石蜡切片技术。
光学显微镜制片技术_百替生物
光学显微镜制片技术technique for microscopical slides将生物材料制成适于在下观察的薄片的技术。
新鲜的生物材料虽然用简单的方法做成临时制片也可观察，但为了保存以备以后的观察，常需按一定步骤制成永久制片。
显微制片首先要尽量保持生物材料的天然状态，避免膺像、变形和失真,因此须将生物材料做固定处理;制片必须薄而透明，才能在下成像，除将材料切成薄片或通过轻压或其他手段使之分散外，还需采用其他方法使它透明和染色，以便更好地观察到结构的细节。
需长期保存的制片，还应进行脱水和封固。
显微制片法一般包括切片法、整体封片法、涂片法和压片法4大类。
切片法光学显微镜的切片厚度在2～25微米之间，一般动植物材料的切片以厚10微米左右为合适。
切片法根据包埋剂的不同而有所不同。
最常用的是石蜡切片法，它适用于一般生物材料。
棉胶切片法，把生物材料经棉胶包埋后切片。
适用于特别坚硬的材料或特别柔软而体积大的材料（如完整的大脑）。
冰冻切片法，将生物材料在一定的介质中冰冻固化后切片。
适用于研究活体标本或作组织化学的研究。
乙二醇甲基丙烯酸脂法（简称GMA法）,适用于制作1～3微米厚的切片。
石蜡切片法包括固定、包埋、切片、染色、脱水和封固等步骤。
关键是把生物材料用石蜡包埋，以石蜡为支持物，把浸在蜡块中的生物材料切成理想的薄片。
操作过程为：固定→水洗→从低浓度逐级到高浓度酒精脱水→二甲苯透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→二甲苯脱蜡→逐级从高浓度到低浓度酒精处理，最后过渡到水→染色→逐级从低浓度到高浓度酒精脱水→二甲苯透明→树脂胶封固。
其中的基本步骤在各种制片技术中都是相同的。
固定用物理的或化学的方法将生物材料迅速杀死、使蛋白质变性和凝固，达到保持细胞的形状和内部结构的目的。
物理固定法常用冷冻处理或火焰烘烤。
化学固定法，主要是把生物材料迅速浸泡在固定剂中。
固定剂常是含有几种化合物的混合液，既有强烈凝固蛋白质的化合物，也有非凝固性的化合物，它们对蛋白质起交联和稳定作用，即所谓“鞣化作用”。
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二、植物制片技术
植物体大部分都是不透明的不能直接观察。我们 需要利用各种方法对植物体进行处理，将其制成使 光线能够透过的制片。根据制片标本可保存的时间 长短通常将其分为临时制片和永久制片两大类型。 现对几种常用的制片方法介绍如下：
（一）：临时玻片标本制作 （二）：徒手切片法 （三）：石蜡制片法
（一）、临时玻片标本的制作
（二).显微镜的类型
显微镜可分为光学显微镜和电子显微镜
光学显微镜以可见光作为光源,用玻璃制
作透镜的显微镜.其有效放大倍数可达1250倍, 最高分辨力为0.2微米.
电子显微镜使用电子束作光源的一类显
微镜,以特殊的电极和磁极作为透镜代替玻璃 透镜,能分辨相距0.2左右的物体放大倍数可80 120万倍
：
电子显微镜
使用电子束作光源的年一类显微镜,以特殊的电极和磁极 作为透镜代替玻璃透镜,能分辨相距0.2左右的物体放大倍数可 80120万倍。 透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的 物像， 投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。透射电镜的分辨 率为0.1～0.2nm，放大倍数为几万～几十万倍。 点击看图 扫描电镜是用极细的电子束在样品表面扫描，将产生 的二次电子用特制的探测器收集，形成电信号运送到显像 管，在荧光屏上显示物体。（细胞、组织）表面的立体构 像，可摄制成照片。 点击看图
1.显微镜的光学原理
被检物AB放在物镜 (O1) 下方的一倍焦距之 间，则在物镜 (O1) 后方形成一个倒立得放大实像， 这个实像正好位于目镜 (O2) 的下焦点之内，通过目 镜后形成一个放大的虚像 A2B2，这个虚像通过调 焦装置使其落在眼睛明视距处，即 25cm ，使所看 到的物体最清晰，也就是虚像A2B2 是在眼睛晶状 体的两倍焦距之外，在眼球后的视网膜形成一个倒立 的 A2B2 缩小像A3B3.
（3）、切片时现在材料和刀口蘸些水，并使材料 和、装片都保持在水平位置，再用臂力进行连续切片 每当切下数薄片时，即用毛笔蘸水，将切好的薄片拨 到培养皿中。 3、装片 从切好的材料中，用毛笔挑出完整的、薄的、切 面正的切片制成临时水装玻片标本，放置在显微镜下 观察。
（三）石蜡制片法
1、材料与器具： （1）解剖刀、解剖针、镊子、培养皿、吸管、恒温箱、 酒精灯、面盆、纸盒、切片机、毛笔、蜡带盘、载玻片、 盖玻片、水浴锅、染色缸、展片台、树胶瓶、显微镜、 真空泵、烤片架。 （2）酒精、二甲苯、冰醋酸、福尔马林、石蜡、潘虹、 固绿、中性树胶。 （3）植物材料 2、实验过程
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目的与要求
1、了解显微镜的构造及维护。 2、初步掌握使用显微镜地方法。 3、了解光学显微镜的主要类型. 4、了解普通显微镜的成像原理及光路图
临界照明：光源经扣光镜后哦汇聚在被检物 体，光束狭而强，这是它的优点，但是光源的灯丝 像与被检物体的平面重合，这样就造成被检物体的 照明呈现出不均匀性，在有灯丝的部分则明亮，无 灯丝的部分则暗淡，不仅影响成像质量，更不适于 显微照相。
柯拉照明：照明光路中的光学组件包括光源、集 光器、视场光栏、孔径光栏、聚光器和物台。在柯 拉照明光路中，在集光器透镜两侧，灯丝和孔径光 栏位一对共轭面，灯丝的像成在孔径光栏的平面 上。在聚光器透镜两侧，视场光栏和物台为一对共 轭面，视场光栏的像呈现在舞台上，因此柯拉照明 比临界照明要优越。一是照明均匀。二是通过调节 视场光栏的大小和位置可以可以控制标本平面上照 明区域的大小和位置。
3.油镜的使用.
（1）先从低倍油镜找到被检部分后,再换高倍镜调整 焦点,然后再换用油浸镜头. （2）在换用油镜前在盖玻片上滴加一滴香波油，在 油镜观察标本时，用细调焦螺旋调节焦点。 （3）油镜使用完毕，需立即擦净，擦拭方法是用棉 棒或擦镜纸蘸少许清洁剂（乙醇或无水酒精的混合 物，最好不用二甲苯，以免侵入镜头后使树胶溶化， 透镜松散）
荧光显微镜是用以观察细胞及组织内荧光物质的分 布。它是装有、能产生紫外线（短波长）的光源及系列 滤片装置的显微镜。
相差显微镜的特点①装有不同大 小环状光阑的聚光器。②物镜内装有位 相板。③中心望远镜装置。相差显微镜 的基本原理是通过上述装置。把透过标 本的可见光的相位差变成振幅 差，从而 提高了标本内各种结构之间的对比度， 使标本中的结构清晰可辨。
（六）.测微尺的使用
台式测微尺
目镜测微尺
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1。 将目镜测量尺（目尺）刻度向下装在目镜内。将镜 台测量尺（台尺）安置在载物台上，调焦使台尺上的标尺分 度清晰。使台尺与目尺上的标尺在“0”刻度上对齐。
目镜测微尺的格植(微米)=两重合线间 台式测微尺的格数×10微米
目镜测微尺的格数
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2。将台尺取下换上待测标本，观察所测物体所占 目标尺的格数，再乘以目标尺上每格的长度，即为被 测物体的长度。 台式测微尺一种特制的载玻片，具带刻度的标尺 长1mm 分100小格。每格0.01mm 即10微米
透射电镜
（三）.显微镜的构造
显微镜的基本构 造包括两大部分,光学 系统和机械系统,机械 系统有镜座,镜柱,镜 壁,镜筒,物镜转换器, 载物台,调焦螺旋,聚 光器调节螺旋.光学系 统有物镜,目镜,反光 镜,聚光器,虹彩光圈.
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Байду номын сангаас
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（四）.使用显微镜的主要步骤和方法
三、绘图法 绘、标、注
合理布局 先绘草图 绘图和文字一律用3H铅笔 图注在右侧,平行线引出 图形一律点线表示,明暗和颜色深浅用不同密度 圆点表示。
（二）、徒手切片法
徒手切片法是指用手拿刀片和材料，并将材料切 成玻片标本的一种切片方法。 1、材料与器具 双面刀片、毛笔、培养皿滴瓶、 新鲜植物材料 2、实验过程
实验过程
1、取材 用刀片将材料切成23CM长，并使材料的上端截面 平整 2、切片 徒手切片时最重要的是，切下一小片平而薄的组织 结构 （1）、左手拇指食指及中指夹住材料，拇指要略 低于食指并使材料稍稍突出于手指之上约3MM （2）、用右手拇指和食指横向平握刀片，置于左 手食指之上，刀口向内，与材料的纵轴垂直。
4、显微镜使用后整理
观察完毕升高镜筒取下玻片，再转 动物镜转换器，使两个物镜位于载物台 上通光孔的两侧，罩上防尘罩。
（五）.放大率
1.显微镜总放大率 =物镜的放大倍数×目镜的放大倍数 2。显微镜的分辨力是主要由镜口率决定 物镜的有效镜口率 =(物镜镜口率+聚光器镜口率)/2 3.目镜光栏所围绕的圆即视野宽度, 视野宽度与放大率成反比 .
光学显微镜
光学显微镜可分为单式显微镜和复式显微 镜。 单式显微镜结构简单,扩大的是方向一致的 虚像. 复式显微镜结构比较复杂,放大倍数较高,包 括普通生物显微镜, 暗视野显微镜, 相差显微 镜, 荧光显微镜等.
单筒复式普通生物显微镜
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普通显微镜 的放大倍数
双筒复式普通生物显微镜
普通生物显微镜的放大倍数
临时玻片标本的制作是使用显微镜观察植物材料 时最基本的技术，现以洋葱叶表皮为实验材料来介绍： 1、材料与仪器 （1）、双面刀片、镊子、毛笔、培养皿、滴 瓶、载玻片盖玻片、软布 （2）、洋葱鳞叶 2、实验过程
实验过程
1、取载玻片和盖玻片用软布擦净 2、用滴管滴12滴清水，滴在载玻片中央。 3、用刀片在洋葱鳞叶外表皮或内表皮划一“井”字，再用 镊子撕取“井”字中央的表皮，并将其平展与载玻片的小水滴 中。 4、用镊子夹取一片干净的盖玻片，先以盖玻片的一边斜 着与小水滴接触，再慢慢放下盖玻片。 5、制作好的标本要求水分充满，当水分不足时，可用滴 管从盖玻片一侧的边缘滴少许水分，再另一侧用吸水纸吸 6、临时装片标本如需短期保存，可滴入10%甘油水溶 液，并放在培养皿中，上加盖子，减少蒸发；如需长期保 存，则应通过固定、染色、脱水、透明、加拿大封藏等步骤 制成永久玻片标本。
物镜是决定显微镜质量好坏的重要部件,放大倍数 有10,40,油镜100倍,目镜放大倍数有5,10,16倍.
10X4 低倍观察 10X10 中倍观察 10X40 高倍观察 10X100 油镜
暗视野显微镜特点是该显微镜具有暗视野聚
光器，使光线不直接进人物镜，故呈暗视野。 暗视野 Dark field microscope 根据Tyndall 效应原理设计， 在黑背景下观察物体的外部 细节，分辨率高该显微镜适用于观察细胞内微 小颗粒，例如线粒体、细菌运动等。
1、低倍镜观察 2、高倍镜的使用 3、油镜的使用 4、显微镜使用后整理
1、低倍镜观察
片切置放和光对） （
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（2）调焦
（3）低倍观察:将需观察的材料放到最有利的位置上,根据材料 的颜色厚薄,成像反差再调节,如:视野太亮可下降聚光器或调小光圈.
2、高倍镜的使用
（1）.选取目标:用低倍镜选取目标,并移至 视野中央,换上高倍镜. （2）.调整焦点:换上高倍镜后视野中即有模 糊图象,调节细准焦螺旋使图象清晰0 （3）.调节亮度,因高倍镜视野较暗需升高聚 光器,或放大光圈
材料和仪器
生物显微镜，测微尺，“E”字玻 片标本，香柏油等
实验内容
一、显微镜 二、植物制片技术 三、绘图法
一、显微镜
（一）.显微镜成像原理 （二).显微镜的类型 (三).显微镜的构造 （四）.使用显微镜的主要步骤和方法 （五）.放大率 （六）.测微尺的使用
（一）显微镜的成像原理
1.显微镜的光学原理 2.显微镜的照明原理 （1）临界照明 （2）柯拉照明