第二十章高效液相色谱法(改动)

第二十章 高效液相色谱法
高效液相色谱法概述
•
高效液相色谱法 HPLC
（high performance liquid chromatograph）
高压输液泵
高效固定相
高灵敏度检测器
• 高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较
见表
• 高效液相色谱法与GC的比较 见表
高效液相色谱法的 分类与基本原理
二甲基硅烷 5，10
• 键合相的性质和特点
含碳量：
指键合在硅胶表面上的烷基所含碳的质量分 数，随链长增长，从3％～22％。
覆盖度： 指硅胶被键合后，在硅胶中的有效羟基与硅 烷试剂反应的程度，在键合后有时还用短链的 硅烷试剂与剩余和新产生的羟基反应，使羟基 全部被”帽盖“（即封尾）而不起作用。
键合相的特点： 使用过程中不流失； 化学稳定性好；
20.2.1 高效液相色谱法的分类
按固定相的聚集状态： LLC和LSC
按分离机制： 分配、吸附、离子交换（IEC）、空间排 阻（SEC）、亲合（AC）、手性（CC）、胶 束（MC）、电色谱法（EC）。
LSC LLC NLLC和RLLC NBPC BPC（狭） 一般RBPC RBPC PIC 一般IEC IEC ISC IC AA（氨基酸分析法） SEC GPC和GFC AC（亲和） MC（胶束） CC（手性）
力项、滞留流动相的传 质阻力相和固定相传质 阻力项。
讨论： 涡流扩散项：填料和填充均匀程度
高 效 液 相 色 谱 柱 的 装 填
纵向扩散项
B 2 D m
T Dm
柱温T 低，流动相 大 B / u项忽略
传质阻力项
C Cm Csm Cs Cm Csm （忽略固定相传质阻抗）
适于梯度洗脱；
载样量大。
流动相（溶剂系统）
HPLC对流动相的要求：
不与固定相反应；对试样有适宜的溶解
度，k在1～10之内，最好在2～5之间；与 检测器相适应；纯度高，粘度小。 使用前滤过，脱气。
20.5.1 分离方程式
n 1 k 2 R 4 1 k2
讨论：α主要受溶剂种类的影响；在溶剂
α
20.5.3 正相洗脱与反相洗脱 溶剂洗脱强度指流动相中溶剂的洗脱能 力, 它不仅与流动相，而且与固定相的极性 有关。在正相色谱中, “溶剂洗脱强度”与溶 剂极性成正比；而在反相色谱中，溶剂极性 越大, 洗脱能力越小。
反相键合相色谱法的溶剂强度用另一强 度因子S表示。
表：反相色谱常用溶剂的强度因子S
HPLC
20.2.2 高效液相色谱法的基本原理 HPLC的范氏方程：
m d 2 smd 2 d 2 2D m p p s f u H 2d p Dm u Dm Ds 涡流扩散项、纵向扩散 项、传质阻力相 其中，传质阻力项又包 括流动相的传质阻
各类高效液相色谱法
20.3.1 液－固吸附色谱法 • 分离机理 溶质分子与流动相分子竞争吸附吸附 剂表面吸附活性中心，靠溶质分子的分配 系数（容量因子）不同而分离。

影响容量因子的因素
溶质分子的极性 溶剂的极性 硅胶的活性
若以硅胶为固定相： 洗脱剂：以烷烃为底剂，加适量极性 调整剂组成的二元或三元流动相。流动相 应该不含水。
主要掌握正相和反相键合相： 键合的基团的极性及适用情况。
表：反相HPLC常用的化学键合相
类 型 长 链 牌号名称 YWG-C18H37 Partisil ODS Zprbax ODS LiChrosorb RP-8 短 链 YWG C6H6 LiChrosorb RP-2 官能团 C18硅烷 C18硅烷 C18硅烷 C8硅烷 苯基硅烷 粒度 /μm 10 5，10 6 5，10 10 形状 非球形 非球形 球形 非球形 非球形 非球形 5％C 15％C 13％～ 14％C 7％C 5％C 说明
• 环糊精色谱法（CDC） 根据环糊精与手性分子的镶嵌关系分 离异构体。

胶束色谱法（MC）
该系统具有固定相－流动相－胶束－ 固定相，3个界面、3个分配系数，具有较 好的选择性。
• 亲合色谱法（Affinity chromatograph） 利用生物大分子 和固定相表面存在 的某种特异性亲和 力，进行选择性分
描述溶剂极性用Snyder提出的溶剂极性参 数P'来衡量。
表：常用溶剂的极性参数和选择性参数 溶剂
正戊烷
P'
0.0
Xe
-
Xd
-
Xn
-
乙醚
二氯甲烷 氯仿 甲醇
2.8
3.1 4.1 5.1
0.53
0.29 0.25 0.48
0.13
0.18 0.41 0.22
0.34
0.53 0.33 0.31
可将81种色谱溶剂，按Xe、 Xd、 Xn在三角形 坐标图上的相邻关系分为8类。 于 作 分 用 选 离 力 择 。 不 不 同 同 ， 组 容 别 易 的 使 溶 剂 改 ， 变 分 ， 子 利
20.3.2 液－液分配色谱法 • 分离机理 靠样品组分溶入固定相与流动相达到 “平衡”后分配系数的差别而分离。

正、反相液－液色谱法
注意流出顺序。
目前，物理涂渍的液－液色谱几乎已被 化学键合相所取代。
20.3.3 化学键合相色谱法 将固定液的官能团键合在载体表面，就 构成化学键合相。以化学键合相为固定相的 色谱法称为化学键合相色谱法，简称键合相 色谱法（bonded phase chromatograph，BPC）
适应范围：
分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的 分子型化合物。
• 反相离子对色谱法（RPIC）
写成通式：
B A m m
(B A )m
KB [B A ]s [ B A ]m

(B A )s
改变流动相的pH值、离子对试剂的 种类和浓度，就可以改变K值和分离的 选择性。
水 0
四 乙 氢 甲醇 乙腈 丙酮 二噁烷 异丙醇 醇 呋 喃 3.0 3.2 3.4 3.5 3.6 4.2 4.5
混合液设计统计技术：
1）根据溶剂选择性分组，选具有显著选择性差 异的溶剂。
反相：水为底剂，甲醇、乙腈和四氢呋喃为选择 性溶剂。 正相：已烷或戊烷为底剂，乙醚、氯仿和二氯甲 烷为选择性溶剂。 2）多元溶剂系统：必须由不同组别的纯溶剂与 底剂组成。一个溶剂系统不宜有两个相同组别的 纯溶剂。
选甲醇、乙腈 粘度小的溶剂
温度一般为室温
综上所述，HPLC应采用：
1)采用小粒径、窄粒度分布的球形固定相， 首选化学键合相，用均浆法装柱； 2）采用低粘度流动相，低流速（1ml/min)； 3）柱温一般以25～35度为宜。太低，则流动 相的粘度增加，温度高易产生气泡。
流速
分析型HPLC一般流量为1mL/min。
md 2 smd 2 p p u Dm Dm
粒径
T C m和Csm 且D m Dm dp C H ，n 柱效
dp
2
Dm H ，n 柱效
T D m C ，但易产生气泡 T ，柱阻
混合溶剂的强度
P混 Pii

R 4 N X Na OH








-
R 4 N OH Na X

R SO 3 H Na OH
R SO 3 Na H 2O
R SO H Na X
R SO Na H X
3



• 手性色谱法（chiral chromatography） ～是利用手性固定相或手性流动相添加 剂分离分析手性化合物的对映异构体的色 谱法。
出峰顺序：
极性强的组分先出柱，极性弱的组分后 出柱。 分析对象： 分离非极性至中等极性的各种分子型化合 物。
影响，保留时间越长。
流动相的表面张力、介电常数和pH值：
对于二元或多元体系改变溶剂的配比 可改变流动相的表面张力和介电常数。通常， 流动相中有机溶剂含量增加，k变小。 例如：在水－甲醇体系中增加甲醇的量，可 降低表面力和介电常数，使容量因子变小。
离子色谱的创始
人是H.Small。
1975年提出抑制
型离子色谱法。
以分析F-、Cl-等阴离子为例：交换柱装 OH型阴离子交换树脂，抑制柱内装H型的强 酸性阳离子交换树脂。流动相是氢氧化钠或 碳酸氢钠组成的稀溶液。
R 4 N OH Na X
R 4 N X Na OH
3



5
与3类似，选择性不同
离子对色谱法的适用对象： 用于有机酸、碱、盐的分离，以及用离 子交换色谱法无法分离的离子型和非离子
型化合物的混合物的分离。
• 离子抑制色谱法
（ion suppression chromatograph，ISC）
在反相色谱法中，通过向流动相加入少 量弱酸（常用乙酸）、弱碱（常用氨水）或 缓冲盐（常用磷酸盐及乙酸盐）来调节流动 相的pH，抑制样品组分的离解，增加它在固 定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱 碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法。
调节pH范围：2～7.5 pH>8.0 pH<2.0 破坏键合相与载体的结合 腐蚀柱子
离子抑制色谱法适用：弱酸碱物质 pKa=3～7弱酸； pKa=7～8弱碱； 两性化合物。
20.3.4 其他色谱法 • 离子色谱法 Ion Chromatography，简称IC 传统离子交换色谱存在着两个难于解决 的问题： a. 需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长； b. 洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测 方法。
表：反相离子对色谱的离子对试剂 序号 1 2 3 4 反离子种类 主要应用对象