200809变性高效液相色谱检测沙门氏菌_空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌

O157 ： H7 感 染 性 腹 泻 是 近 年 来 新 发 现 的 危 害 严 重
的 肠 道 传 染 病 ，它 除 引 起 腹 泻 、出 血 性 肠 炎 外 ，还 可 发 生 溶 血 性 尿 毒 综 合 症 （ HUS ）、 血 栓 性 血 小 板 减 少 性 紫 癜 （ TTP ） 等 严 重 的 并 发 症 ， 后 者 病 情 凶 险 ， 死 亡 率 高 ，已 经 逐 渐 成 为 威 胁 人 群 健 康 的 重 要 公 共 卫 生 问 题 。 90% 以 上 的 弯 曲 菌 感 染 是 由 空 肠 弯 曲 菌
[2]
引 起 的 ，可 导 致 人 类 急 性 肠 炎 、格 林 巴 利 综 合 症 、反 应 性 关 节 炎 、 Reiter ’ s 综 合 症 等 多 种 疾 病 。 目 前 ，
[3]
沙门氏菌 、 空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌 O157 ：H7 已成为我国进出口肉禽类产品检测的主要病原菌 。 沙门氏菌、 空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌
生物技术通报
· 研究报告 ·
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN
2009 年第 3 期
变性高效液相色谱检测沙门氏菌、空肠弯曲菌和 肠出血性大肠杆菌
徐君怡
摘பைடு நூலகம்
曹际娟
郑秋月
刘淑艳
徐杨
（辽宁出入境检验检疫局， 大连 116015）
要： 应用多重 PCR 反应 （multiplex PCR ， mPCR） 结合变性高效液相色谱 （denaturing high -performance liquid
Identification of Salmonella，Campylobacter jejuni and Enterohemorrhagic E.coli by Denaturing High-performance Liquid Chromatography
Xu Junyi Cao Jijuan Zheng Qiuyue Liu Shuyan Xu Yang
24 h 。
试验菌种及其编号
ATCC 33291 ATCC 33560D-5 ATCC 43478 ATCC BAA-1061D ATCC 27374 ATCC BAA-1060D ATCC 25922 ATCC 43887 ATCC 35401 ATCC 35150 ATCC 43893 ATCC 13076 ATCC 49416 ATCC 10708 ATCC 9150 CMCC 49027 ATCC 9610 ATCC 17802 CMCC 93-3 ATCC 33090 ATCC 19111 ATCC 29213 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
国近五年食物中毒统 计资 料 表 明 ，细 菌 性 食 物 中 毒
收稿日期 ：2008-09-10 基金项目 ： 国家 “ 十一五 ” 科技支撑计划课题 （2006BAK02A13 ） 作者简介 ： 徐君怡 （1979- ）， 女 ， 工程师 ， 从事生物安全检验研究 ；E-mail ：skyxjy@yahoo.com
DHPLC） 技术建立食品中沙门氏菌、 空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌 O157： H7 的快速检测方法。 以编码 chromatography， 沙门氏菌的 fimY 基因、 编码空肠弯曲菌的 gyrA 基因和编码肠出血性大肠杆菌 O157： H7 的 rfbE 基因为靶基因， 选择 3 对 引物， 建立并优化了快速鉴别沙门氏菌 、 空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌 O157： H7 的多重 PCR 体系， 扩增产物分别为 284、 159 和 499 bp， 并验证了该多重 PCR 具有特异性。 沙门氏菌、 空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌 O157： H7 标准菌株稀 释成不同梯度， 做灵敏度检测。 试验结果表明该方法有很好的特异性， 且灵敏度高， 检测限可达到： 沙门氏菌 1.5 CFU/ ml、 空肠弯曲菌 15 CFU/ ml、 肠出血性大肠杆菌 O157： H7 15 CFU/ ml。 在随机采集的 226 份冷冻鸡肉类样品中， 检出了 7 份 样品为沙门氏菌阳性、 10 份为空肠弯曲菌阳性、 1 份为肠出血性大肠杆菌 O157： H7 阳性。研究建立的多重 PCR -DHPLC 方法可特异、 灵敏地实现对沙门氏菌、 空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌 O157： H7 的快速检测。 关键词： 沙门氏菌 空肠弯曲菌 肠出血性大肠杆菌 O157： H7 变性高效液相色谱
表1
1
材料和方法
标 准 菌 株 及 标 准 菌 株 基 因 组 DNA 分
1.1 材 料 1.1.1 菌 种
别 购 自 美 国 ATCC 标 准 生 物 品 收 藏 中 心 和 中 国 医 学 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 中 心 （ CMCC ） （ 表 1 ）。 弯 曲 菌 属 的 菌 株 在 弯 曲 菌 选 择 性 培 养 基 上 于 42 ℃ 微 需 氧 环 境 下 培 养 （ 5% O2 、 10% CO2 和 85% N2 ） 24 h ； 其 他 的 菌 株 在 胰 蛋 白 大 豆 琼 脂 （ TSA ） 上 于 37 ℃ 培 养
（Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of China ， Dalian 116015 ） Abstract： A new molecular technique for the analysis of Salmonella， Campylobacter jejuni and enterohemorrhagic E.coli based on the separation of PCR -amplified target fragments by denaturing high -performance liquid chromatography （DHPLC） was reported. A multiplex PCR （mPCR） assay was developed by using 3 sets of primers that specifically amplify segments of the fimY， gyrA and rfbE genes， the PCR Products of which were 284， 159 and 499 bp， respectively. Analysis of 22 strains demonstrated that this PCR system was specific. The detection limit of the mPCR was 1.5 CFU/ ml for Salmonella， 15 CFU/ ml for Campylobacter jejuni and 15 CFU/ ml for enterohemorrhagic E.coli 0157:H7. 10 H7 were detected in 226 chicken meat samples. These results indicated that the of Campylobacter jejuni and 1 of O157： multiplex PCR -DHPLC assay can be used for specific and sensitive detection of salmonella， Campylobacter jejun and H7. enterohemorrhagic E.coli O157： Key words： Salmonella liquid chromatography Campylobacter jejun Enterohemorrhagic E.coli O157： H7 Denaturing high-performance
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生物技术通报 Biotechnology
Bulletin
2009 年第 3 期
尔 可 导 致 幼 儿 和 老 年 人 死 亡 [1] 。 肠 出 血 性 大 肠 杆 菌
在 但 不 可 培 养 ” 的 状 态 [4] ， 这 更 是 传 统 分 离 培 养 检 测 方 法 无 法 克 服 的 难 题 。 因 此 ，在 检 验 检 疫 工 作 中 ， 急需一种灵敏的快速检测方法。 本研究的目的是建立一种简单准确且快速灵 敏 的 多 重 PCR 反 应 ， 结 合 变 性 高 效 液 相 色 谱 技 术 （ DHPLC ） 方 法 ， 鉴 定 沙 门 氏 菌 、 空 肠 弯 曲 菌 和 肠 出 血 性 大 肠 杆 菌 O157 ： H7 ， 克 服 上 述 的 难 题 。 DHPLC 利用样 品分子对固定 相 亲 和 力 的 差 异 ，在 用 流 动 相 洗 脱 时 ，不 同 大 小 或 者 不 同 序 列 的 核 苷 酸 片 段 分 子 在 固 定 相 上 移 动 速 率 不 同 ， 从 而 达 到 分 离 的 目 的 [5] 。 根 据各种食源性致病 微 生 物 的 特 有 基 因 组 序 列 ，设 计 引 物 进 行 PCR 扩 增 ， 利 用 DHPLC 检 测 ， 达 到 快 速检测食品中病原微生物的目的。
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Campylobacter jejuni Campylobacter jejuni genomic DNA Campylobacter coli Campylobacter coli genomic DNA Campylobacter fetus Campylobacter lari genomic DNA Escherichia coli Enteropathogenic E.coli Enterotoxigenic E.coli Enterohemorrhagic E.coli Enteroinvasive E.coli Salmonella enteritidis Salmonella. typhimurium Salmonella. cholerae Salmonella. enterica paratyphi A Proteus vulgaris Yersinia enterocolitica Vibrio parahaemolyticus Vibrio cholerae Listeria innocua Liateria monocytogenes Staphylococcus aureus
O157 ： H7 感 染 的 初 期 症 状 非 常 类 似 ， 对 这 3 种 致 病
菌 的区分造成了一定 的 困 难 。 对 沙 门 氏 菌 、空 肠 弯 曲 菌 和 肠 出 血 性 大 肠 杆 菌 O157 ： H7 的 检 测 ， 传 统 的培养方法包括增 菌、生理生化鉴定、血 清 学 鉴 定 等操作，但是 所需检验时间长；而 且病原菌 在 食 品 样品 中存在的数量相对 较 少 ，使 用 常 规 选 择 性 平 板 上挑取可疑菌落的方法也可能会造成阳性菌株的 漏检。 空肠弯曲菌 生 长 条 件 要 求 苛 刻 ，需 要 在 微 需 氧 环 境 下 培 养 （ 5% O2 、 10% CO2 和 85% N2 ）， 并 且 在一些特定条 件下，空肠弯曲菌还 存在着一 种 “存
沙门氏菌、 空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌
占 食 物 中 毒 总 数 的 50 ％ 左 右 ， 其 中 沙 门 氏 菌 食 物 中 毒 居 首 位 ，且 多 发 生 在 食 用 畜 禽 肉 、禽 蛋 类 。 沙 门 氏 菌主要通常导 致 健 康 成 人 的 自 身 限 制 性 肠 胃 炎 ，偶
O157 ： H7 是 引 起 细 菌 性 食 物 中 毒 的 常 见 致 病 菌 。 我