变性高效液相色谱在分子生物学中的应用

变性高效液相色谱在分子生物学中的应用

白 桦综述 邓大君 潘凯枫审阅

北京市肿瘤防治研究所病因室(北京,100034)

摘要

变性高效液相色谱法(DHPL C)是在高效液相色谱法的基础上发展起来的一种新方法。它因使用的温

度不同而有不同的应用价值:在非变性温度下进行双链DN A 分离,在部分变性温度下进行基因突变、单核苷酸多态性和甲基化测定,在完全变性温度下对寡核苷酸进行质控和纯化等。由于该技术具有快速、经济、准确和自动化程度高等特点,目前已经成为分子生物学常用技术之一。

关键词 变性高效液相色谱法;突变;单核苷酸多态性;甲基化;基因型

DNA 序列变异分析是遗传学研究的基础。随着人类基因组计划的完成,迫切需要一种敏感、高效、经济的方法来检测庞大的序列变异。大规模检测SNP 和突变的技术要求经济、自动化,高通量,无需修饰引物,无需纯化样品等。在目前分析点突变的诸多方法中,变性高效液相色谱法是少数能同时满足上述条件的技术之一。它可以自动检测单碱基置换,小片段插入和缺失。DHPLC 利用杂合双链和纯合双链部分变性温度的不同来检测这些变异。

1 DHPLC 的基本工作原理

DNA 分子带负电荷,而分离用色谱柱的固相呈电中性疏水性,因此DNA 分子本身不能直接吸附到柱子上。一种充当-桥梁.作用的分子)))离子对试剂TEAA(三乙铵醋酸盐),可以帮助DNA 分子与柱子固相填料表面分子结合,使TEAA 的阳性铵离子与DNA 相互作用,同时烷基链与柱子的疏水表面相互作用。这样DNA 分子越长,结合的TEAA 越多,与固相结合得越牢固。羟基链与固相结合的强度会随着流动相中乙睛浓度的增加而减弱,DNA 片段越长,结合的TEAA 越多,越不易被洗脱。因此DNA 片段大小分析是长度依赖性分离,而非序列依赖性分离。变性温度是影响DNA 片段分析的一个重要因素,变性温度升高保留时间缩短,在适宜的温度下可使DNA 双螺旋呈舒展状态,最大限度的暴露出用于离子对形成的磷酸根基团,使DNA 分子与分离柱产生很强的相互作用,因此40e ~50e 最适合做DNA 片段大小分析,随着温度的升高,分离效率迅速下降,较高的温度常用于进行突变分析。

如果一个二倍体细胞的单拷贝DNA 序列中的

碱基存在多态性,或其中一个等位基因(点)存在胚

系突变,则其杂合或突变位点上2种碱基的出现频率均等;如果组织中的部分细胞发生了均一的体细胞点突变(如肿瘤细胞),则组织中突变位点上2种碱基的出现比例不均等。在经历95e 变性再缓慢

复性后,这种存在多态或突变位点的靶序列PCR 产物会杂交形成杂合双链(heteroduplex )和纯合双链(homoduplex )混合物(图1)。

图2 N 端晶体结构

通常一个杂合个体中突变型G/C(或多态性)与野生型A /T 的比例是1B 1。分别进行P CR 扩增后,将两种产物混合并加热至95e 再缓慢降温,形成2种杂合双链(A/C 和G/T )和2种纯合双链(A /T 和G/C)

如果PCR 产物源自纯合子或者发生了纯合突变的个体,那么只有在与另外一种纯合野生型序列的PCR 产物混合,再变性复性,才能够形成上述杂合和纯合双链。杂合双链存在错配碱基,其变性温度低于纯合双链,当温度升高到一定程度,先于纯合双链在错配碱基周围解链变性,导致双链减少和单链增多。由于单链比双链所带的负电荷少,杂合双链比纯合双链更容易形成单链,其保留时间短于纯合双链,在图谱上先于未解链的纯合双链出现。随着变性温度升高,纯合双链也会部分变性,A=T 含有2个氢键,C S G 含有3个氢键,前者变性程度比后者低,因此先出现的峰为含有AT 的双链,后出现的为含CG 的双链。利用这种杂合和纯合双链在保

留时间上的差异,可以快速分析单个核苷酸的突变和多态性。

当温度升高到70e以上,双链呈完全变性状态,形成4种单链。寡核苷酸的分离是长度和序列依赖性的,在链长度相同时,依靠碱基组成不同引起的保留时间的差异达到分离寡核苷酸的目的。T带有甲基基团,保留时间最长,G含有一个羰基和一个氨基,比只含有一个氨基的A保留时间短,C疏水性最弱,保留时间最短,因此保留顺序为C

2DHPLC的实际应用

¹在非变性温度(40e~50e)条件下对不同长度的双链DNA进行分离,用于定量反相PCR、长度多态性分析以及杂合性缺失(LOH)分析等;º在部分变性温度(51e~75e)条件下进行基因突变,单核苷酸多态性和CpG甲基化的检测;»在完全变性温度(70e~80e)条件下对寡核苷酸进行质量控制和纯化,RNA分离及已知位点基因型的分析等。这种利用双链分子变性温度的差异,对DNA进行分离的高效液相色谱分离技术称为变性高效液相色谱法(DHPLC)。

211微卫星分析

Devaney等在非变性温度下分析了人类酪氨酸基因第一内含子HUM TH01区微卫星序列,得到了8类等位基因的精确长度,这些等位基因含有不同数量的重复序列,具个体特异性,将这些片段作为对照,利用在保留时间上的微小差异来鉴别受检个体的特征。在司法案件中常利用该区域做身份鉴定[1]。

212Q-RT-PC R

将精确定量的竞争子与未知质量的mRNA共同扩增后,在非变性温度下将这两种不同长度的RNA分离开来,在WAVEMAKER TM4.0软件支持下得出待测RNA的原始拷贝数[2]。

213DNA片段长度分析

DHPLC能利用不同长度双链在保留时间上的微小差异精确地将它们分离开来。性别分析是司法鉴定的一部分,利用性别特异性片段的长度差异可进行性别鉴定。人类X-Y同源基因amelogenin是用于做性别鉴定的基因。X-特异性产物长为212 bp,Y-特异性产物长为218bp,即使只有4个碱基的差异,WAVE系统在非变性温度下仍能精确的将两者分开,而且通过整合峰区域还可知晓原始基因的拷贝数[3]。

214单核苷酸多态性和突变分析

近几年,应用DH PLC成功检测突变的报道逐渐增多,显示了该方法卓越的特异性和敏感性。O. Donovant等[4]用该方法检测凝血因子Ù(F9)的外显子H和NF1基因(neurofibromamatosis ty pe1)外显子16的变异情况,发现敏感性和特异性都达到100%,而单链构象多态性分析(SSCP)仅检测到F9基因50%的突变率。Liu等[5]检测Marfan综合征病人FBN1基因,不仅发现了所有SSCP检测到的突变,而且还观察到17个新的突变类型,SSCP的检测率仅达到DH PLC的69%。Dobson等[6]发现DH-PLC和F-SSCP(capillary electrophoresis-based fluo-rescent single-strand conformation polymorphism analysis)在突变检测率上基本相同,敏感性达到93%~100%,特异性为100%。然而SSCP要求片段长度在164~270bp,而且需要荧光素标记,纯化,浓缩产物,增加了分析成本,而且该方法的敏感性易受片段大小和序列的影响,当片段大于300bp或突变位于发卡结构中时,会导致敏感性大大降低;而DHPLC允许的片段长度在150~700bp,基本不会影响敏感性。Skopek等[7]检测人类HPRT基因ex-on8,20个点突变散布在279bp长的片段内,其检测率达到100%,每个区域的熔解温度在65e~69e 之间,而变性梯度凝胶电泳在如此高的熔解温度下无法进行变异分析。Van den Bosch等[8]检测肿瘤病人线粒体DNA(mtDNA)突变情况,发现A8344G 突变率在0.5%时仍有信号。

长期以来,测序被认为是检测基因变异的金标准。然而,Jones等[9]证实当DHPLC能再现杂合峰而直接测序结果为阴性时,不应过早地认为是假阳性结果,而应将目的片段克隆到足够数量再进行测序。DH PLC检测突变的能力通常取决于纯合双链和杂合双链的变性温度以及PCR产物的纯度。当突变率达20%时,DHPLC检测率为100%,而直接测序的检出率仅达80%。因此,对于镶嵌性基因或异质性基因来说,DH PLC仍不失为一个首选方法。215甲基化分析

邓大君等[10~12]创建了DH PLC法检测CpG岛甲基化的新方法:由于亚硫酸氢钠基本不会修饰5-甲基胞嘧啶(5mC),与未甲基化的CpG岛模板相比,甲基化CpG岛模板中保留了数目众多的未修饰5mC,变性温度明显高于前者(2e~3e),在DH-PLC中保留时间显著延长。所以在DH PLC中2者能被轻易区分。因为该方法使用与测序法和CO-