2011年生物分离工程考查试卷

2011年生物分离工程考查试卷1.茨维特色谱技术的缘起以及为何该技术被埋没了一段时间？答：色谱法的发现与茨维特在俄国科学院进行的硕士论文研究密切相关。

在研究中,他观察到,石油醚极易溶解离析态的叶绿素和相关色素,但不能从植物叶中直接提取出这些色素,而乙醇(甚至在其它溶剂中加入少量乙醇) 则很容易直接提取出植物叶中的色素。

他认为,这种现象并不是由于叶绿素“不溶于”石油醚而“溶”于乙醇,也不是由于叶绿素在乙醇提取过程中发生了化学变化而溶解“很可能是由于植物组织的分子力的干扰,即是说是由于吸附.石油醚对色素的溶解力小于植物组织的吸附力,而这种吸附力能被某些其它溶剂如乙醇所克服。

因此,即使在石油醚中加入少量无水乙醇也能将所有的色素提取出”.从他的实验中可以了解它的发现过程将植物叶的石油醚提取液倒入CaCO3柱中，提取液中的色素被吸附在柱的顶端；然后不间断地注入纯净石油醚冲洗，可观察到柱管上各种色素逐渐分离形成不同颜色的色带继续不间断冲洗，各种色素就分先后随石油醚从柱的下端流出，如果分别收集各个色带的洗脱液，就达到了分离各种色素的目的。

茨维特把这种分离方法称为色谱法，填充CaCO的玻璃柱管称为色谱柱，分离过程色谱柱中出现的各种颜色的色带称为色谱图色谱柱中装填的固定不动的物质(CaCO3)称为固定相，用于携带被分离组分(色素)流过固定相的流体(石油醚)称为流动由此可知：色谱分析法实质是一种分离技术，将组分完全分离后，结合其它的分析手段的检测，就可以进行组分的定性和定量分析。

现代的色谱分析已经失去了颜色的意义，不管组分是否有颜色，都可以应用色谱法进行分离，但色谱及其相关的词语却一直沿用至今。

茨维特应用化学方法研究细胞生理学。

1900年他在树叶中发现了两种类型的叶绿素：叶绿素a和叶绿素b，后来又发现了叶绿素c,并分离出纯的叶绿素。

他最重大的贡献是发明分析化学和有机化学。

中极重要的实验方法──色谱法。

他的第一篇关于色谱法的论文发表在1903年华沙的《生物学杂志》上。

1906～1910年的论文都发表在德国的《植物学杂志》上。

在这几篇论文中，他详细地叙述了利用自己设计的色谱分析仪器，分离出胡萝卜素、叶绿素和叶黄素。

由于他的论文发表在不大知名的期刊上，所以当时没有引起化学界的注意。

直到1931年，R.库恩才发现茨维特所发明色谱法的重要性，此法才得到普遍的推广和应用。

他的新分离方法并没有受到科学界的重视.其中一个重要原因是德国著名化学家威尔斯泰特对色谱法的排斥和不信任。

威尔斯泰特是植物色素尤其叶绿素化学领域的权威,1915年就是因为“在叶绿素化学领域的卓越贡献”获诺贝尔化学奖。

他的态度对人们接受和使用色谱法具有举足轻重的作用。

而茨维特本人是植物学家而非有机化学家,对于当时的欧洲化学界来说,他显然是个局外人。

1913年,威尔斯泰特在其名著“叶绿素的研究”称色谱法是一种“离奇的方法”并对色谱法持拒绝的态度 ,认为它不适用于制备工作 ,在吸附过程中试样组分可能发生化学变化。

他写道“色谱法只能在试样很少的情况下使用 ,似乎不适用于制备目的。

在叶绿素组分的分离过程中尚不知如何避免叶绿素的变异。

在随后发表的一篇论文中,仍持相同的观点。

他写道“茨维特认为我们分离的叶绿素是 2 至3 种叶黄素的同晶型混合物。

这位尊敬的植物学家的假设 ,同他的许多观察一样不可能是正确的。

很可能叶黄素在茨维特的色谱分析过程中由于氧化作用的结果 ,发生了化学变化。

因为在吸附的情况下极易发生氧化作用。

这是由于威尔斯泰特和他的助手在实验中使用了不合适的吸附剂所致.茨维特也曾观察到 ,叶绿素在某些吸附剂上可能分解,于是建议使用菊粉或蔗粉作吸附剂。

遗憾的是,茨维特的忠告没有引起威尔斯泰特的注意。

在酶的研究中,威尔斯泰特的实验室也使用过色谱法.他的观点开始转变。

在1928年出版的专著中,他写道“尽管茨维特的方法不适合于制备工作,但他通过吸附将叶色素的混合物分离成各组分虽然只是在分析规模上。

茨维特用色谱吸附法研究叶绿素及其衍生物,获得了重要成果.但这种方法不适合于更大规模的工作,即制备目的。

他仍然强调色谱法不适用于制备目的,但似乎承认在小规模的分析方面,这种技术是重要的.威尔斯泰特的观点,即过分强调制备工作,也反映出当时的有机化学家的一种普遍态度。

19世纪后期到第一次世界大战前,有机化学家的主要兴趣是合成与分离提纯。

他们用萃取和结晶的方法.从千克级的产物中分离一两种重要化合物,没有兴趣分离产物中的所有组分,也勿需以非常少的试样进行研究。

因此,茨维特的技术是超越其时代的 ,只有在化学家认识到在少量试样的情况下进行全分离的重要性后,色谱法才会被人们真正接受.如色谱学家施瓦伯在 1937 年指出的那样“在天才的俄国植物学家茨维特创立这种方法并成功地用于植物色素的提取.1930 年12月,在Kuhn 的指导下,他用碳酸钙作吸附剂,在一小色柱中 ,成功地制备出叶黄素和玉米.1938 年,Ruzicka 在 1939 年相继获诺贝尔化学奖。

从此以后,色谱法得到普遍的公认,成为最有效献中被埋没了25 年之久。

当然 ,茨维特的方法并没有被完全遗忘 ,仍有少数植物学家和生物化学家用来研究叶色素。

瑞士的 Fribourg 大学的C.DhΥΥ( 1876～1955) 1911年开始使用色谱技术,发表了“叶绿素的紫外吸收光谱和荧光发射光谱”无脊椎动物中色素的研究”等论文.美国科学家 L.S.Palmer (1887～1944)随后,又做了一个长 7cm 的更大的色谱柱,对 100 个鸡蛋制备的“叶黄素”溶液进行分析, 结果证明 Kuhn 的假设是正确的。

1931年, Kuhn和Lederer 在德国《自然科学》,《德国植物学报》,《生理化学学报》发表了三篇论文 ,公布了他们的研究成果。

这标志着色谱法的复兴。

随即 ,瑞士的P.Karrer 和L.S.Zechmeister等科学家迅速掌握了这项“新”技术,在天然有机化合物的研究中取得了极为丰硕的成果,并推动了色谱技术的进一步发展。

2.举例说明某一种色谱层析分离法的应用，并详细阐述分离过程。

答：氨基酸的纸色谱法纸色谱法是属于分配色谱的一种，通常用特制的滤纸如新华一号滤纸作为固定相（水的支持剂），含有一定比例的水的有机溶剂（展开相）作流动相，应用于多官能团或高极性化合物如糖或氨基酸的分离、鉴定。

Rf比移值是一个特定常数。

Rf值随被分离化合物的结构、固定相与流动相的性质、温度等因素不同而异。

当温度、滤纸等实验条件固定时，它是一个常数。

这也就是用纸色谱进行定性分析的依据。

一个计划周到的分离、鉴定微量氨基酸的纸色谱的操作训练，对学生了解纸色谱的原理方法和应用是很必要的。

我们用标准氨基酸作出纸色谱和Rf值，与在相同条件下作出的混合物的纸色谱和Rf相对照，以达到分离、鉴定氨基酸的目的。

当然，在实际应用中，纸上层析的操作要复杂得多。

尤其是Rf值相接近的氨基酸需要用两向纸上层析才能达到分离鉴定的目的。

我们配制的“未知”混合物试样是有意选择Rf值相差较大的样品。

所以用单向纸上层析就能达到分离鉴定的目的。

氨基酸经纸上层析后，常用茚三酮显色剂显色。

必须注意！指印含有一定量的氨基酸，在本实验方法中足以检出（本法可以检出以微克计的痕迹量）。

因此，不能用手直接触摸分析用的滤纸，要用镊子钳夹滤纸边。

一、原理纸色谱主要用于分离和鉴定有机物中多官能团或高极性化合物如糖、氨基酸等的分离。

它属于分配色谱的一种。

它的分离作用不是靠滤纸的吸附作用，而是以滤纸作为惰性载体，以吸附在滤纸上的水或有机溶剂作为固定相（干燥滤纸本身有6~7%的水，另外将它置于饱和的湿气当中，还可吸收20~30%的水），流动相是被水饱和过的有机溶剂或水（展开剂）。

利用样品中各组分在两相中分配系数的不同达到分离的目的。

纸色谱的优点是操作简单，价格便宜，所得到的色谱图可以长期保存。

缺点是展开时间较长，因为在展开过程中，溶剂的上升速度随着高度的增加而减慢。

纸色谱法是以纸为载体的色谱法，分离原理属于分配色谱的范畴。

纸色谱过程可以看成是溶质在固定相和流动相之间连续萃取的过程。

依据溶剂在两相间分配系数的不同而达到分离的目的。

与薄层色谱相同，纸色谱也常用比移值Rf来表示各组分在色谱中位置。

根据液液分配色谱的原理，氨基酸样品各组分在固定的水相中移动的溶剂相之间反复进行分配，从而把各组分分开。

氨基酸是无色化合物，可与茚三铜反应产生颜色，因此，溶剂自滤纸挥发后，喷上茚三铜溶液后加热，可形成色斑而确定其位置。

二、操作步骤及流程1.纸的准备（1）滤纸中应不含有水或有机溶剂能溶解的杂质。

（2）滤纸被溶剂浸润时，不应有机械折痕和损伤。

即应具有一定的强度。

（3）滤纸对溶剂的渗透速度应适当，渗透速度太快时易引起斑点拖尾，影响分离效果，速度太慢时，耗费时间太长。

（4）纸质应均一，否则会影响实验结果的重复性，特别是定量实验中这点更是重要。

2.点样取一条8×15cm滤纸，在滤纸层析纸按需要剪裁成长条形（或筒型）短边1cm处用铅笔轻轻画上一条线，在线上轻轻打上四个点（等距并编号）。

用毛细管蘸试样在铅笔线的点上打三个标准氨基酸试样斑点（每打一个试样，换一根毛细管，以免弄脏样品）。

再用毛细管打上一个混合物的斑点。

斑点的直径约为1.5mm，不宜过大。

将试样号码计于实验记录本上；并把滤纸放在空气中晾干。

取一标本缸，加入20ml乙醇-水-醋酸展开剂，盖上玻璃片使标本缸内形成此溶液的饱和蒸汽。

将滤纸小心放入上述标本缸中，不要碰及缸壁。

当展开剂的前沿位置达到滤纸上端约一公分处，小心取出滤纸，用铅笔作下展开剂前沿位置的记号。

记下展开剂吸附上升所需的时间、温度和高度。

将此滤纸于105℃烘箱中烘干。

3显色及定位洗相的方式将滤纸在茚三酮溶液中浸泡一下或用喷雾方式将茚三酮溶液均匀地喷在滤纸上，并放回烘箱中于105℃烘干。

此时，由于氨基酸与茚三酮溶液作用而使斑点呈色。

用铅笔划出斑点的轮廓以供保存。

量出每个斑点中心到原点的距离，计算每个氨基酸的Rf值。

5洗脱（1）洗脱测定法操作步骤多，测定时间长，但洗脱法不需要贵重仪器设备、测定结果有较好的准确度。

（2）直接测定法a 目测法样品经分离后，直接观察所得斑点的大小和颜色的深浅，并与标准品在相同条件下展开所得到的一系列已知不同浓度的标准斑点相比较，而近似地判断样品中所测成分的含量。

（误差较大）b 测面积法展开后色谱上的斑点面积与化合物含量间存在一定关系，所以可以用测定斑点面积的方法来测定样品含量。

c仪器测定法纸色谱中纸为半透明物体，故可以用类似于分光光度计结构的光密度计（densitometer ）扫描滤纸，测定透光强度的变化而定量。