microRNA作为脓毒症早期诊断生物标志物的研究进展

microRNA作为脓毒症早期诊断生物标志物的研究进展李韶威;刘靖华
【摘要】microRNA (miRNA)是一类长度约为22 nt的内源性非编码RNA,其表达异常可能导致炎性反应失衡.在脓毒症期间,miR-146a、miR-223和miR-150表达水平降低,而miR-15a和miR-16表达增高.脓毒症患者外周血中miRNA表达水平的异常与患者病情密切相关,因此,miRNA能否作为脓毒症早期诊断的生物标志物备受关注,并已初步取得可喜成果.
【期刊名称】《基础医学与临床》
【年(卷),期】2016(036)011
【总页数】5页(P1591-1595)
【关键词】microRNA;脓毒症;生物标志物
【作者】李韶威;刘靖华
【作者单位】南方医科大学病理生理学教研室广东省蛋白质组学重点实验室,广东广州510515;南方医科大学病理生理学教研室广东省蛋白质组学重点实验室,广东广州510515
【正文语种】中文
【中图分类】R631
脓毒症是由病原微生物感染引起的全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，主要病理生理机制包括机体失控的炎性反应、凝血抗凝血和免疫功能障碍，涉及细胞内多条信号传导通路的活化和分子机制[1]。

脓
毒症的特征之一就是促炎因子，如白介素6(interleukin- 6，IL- 6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的大量产生与随之引起的组织损伤[2]。

一旦病情进行性加重，常可导致患者多器官功能障碍(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)甚至死亡。

为了能早期诊断脓毒症，人们已进行了大量生物标志物的相关研究，例如目前临床中最常用的脓毒症诊断标志物C反应蛋白(C reactive protein，CRP)、降钙素原(procalcitonin，PCT)和IL- 6等。

由于这些标志物缺乏高敏感性和高特异性，因此迫切需要研制新的生物标志物用于临床。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长约22 nt的内源性非编码RNA。

有报道称miRNA对炎性反应过程的各个环节都有重要调控作用，miRNA异常可能导致炎性反应的失衡[3]。

因此miRNA作为早期诊断的生物标志物备受关注。

本文综述近年来miRNA作为脓毒症诊断的生物标志物的研究成果。

miRNA的产生是一个多阶段的过程。

首先，miRNA基因在细胞核中经RNA聚合酶Ⅱ转录出初始miRNA(pri-miRNA)，pri-miRNA在核酸内切酶Drosha的作用下，剪切成为一个约70 nt的具有茎环结构的前体miRNA(pre-miRNA)。

pre-miRNA在转运蛋白Exportin- 5/RanGTP的协助下转运至细胞质，在Dicer酶的作用下，剪切为约22 nt的miRNA，释放后随即被具有PAZ结构域的AGO蛋白识别，其中一条链(引导链)能与靶mRNA互补形成miRNA诱导沉默复合物(miRNA-induced silencing complex，miRISC)，而剩下的一条链(随从链)被释放并降解。

miRNA对基因表达的调节过程主要有两种模式。

一种是miRNA与靶mRNA精确或者近乎精确互补配对，通过RNA干扰机制直接破坏并降解靶mRNA。

另一种情况是miRNA无法与靶mRNA精确配对，但会在mRNA翻译过程中发挥抑制作用。

在动物体内，miRNA的种子序列与靶mRNA的3′非编码区域
(untranslated regions，UTRs)结合，抑制其翻译或直接降解mRNA，在转录后
或翻译水平调节蛋白的表达，影响细胞增殖、分化和凋亡等多个阶段[4]。

炎性反应是生物体的一种防御机制，能有效减少病原体、受损细胞、毒素及致敏原等有害刺激对机体的损伤，利于组织愈合。

炎性反应的激活涉及机体感受刺激、炎性介质释放和靶组织反应等环节。

细胞的感受器如Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)检测到病原体、致敏原和损伤组织等诱导物后，产生炎性介质如
IL- 1β、TNF-α、IL- 6和趋化因子CCL2、CXCL8，诱发炎性反应。

感受器激活的下游核心信号传导通路包括NF-κB通路和Janus激酶信号传导子和转录激活子(Janus kinase-signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT)通路。

组织损伤时NOD样受体(NOD-like receptors，NLRs)激活炎性小体和半
胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase- 1)通路，慢性炎性反应期间则发生抗原特异性
T细胞反应[5]。

miRNA广泛存在于真核生物中，仅人类基因组编码的就超过1 000种。

有多种miRNA参与了炎性反应过程的多个调节环节，例如miR- 146a能抑制NF-κB通
路的激活，通过下调白介素1受体相关激酶1(interleukin- 1 receptor associated kinase 1，IRAK1)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)的活性调节TLR2/4和T细胞受体(T cell receptor，TCR)信号通路；而在调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)，miR- 146a可抑
制STAT1和 IFN-γ的生成，提示miR- 146a在炎性过程中起负性调控作用[6]。

miRNA参与抗炎机制的同时，也参与了促炎过程。

如miR- 181a下调双特异性
磷酸酶6(dual-specific phosphatase 6，DUSP6)表达，并激活能增强TCR敏感
性的细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)通路，促进机体免疫应答[7]。

在抗原提呈细胞，miR- 155靶向细胞因子信号传导抑制蛋白1(suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1)激活JAK-STAT通路的同时促进
Ⅰ型干扰素的产生，进而加速炎性的发展[8]。

上述过程说明miRNA广泛参与了炎性反应的多条信号通路，在促炎和抗炎过程中均发挥重要作用[3](图1)。

miRNA参与了炎性反应的诸多环节，其表达异常与脓毒症发生发展过程中免疫功能紊乱密切相关，提示miRNA作为脓毒症临床诊断生物标志物的潜在可能。

3.1 miR- 146a
miRNA- 146a是第一个被发现可调节NF-κB通路的相关miRNA。

相比于正常细胞，转染了miR- 146a抑制剂的单核细胞对LPS刺激的反应性明显提高，而IRAK1和TRAF6的表达却有所增加，提示miR- 146a可抑制细胞内TRAF- 6和IRAK- 1表达，从而抑制炎性因子TNF-α的产生，因此miR- 146a的正常表达可防止组织发生过度炎性反应[9]。

进一步研究发现miR- 146a能与 IRAK1和TRAF6的3′UTR区域互补结合，在转录水平抑制TRAF- 6和IRAK- 1的表达从而抑制NF-κB靶基因如IL- 6、IL- 8、IL- 1β和TNF-α的表达[10]。

脓毒症患者外周血中miR- 146a的水平明显低于健康对照组[11]。

由于miR- 146a对炎性反应具有负性调控作用，所以miR- 146a表达下调可能减弱了细胞与机体对炎性反应的控制，间接促进了炎性反应的失控。

3.2 miR- 223
Nod样受体蛋白炎性体3 (Nod-like receptor protein 3，NLRP3)是位于细胞质内的一种蛋白质复合体，主要功能为活化caspase- 1以间接调控IL- 1β、IL- 18和IL- 33等细胞因子的成熟和分泌。

在中性粒细胞中，miR- 223是NLRP3炎性小体的重要调节分子。

miR- 223能结合在NLRP3 mRNA的3′UTR保守区域，下调NLRP3的表达，抑制caspase- 1和IL1-β介导的炎性反应[12]。

STAT3可能是miR- 223作用的另一个靶点，LPS刺激细胞时miR- 223的下调，解除了对STAT3的抑制，促进IL- 6和IL- 1β的产生[13]。

另外，IκB激酶α(inhibitor kappa B kinase α, IKKα)是miR- 223、miR- 15a和miR- 16共同的作用靶点，
巨噬细胞分化期间这3种miRNA的下调解除了对IKKα的抑制，间接增强了NF-κB信号通路，使IL- 12和IL- 6等炎性因子产生增多，最终加速炎性反应的进展[14]。

小鼠盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture，CLP)是实验室常用的诱导脓
毒症的方法。

有研究发现，利用该脓毒症模型心脏组织中的19种miRNA中，只有miR- 223(3p)和miR- 223*(5p)的下调具有显著性。

而miR- 223/miR- 223*
的下调或者缺失能够加剧脓毒症诱导的炎性反应、心肌功能障碍以及动物的死亡率增加[15]。

然而，另一项研究报道CLP诱导的小鼠脓毒症模型中miR- 223血清水平并无显著改变，认为miR- 223不能作为患者是否患有脓毒症的鉴别依据[16]。

上述两项研究的结果不同，可能与检测miR- 223浓度的标准化试剂及选择的内参基因不同[分别为猿猴病毒40(SV40)以及核内小RNA U6(snU6)]和研究队列人群
的异质性和实验条件的差异等有关。

3.3 miR- 15a、miR- 16
细菌感染和/或细菌源性LPS刺激骨髓诱导分化的巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages，BMDMs)能增强miR- 15a/16的表达。

过度表达的
miR- 15a/16靶向位于TLR4启动子区域的PU.1[spleen focus forming
virus(SFFV) proviral integration oncogene，spi- 1或PU.1]抑制TLR4的表达
并调节位于TLR4通路下游的Rho GTP酶42和TRAF6活性；而miR- 15a/16
的缺失会促进TLR4介导的促炎细胞因子和趋化因子在炎性早期从BMDM的释放，适度释放的促炎因子会促进中性粒细胞的募集和细菌的清除，最终提高了脓毒症小鼠的存活率[17]。

有报道称脓毒症组和SIRS组患者血清中的miR- 15a和miR- 16显著高于健康组，据此提出miR- 15a和miR- 16可以作为诊断脓毒症/SIRS的工具；而与CRP、
降钙素原比较，miR- 15a具有更高的敏感性与显著性，因此miR- 15a可能成为
鉴别脓毒症和SIRS的生物学标志物[18]。

新生儿脓毒症组miR- 15a/16表达高于对照组，并证实LPS刺激转染miR-
15a/16的细胞后TLR4和IRAK1转录水平有所降低，推测脓毒症患者表达上调的miR- 15a/16能下调LPS诱导的炎性反应，因此可能成为新生儿脓毒症的诊断和
预后判断标志物[19]。

3.4 miRNA- 150
有研究比较了32名健康人和17例脓毒症患者miRNA表达谱，发现脓毒症患者
外周血白细胞中miR- 150水平下降最为显著。

脓毒症患者miR- 150的表达水平与疾病严重程度紧密相关，其严重程度可根据脓毒症相关脏器衰竭(sepsis-related organ failure assessment，SOFA)评分所判断。

进一步研究观察到脓毒症患者miR- 150的下降与促炎因子IL- 18的增加有关[20]。

近来有报道健康组与脓毒症患者组之间血清miR- 150浓度并无显著差异，提示将其作为脓毒症的生物标志物还为时过早[21]。

但是，miR- 150浓度的降低常伴随
脓毒症患者的预后不良与高病死率，提示miR- 150可作为一个脓毒症预后参考指标而非诊断指标。

3.5 其他影响炎性通路的miRNA
有研究比较了健康者与脓毒症患者、存活患者与死亡患者、脓毒症患者与合并ARDS脓毒症患者血清中4种miRNA(miR- 122、miR- 193b*、miR- 483- 5p
和miR- 574- 5p)的表达水平，结果只有miR- 122的循环阈值始终存在显著差异，提示miR- 122可以作为同时患有sepsis和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)患者的生物标志物[22]。

骨髓衍生抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是一群由骨髓干细胞衍生而来的未分化为成熟固有免疫细胞的前体细胞。

盲肠结扎穿孔术(CLP)诱
导小鼠脓毒症晚期骨髓中MDSCs显著增殖，表明其与脓毒症晚期免疫抑制密切相
关。

进一步研究发现，MDSCs的大量增殖与miR- 21和miR- 181b有关。

miR- 21和miR- 181b在脓毒症早期表达上调，并且在晚期能维持较高水平；用AntagomiR同时阻断两种miRNA的作用可减少骨髓Gr1+CD11b+前体细胞，促进细菌的清除并降低74%的脓毒症病死率[23]。

这些研究提示，miR- 21和miR- 181b在脓毒症的发展中发挥了重要作用。

另有报道在小鼠脓毒症模型miRNA，包括miR- 133a、miR- 150、miR- 155和miR- 193b*的表达异常中，miR- 133a的高表达预示着不良预后，因此其可能成为ICU患者以及重症患者病死率的一个敏感指标[24]。

目前，血浆中miRNA作为生物标志物在脓毒症研究方面尚处于起步阶段，还存在很多问题。

首先，最突出的问题是不同研究小组之间所得到的结果存在明显的差异甚至完全相反的结论，这可能与样品采集、数据处理和结果分析的标准化不一致有关。

尽管人们对血清miRNA分析的标准化研究了很多年，至今仍未达成共识。

有研究者建议使用内参基因如miR- 16或者snU6进行标准化，然而最近有研究揭示snU6在健康组和重症/脓毒症组患者的调节会有所不同，提示这一方案可能会对分析结果产生偏差。

所以，尽快解决miRNA检测的标准化问题，将成为miRNA作为新一代重症和脓毒症患者的生物学标志物的重点研究内容。

其次，尽管我们对miRNA参与炎性反应的环节有所了解，但是这些miRNA是否直接参与了脓毒症的发生？对相关miRNA进行干预能否逆转脓毒症的发展？对于这些问题的解析，不仅可以加深我们对脓毒症发病机制的理解，而且有助于获得更加可靠的脓毒症早期诊断生物标志物。

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