山慈菇水煎剂对胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响

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2018.01
论著·论述
山慈菇水煎剂对胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响
林晓燕　孙晓红　张璐萍
滨州医学院 山东省烟台市 264003
【摘　要】目的：研究山慈菇水煎剂对胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响。

方法：山慈菇水煎剂（200，400，600mg/mL）分别作用于胶质瘤U118细胞0h、24h、48h，分别采用CCK-8实验、划痕实验、Transwell 实验对细胞的增殖、迁移、侵袭能力进行检测。

结果：山慈菇水煎剂（200，400，600mg/mL）作用于胶质瘤U118细胞24小时和48小时均能显著降低细胞的增殖能力（P<0.05），且当山慈菇水煎剂（200，400，600mg/mL）作用于U118细胞48小时，增殖抑制率分别高达20.64%、47.61%、51.23%；划痕实验结果表明，不同浓度山慈菇水煎剂作用24小时及48小时均能明显降低胶质瘤U118细胞的迁移能力（P<0.05），且48小时药物降低细胞迁移的能力高于24小时；体外侵袭实验显示，山慈菇水煎剂（200，400，600mg/mL）培养24h 和48h 均能明显的降低侵袭细胞数目，差异具有统计学意义（P<0.05）；结论：山慈菇水煎剂能够减轻U118胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力，但对于其具体的机制还需要进一步的研究。

【关键词】山慈菇水煎剂；胶质瘤细胞；增殖；侵袭；迁移
胶质瘤是一种发病率高、致死率高的恶性脑肿瘤，5年内脑胶质瘤患者的生存率小于10%，该病多发于30岁至40岁的中年人群，其约占中年颅内肿瘤患者的1/3至2/3。

胶质瘤侵袭性高，发病机制复杂，对于该疾病还没有完全根治的治疗方法[1]。

目前，对于脑胶质瘤的治疗，临床上主要采用手术配合术后放化疗为主。

放化疗不仅对肿瘤细胞存在杀伤力，对机体内正常的细胞也有很强的杀伤力[2]，副作用强，加重患者的不良反应，严重影响患者的生存质量及生活质量[3-5]。

山慈菇是常用的抗肿瘤中药之一，有解毒消肿的功效，用于痈疽恶疮、淋巴结核和蛇虫咬伤的作用。

现代药理研究表明，山慈菇具有抗肿瘤细胞生长、抑制血管生成、抑制肿瘤细胞的侵袭与转移、抗炎等作用。

本课题采用山慈菇水煎剂作用于胶质瘤细胞，研究其对该细胞增殖、侵袭和迁移的影响，以期为脑胶质瘤靶向治疗药物的研究提供参考和依据。

1 材料与方法
1.1 药物及制备
U118胶质瘤细胞株由上海复旦大学细胞库提供，山慈菇购自北京同仁堂药店。

电子精密天平秤取100g 山慈菇药材，根据传统中药煎煮方法进行煎煮。

待液体至100mL 附近时将其转移至高压灭菌后的烧杯中，并使用无菌培养皿将盛有煎剂的烧杯盖住，浓缩煎剂至50mL 。

于超净工作台中将水煎剂加入离心管（经高压灭菌处理）中，离心5min ，转速为1000r.min -1，取上清。

取5μL 上清加入1mL 无菌DMEM 培养基中，置于37℃，5%CO 2培养箱中放置48h ，观察水煎剂是否染菌。

剩余上清密封于4℃保存备用。

48h 培养后的上清置于显微镜下观察，确认无菌后，此次制备的水煎剂上清（2kg•L -1）原液即可用于后续的
实验中。

根据实验所需要的水煎剂浓度加入培养基，在超净台中，无菌条件下，稀释至研究所需要的浓度。

1.2 仪器与试剂
CCK-8试剂、碘化丙啶（PI ）试剂、DMSO 试剂、DAPI 试剂、RNA 酶、生理盐水和无水乙醇购于Sigma 公司；胰蛋白酶购于Hyclone 公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum ，FBS ）、DMEM 高糖培养基购于美国Gibco 公司；Transwell 小室购于美国Corning 公司；Matrigel 基底膜购于美国BD 公司；多功能酶标仪购于美国Mo-lecular Devices 公司；倒置显微镜购于日本OLYMPUS 公司，CO2培养箱购于德国BINDER 公司；细胞培养箱购于美国Forma Scientific 公司。

1.3 实验方法
1.3.1 人胶质瘤细胞培养
人胶质瘤U118细胞采用含10%FBS （已灭活）的高糖DMEM 培养基培养细胞，将细胞置于37℃、5%CO 2培养箱中培养，依据细胞具体生长状况，带其长满培养瓶70%~80%时对其进行传代处理，周期约为2天到3天，取对数生长期的细胞用于后续实验研究。

1.3.2 CCK-8实验
细胞增殖情况采用CCK-8方法进行检测。

取对数生长期U118细胞，以1×104个细胞每孔接种于96孔板中，置于37℃、5%CO 2培养箱中过夜，待其贴壁后加入山慈菇水煎剂（200mg/mL ，400mg/mL ，600mg/mL ）培养24h ；另外同样分组，山慈菇水煎剂（200mg/mL ，400mg/mL ，600mg/mL ）作用于细胞48h 。

待药物作用时间足够，弃去细胞培养液，PBS 洗两遍，吸净PBS 洗涤液，加入10μL CCK-8试剂，在细胞培养箱中孵育4h ，450nm 波长处酶标仪测定各孔光吸收值（OD 值）。

每组
实验重复3次，记录数据用于后期统计。

增值抑制率（%）=[（对照组OD 值-加药组OD 值）/对照组OD 值]×100%。

1.3.3 划痕实验
将U118胶质瘤细胞接种于无菌6孔板中，每孔细胞数为2×106个，置于培养箱中，待过夜细胞贴壁后，使用200μL 的枪头划出一条直的划痕，使用PBS 将划下来的细胞洗涤干净，加入无血清DMEM 培养基，分别加入山慈菇水煎剂（200mg/mL ，400mg/mL ，600mg/mL ）培养0h ，24h ，48h 在显微镜下观察，并拍照记录，本实验重复三次，统计分析山慈菇水煎剂对U118细胞迁移的影响。

1.3.4 体外侵袭实验
在Transwell 小室（孔径8μm ）上室的底膜表面铺上40μL Matrigel 胶，稀释比例为1:3，37℃孵育0.5h 。

用无血清DMEM 培养液稀释对数生长期U118细胞，上室中加入100μL 细胞悬液，细胞数2×104个，Transwell 小室下室中加入500μL DMEM （含10% FBS ）培养液，恒温细胞培养箱培养过夜细胞贴壁后；分别加入山慈菇水煎剂（200mg/mL ，400mg/mL ，600mg/mL ）培养0h ，24h ，48h ，弃去上室培养液，加入甲醇固定0.5h ，0.1%结晶紫染色20min ，在显微镜下观察，细胞计数，并拍照记录。

实验重复3次，用于后期统计分析。

1.4 统计学方法
上述实验均需重复三次，实验获得的数据采用均数±标准差（`x±s ）表示。

数据采用SPSS 18.0软件进行统计分析，当P<0.05时，差异显著，具有统计学意义。

2 结果
2.1 山慈菇水煎剂对U118胶质瘤细胞增殖的影响
与对照组相比，加入山慈菇水煎剂不同浓度200mg/mL 、400mg/mL 、600mg/
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mL 培养24h 后，U118细胞增殖抑制率分别为12.51%、12.72%、39.28%，24h 山慈菇水煎剂作用后细胞的增殖抑制率均明显的高于对照组，差异显著具有统计学意义（P<0.05）；与对照组相比，加入山慈菇水煎剂不同浓度200mg/mL 、400mg/mL 、600mg/mL 培养48h 后，U118细胞增殖抑制率分别为20.64%、47.61%、51.23%，48h 山慈菇水煎剂作用后细胞的增殖抑制率均明显的高于对照组，差异显著具有统计学意义（P<0.05），如图1所示。

2.2 山慈菇水煎剂对U118胶质瘤细胞迁移的影响
对照组U118胶质瘤细胞培养24小时，细胞迁移至划痕的中间部分，加入山慈菇水煎剂不同浓度200mg/mL 、400mg/mL 、600mg/mL 培养24h 后，相对划痕面积分别为41.12%，68.33%，78.32%，24h 山慈菇水煎剂作用后细胞划痕面积均明显
的高于对照组，差异显著具有统计学意义（P<0.05）；对照组U118胶质瘤细胞培养48小时后，加入山慈菇水煎剂不同浓度200mg/mL 、400mg/mL 、600mg/mL 培养48h 后，相对划痕面积分别为30.12%，42.20%，64.21%，48h 山慈菇水煎剂作用后细胞划痕面积明显的高于对照组，差异显著具有统计学意义（P<0.05），如图2所示。

2.3 山慈菇水煎剂对U118胶质瘤细胞侵袭的影响
由表1可以看出，加入山慈菇水煎剂不同浓度200mg/mL 、400mg/mL 、600mg/mL 培养24h 后，侵袭细胞数目均明显的少于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）；加入山慈菇水煎剂不同浓度200mg/mL 、400mg/mL 、600mg/mL 培养48h 后，侵袭细胞数目均明显的少于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）；此外，研究还发
现，山慈菇水煎剂不同浓度200mg/mL 、400mg/mL 、600mg/mL 作用于U118胶质瘤细胞48h 侵袭数目明显的少于24h ，差异具有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论
中医中肿瘤主要归于“积聚”“痰核”范畴中，其发病可能与癌毒、痰凝、血瘀等相关。

痰是构成肿瘤组织的有形成分之一，因其胶着黏腻之。

山慈菇具有散结及化痰的作用，因此考虑其可能对于癌症具有治疗作用，且前期的多项研究表明，山慈菇具有抗肿瘤的药理作用，但是对于其具体的机制尚不明确[6]。

本研究结果显示，山慈菇水煎剂200mg/mL 、400mg/mL 、600mg/mL 培养24h 后，U118细胞增殖抑制率分别为12.51%、12.72%、39.28%，其对细胞的增殖抑制率明显的高于对照组；培养48h 后，加药组U118细胞增殖抑制率分别为20.64%、47.61%、51.23%，山慈菇水煎剂作用后细胞的增殖抑制率明显的高于药物作用24h 时。

加入山慈菇水煎剂不同浓度200mg/mL 、400mg/mL 、600mg/mL 培养24h 后，相对划痕面积分别为41.12%，68.33%，78.32%，细胞的迁移能力均明显的低于对照组；对照组U118胶质瘤细胞培养48小时后，相对划痕面积分别为30.12%，42.20%，64.21%，48h 山慈菇水煎剂作用后细胞迁移能力均明显的低于细胞培养24h 时。

加入山慈菇水煎剂不同浓度200mg/mL 、400mg/mL 、600mg/mL 培养24h 后，侵袭细胞数目均明显的少于对照组；加入山慈菇水煎剂不同浓度200mg/mL 、400mg/mL 、600mg/mL 培养48h 后，侵袭细胞数目均明显的少于对照组；此外，研究还发现，山慈菇水煎剂不同浓度200mg/mL 、400mg/mL 、600mg/mL 作用于U118胶质瘤细胞48h 侵袭数目明显的少于24h 。

综上所述，山慈菇水煎剂200mg/mL 、400mg/mL 、600mg/mL 作用于胶质瘤细胞24小时和48小时均能降低细胞的增殖、侵袭和迁移能力，且随着作用时间的延长，药物浓度的增加，药物的抗增殖、侵袭和迁移的能力均增加，对于具体的机制，还需进一步的研究。

（通讯作者：张璐萍）
参考文献
[1]郭淳,龚永杰,孙放等.山慈菇水煎剂
对人乳腺癌T-47D 细胞增殖和迁移的影响[J].中医学报,2017,32(10):1832-1835.
表1：山慈菇水煎剂对U118胶质瘤细胞侵袭的影响
时间细胞数（×105）对照组200mg/mL 400mg/mL
600mg/mL
24h 3.54±0.04 3.03±0.12*
2.64±0.25* 2.04±0.11*48h
6.33±0.25
5.02±0.13# 3.52±0.31#
3.07±0.16
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图2：山慈菇水煎剂对U118胶质瘤细胞迁移的影响
图1：山慈菇水煎剂作用24h、48h 对U118胶质瘤细胞增殖抑制率的影响
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