荣脑通络益智颗粒联合尼可地尔对脑小血管病模型大鼠认知功能及血管内皮生长因子和内皮抑制素表达的影响

104解剖学研究2021年第43卷第2期Ami丨Kes. 2021, V»l. 43, No.2
.论著•荣脑通络益智颗粒联合尼可地尔对脑小血管病模型 大鼠认知功能及血管内皮生长因子和内皮抑制素
表达的影响
马伟杰，王新兰，徐文武，汪昆
(青海省心脑血管病专科医院神经内科，青海西宁810012)
【摘要】目的观察荣脑通络益智颗粒联合尼可地尔对脑小血管病模型大鼠认知功能及血管内皮生长因子(V EG F)和内皮抑制素（ES)表达的影响并探讨可能存在的机制。

方法选取72只健康雄性SD大鼠，随机分成正 常对照组、假手术组、模型组、荣脑通络益智颗粒组、尼可地尔组及联合组，每组12只（Morris水迷宫实验6只，RT- PCR实验3只，Western blot实验3只）。

其中正常对照组未做处理，模型组采用同种系微栓子体外注射法构建大鼠 脑小血管病模型，假手术组给予生理盐水体外注射，3个治疗组分别给予荣脑通络益智颗粒、尼可地尔及二者联合 治疗。

造模后1d开始治疗，分别于造模后7 d、14 d和28 d采用Morris水迷宫实验检测学习记忆功能，RT-PCR和 Western blot检测大鼠脑组织中VEGF和E S的表达水平。

结果正常组与假手术组水迷宫数据差异无统计学意义(P>0.05),模型组逃避潜伏期显著升高（P<0.05),穿越平台次数显著降低（P<0.05);与模型组比较，荣脑通络益智 颗组和尼可地尔组逃避潜伏期均显著降低(P<0.05)和穿越平台次数显著减少(P<0.05);联合组作用效果显著优于 荣脑通络益智颗组和尼可地尔组（P<0.05)。

RT-PCR和Western blot结果显示，正常对照组和假手术组VEGF和ES mRNA和蛋白的表达水平差异无统计学意义（P>0.05);模型组VEGF明显低于假手术组（P<0.05),E S显著高于假 手术组（P<0.05)。

给予荣脑通络益智颗和尼可地尔后VEGF显著升高（P<0.05),E S显著降低（P<0.05),联合组效 果显著优于单独组(P<0.05)。

结论荣脑通络益智颗粒联合尼可地尔对脑小血管病模型大鼠认知功能具有显著的改善作用，可能与升高VEGF和降低ES表达水平有关。

【关键词】荣脑通络益智颗粒；脑小血管病；尼可地尔；血管内皮生长因子；内皮抑制素；大鼠
Effects of Rongnao Tongluo Yizhi granule and nicorandil on cognitive function and expression of vascular endotheli­al growth factor and endostatin in rats with cerebral vascular disease model MA Wei-jie, WANG Xin-lan, XU Wen-w u, WANG Kun. Department of Neurology, Qinghai Provincial Cardio - Cerebrovascular Disease Special Hospital, Xining, Qinghai Province 810012 , China
【Abstract】Objective To observe the effects of Rongnao Tongluo Yizhi granules combined with nicorandil on the cognitive function and the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and endostatin (ES) in rats with cerebro­vascular disease and explore possible mechanisms. Methods A total of 72 healthy male SD rats were randomly divided into normal control group, sham operation group，model group, Rongnao Tongluo Yizhi granule group, nicorandil group and combined group, 12 rats in each group (6 were treated with Morris water). Maze experiments, 3 for RT-PCR experiments and 3 for Western blot experiments). The normal control group was left untreated. The model group used the in vitro injec­tion of the same germline microemboli to construct a rat model of cerebral small vessel disease. The sham operation group was injected with physiological saline in vitro. The three groups were given Rongnao Tongluo Yizhi granule, Nicorandil and the combination therapy. The treatment was started 1day after the modeling. Morris water maze test was used to detect the learning and memory function at 7 days, 14 days and 28 days after the modeling. RT-PCR and Western blot were used to de­tect the expression of VEGF and ES in rat brain. Results There was no significant difference in water maze data between the normal group and the sham operation group. The escape latency of the model group increased significantly (P<0.05) , and the number of crossing platforms decreased significantly (P<0.05). Compared with the model group, the escape latency of the Rongnao Tongluo Yizhi capsule group and the nicorandil group were significantly reduced (P<0.05) and the number of
基金项目：青海省科技项目资助项目（2012-06)
解剖学研究2021 年第 43 卷第 2 期 Anat Res.2021，V«l.43. No.2105
crossing platforms was significantly reduced (P<0.05). The effect of the combined group was significantly better than that of the Rongnao Tongluo Yizhi granule group and the nicorandil group (P<0.05). RT-PCR and Western blot results showed that there was no significant difference in the expression levels of VEGF and ES mRNA and protein between normal control group and sham operation group (P>0.05) ; VEGF in model group was significantly lower than that in sham operation group (P<
0.05) ES was significantly higher than that in the sham operation group (P<0.05). After administration of Rongnao Tongluo
Yizhi capsules and nicorandil, VEGF significantly increased (P<0.05) and ES significantly decreased (P<0.05).The effect of the combined group was significantly better than that of the single group (P<0.05 ). Conclusion Rongnao Tongluo Yizhi granules combined with Nicorandil have significant effects on improving cognitive function in rats with cerebrovascular dis­ease ,which may be related to increasing VEGF and decreasing ES expression.
【Key words】Rongnao Tongluo Yizhi granule;Cerebral small vessel disease;Nicorandil; Vascular endotheli­al growth factor; Endostatin; Rat
脑小血管病（Cerebral small vessel disease,CS-V D)是一组临床综合征，主要表现为影像、病理及 认知的改变'v。

既往研究表明，C S V D是脑卒中、血管性痴呆及混合性痴呆发生的高风险因素' 更有进一步研究表明，约20%脑卒中患者是由CS-V D引起、目前C S V D主要以药物治疗为主，但 临床效果尚不令人满意，因此，对于新药研发和给 药方式的革新迫在眉睫。

本研究拟观察荣脑通络 益智颗粒联合尼可地尔对脑小血管病模型大鼠认 知功能及血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,V E G F)和内皮抑制素（Endostatin，E S)表达的影响并探讨可能存在的机制。

1材料与方法
1.1大鼠分组及给药
健康雄性8~10周S D大鼠购自青海省药品 检验检测院，合格证号：S Y X K(青）2019-0001，体 质量202〜245 g。

72只随机分成正常对照组、假手 术组、模型组、荣脑通络益智颗粒组、尼可地尔组 及联合组，每组12只（6只做Morris水迷宫实验，3 只做R T-P C R实验，3只做Western blot实验）。

荣 脑通络益智颗粒：熟地黄25 g、黄精24 g、党参26 g、当归12 g、白术13 g、蒲黄10 g、远志11 g、英丝 子23 g、淫羊藿28 g、泽泻10 g、甘草10 g、僵蚕10 g、枸杞子15 g、石菖蒲10 g,由本院药剂室制成颗 粒剂，每天1剂，10 m l温水溶解后采用插胃管方 式服用。

尼可地尔：喜格迈，规格：5 m g，国药准 字：J20180074,生产企业：Nipro Pharma Corporation Kagamiishi Plant)，0.17 m g.kg—1.t胃管服用。

1.2方法
1.2.1C S V D模型构建①同种系微栓子构建：大鼠左心室采血，无菌环境下于80$干燥箱中干燥 凝固，将血凝块研磨成粉末状，采用200 p m孔筛 进行筛选，将筛选后的粉末采用生理盐水溶解成 悬液制成微栓子。

②同种系微栓子体外注射：大 鼠腹膜腔注射苯巴比妥钠（3 mg/k g)进行深麻醉，仰卧位固定好大鼠，颈部备皮，消毒铺巾后取正中 切口暴露颈部视野，钝性分离一侧（以左侧为例）颈总、颈内及颈外动脉，短暂性结扎颈总动脉的近 心端和夹闭颈外动脉的远心端，由颈外动脉近心 端逆向推注0.3 m l微栓子悬液至颈内动脉,立即打 开颈总动脉，使微栓子沿着血流进人大脑前、中动 脉及其分支，同时对颈外动脉的近心端进行结扎，依次缝合并对皮肤表面进行消毒。

③造模成功验 证：待大鼠出现癫痫、瘫痪及异常运动时表示造模 成功。

整个过程中造模86只大鼠，手术过程中死 亡8只，术后死亡6只，整体成活率为83.72%。

1.2.2Morris水迷宫实验各组大鼠分别于造模后7、14、28d进行水迷宫测试，具体方法：将大鼠 置于直径为120 c m的圆筒内，筒四壁涂为黑色，水为不透明乳白色，水深40 c m。

池壁四周标有 A、B、C和D等4个人水口，将水池分成4个象限，分别于每个区正中离池壁33 c m处放置直径9 c m 高39 c m的圆柱形平台，平台顶低于睡眠1c m。

Morris水迷宫实验主要检测大鼠的逃避和空间探 索行为。

①逃避行为：以A、B、C和D进水口将各 组大鼠放入，计算大鼠寻找平台停留的时间，记为 逃避潜伏期，若2 m i n内未找到平台，实验操作者则 须引导大鼠找到平台，待大鼠停留l〇s后放入笼 中，此时记录时间为120 s。

每天该实验同一时刻 进行，每只大鼠进行4次，记录时间单位为s。

②空 间探索试验:将原有设置的平台撤出，以A、B、C 和
D 进水口将各组大鼠放人，观察大鼠2 m i n 内跨原 有平台区域的次数，每只大鼠每天重复测量2次， 取平均值记为最终结果，单位为每分钟的次数。

1.2.3 R T -P C R 检测造模后24h ,腹膜腔注射注 射苯巴比妥钠（3 mg /kg )进行深麻醉，取出大鼠脑 部海马组织，超声粉碎后置于TRlzol 中进行裂解， 采用R T -P C R 试剂盒提取海马组织中的总m R N A ， 测定总m R N A 的浓度。

V E G F ,上游引物：5、
C A T A G C T T G A A C G A C d ，下游弓| *:5'-G C T A G - G C T T C G G A G A G A C C - 3';E S ，上游弓| 物：5'-T C - C A C C C G C T A C G A C C A C C T - 3'，下游引物：5'- C C A T A G C C A C C A T C G C A C C G T G -3,。

采用 R T -P C R
扩增仪检测V E G F 和E S 的m R N A 水平。

扩增体系 为 10 |xl ，反应条件：50丈 2 r n i n J S t 10
15 S 、60t 1 m i n , 35个循环，采用2 —法计算
V E G F 和ES m R N A 相对表达水平。

1.2.4 Western blot 检测造模后24 h ,腹膜腔注 射注射苯巴比妥钠（3 mg /k g )进行深麻醉，取出大 鼠脑部海马组织置于事先预冷并溶解了磷酸酶抑 制剂和蛋白酶抑制剂的强效裂解液中，超声组织
裂解仪将组织裂解，B C A 法进行蛋白定量。

采用
S D S -聚丙烯酰胺凝胶进行目标蛋白的电泳，分离
目的凝胶区域并转P V D F 高分子膜，将P V D F 膜加 入5%脱脂牛奶中封闭2 h ，后加人一抗：小鼠抗
106
V E G F 免疫球蛋白（I g G ，1: 1 000)和兔抗ES IgG
(1 : 1 000); 4T ；冰箱孵育 24 h 后 0.01 mol/L 的 TBST 清洗10 minx 3次，后加人二抗：辣根过氧化物酶 (H R P )结合的驴抗小鼠和兔I gG (l : 1 000)，室温
孵育2丨1后0.01 mol /L 的T B S T 清洗10 minx 3次，采 用化学发光液进行发光，Bio -R a d 仪器摄片。

1.3统计学方法
本研究所有数据均在SPSS 22.0软件中进行 统计分析，计数资料采用百分比形式表示，组间差 异采用Z 2检验；计量资料采用均数±标准差 表示，组间差异采用单因素方差分析（One-way
A N 0V A ),组内差异采用精确L S D -f 检验；P <0.05
表示差异有统计学意义。

2
结果
2.1荣脑通络益智颗粒联合尼可地尔对脑小血管 病模型大鼠认知功能的影响
正常组与假手术组水迷宫数据未见明显差
异，模型组逃避潜伏期显著升高（P <〇.〇5),穿越平 台次数显著降低（P <〇.〇5)。

与模型组比较，荣脑 通络益智颗组和尼可地尔组逃避潜伏期均显著降 低（P <0.05)和穿越平台次数显著减少（P <0.05)。

联合组作用效果显著优于荣脑通络益智颗组和尼 可地尔组（/"〈0.05)。

解剖学研究 2021 年第 43 卷第 2 期 Anat Res ，2021，Vol. 43, N (>.2
表1
荣脑通络益智颗粒联合尼可地尔对脑小血管病模型大鼠行为的影响(S±i)
组别n 逃避潜伏期U )
穿越平台次数(次）
7d 14 d 28 d 7 d 14 d 28 d 正常对照组613.64±5.0514.02±5.1413.82±5.087.92±1.638.03±1.527.88±1.49假手术组613.82±4.7313.93±5.0114.01 ±4.938.11±1.558.09±1.667.92±1.45模型组
651.33±6.3853.09±6.5451.19±5.99 1.82±1.12 1.93±1.86 2.15±1.83荣脑通络益智颗粒组649.07±5.52**47.88±5.92*#45.28±5.61*# 1.91±1.09# 3.24±1.64，# 4.82±1.37，#尼可地尔组648.25±6.01*43.22±5.37，#41.28±5.02** 2.14±1.55*# 4.04±2.13.* 5.12±2.09'#联合组6
48.03±5.92_39.27±5.42.28.17±4.83_ 4.15±2.24* 5.41 ±2.26* 6.39±2.08'
F 值62.1056.1556.3521.3111.139.42P 值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
注：*与模型组比较，尺〇.〇5; *与联合组比较，7^0.05
2.2荣脑通络益智颗粒联合尼可地尔对脑小血管 病模型大鼠VEGF 和ES mRNA 表达的影响
R T -P C R 结果显示，正常对照组和假手术组 V E G F 和ES m R N A 表达水平差异无统计学意义
(P >0.05);模型组V E G F 明显低于假手术组（尸<0.05) ,E S 显著高于假手术组(P <0.05)。

给予荣脑
通络益智颗和尼可地尔后V E G F 显著升高（P < 0.05) ,E S 显著降低（P <0.05),联合组效果显著优 于单独组（P <〇.〇5)。

2.3荣脑通络益智颗粒联合尼可地尔对脑小血管 病模型大鼠VEGF 和E S 蛋白表达的影响
Western blot 结果显亦，正常对照组和假手术
解剖学研究 2021 年第 43 卷第 2 期 Anat Res,2021, V«l.43, N〇.2
表2各组大鼠海马组织中VEGF和ES mRNA表达水平
(^±5 )
组别n VEGF ES
正常对照组6 1.62±0.05’0.42±0.02*
假手术组6 1.65±0.03*0.47±0.01*
模型组6 1.01 ±0.02 1.12±0.03
荣脑通络益智颗粒组6 1.21 ±0.02-0.91 ±0.02-
尼可地尔组6 1.25±0.03，-0.88±0.02-
联合组6 1.35±0.02*0.61 ±0.02*
F值403.311066.02
P值<0.01<0.01
注：*与模型组比较，代0.05; *与联合组比较，7M).05
组V E G F和E S蛋白表达水平差异未有统计学意义 (户>0.05);模型组V E G F和明显低于假手术组（P< 0.05 )，E S显著高于假手术组（P<0.05)。

给予荣脑 通络益智颗和尼可地尔后V E G F显著升高（P< 0.05),E S显著降低（P<0.05)，联合组效果显著优 于单独组（P<0.05)。

表3各组大鼠海马组织中VEGF和E S蛋白表达水平
(1±5 )
组别n VEGF ES
正常对照组6 1.83±0.03* 1.01 ±0.02*
假手术组6 1.95±0.02* 1.07±0.03.
模型组60.92±0.01 2.35±0.03
荣脑通络益智颗粒组6 1.03±0.02*' 2.01 ±0.02-
尼可地尔组6 1.15±0.03** 1.88±0.02**
联合组6 1.54±0.03' 1.61 ±0.02*
厂值1873.473006.95
P值<0.01<0.01
注：*与模型组比较，代0.05; •与联合组比较，7^0.05
3讨论
脑小血管病是临床上如脑卒中、血管性痴呆
参考文献
[1] Bos D, Wolters FJ, Darweesh SKL, et al. Cerebral small
vessel disease and the risk of dementia ：A systematic re-
view and meta - analysis of population - based evidence [ J」•
Alzheimers Dement, 2018 f 14(11)： 1482-1492.
[2] Brown R, Benveniste H, Black SE, et al. Understanding 等多种疾病的诱发因素，由于起病初起症状不明 显，因此，大多数患者会进一步发展为较为恶性的 结果56。

荣脑通络益智颗粒是脑血管病常用的 中药方剂，经过多项研究证实其具有缓解患者脑 部血供、改善认知具有重要的作用7:。

尼可地尔 是具有明显疗效的西药，在心脏微小血管的扩张 过程中具有重要的作用—V本研究结合前人研 究的基础，初步探讨了荣脑通络益智颗粒联合尼 可地尔治疗脑小血管病的临床效果和可能存在的 潜在机制。

正常组与假手术组水迷宫数据未见明显差 异，模型组逃避潜伏期显著升高，穿越平台次数显 著降低。

与模型组比较，荣脑通络益智颗组和尼 可地尔组逃避潜伏期均显著降低和穿越平台次数 显著减少；联合组作用效果显著优于荣脑通络益 智颗组和尼可地尔组。

该结果表明，联合荣脑通 络益智颗和尼可地尔对于模型大鼠的学习记忆能 力具有显著的提升效果，符合本研究预期。

R T-P C R和Western blot结果显7K,正常对照组和假手 术组V E G F和ES m R N A和蛋白的表达水平未见显 著差异；模型组V E G F明显低于假手术组，E S显著 高于假手术组。

给予荣脑通络益智颗和尼可地尔 后V E G F显著升高，E S显著降低，联合组效果显著 优于单独组。

既往研究表明，V E G F在脑小血管病 模型大鼠中会显著降低，V E G F对脑小血管病具有 一定的保护作用；E S在脑小血管病模型大鼠中会 显著升高，促进脑小血管病甚至卒中的发生发展3 KM2]。

该结果进一步说明联合荣脑通络益智 颗和尼可地尔发挥作用的可能机制与升高V E G F 和降低E S有关。

综上所述，荣脑通络益智颗粒联合尼可地尔 对脑小血管病模型大鼠认知功能具有显著的改 善作用，这可能与升高V E G F和降低E S表达水平 有关。

the role of the perivascular space in cerebral small vessel
disease[J]. Cardiovasc Res, 2018, 114( 11 )： 1462-1473.
[3 ] Rensma S, Sloten TV , Launer L, et al. Cerebral small ves­
sel disease and risk of stroke, dementia, depression, and
all-cause mortality：a systematic review and Meta-analysis
[j]. Neurosci Biobehav Rev, 2018, 90：164-173.
[4] S0ndergaard CB, Nielsen JE, Hansen CK, et al. Heredi-
107
(下转第113页）
解剖学研究202丨年第43卷第2期Ami丨Res,2021，V»l.43, M〇.2
-158.
[10]颜亮，李陈广，徐丽慧，等.黄芩苷对NLRP3炎症小体
活化和细胞焦亡的抑制作用及其机制研究[j].免疫学
杂志，2018 ,34(2):93-100.
[11]高瑞泽，杨蒙蒙，孙文兵，等.内皮细胞焦亡及其相关疾
病的研究进展[J].国际外科学杂志，2020 , 47(6) :426- 430.
[12]赵祎芄.MJ33在大鼠脑缺血再灌注损伤中对NLRP3炎
性小体的作用及其机制[D]. 2019.
[13]胡兴，苟知贤，王幽梦，等.NLRP3炎症小体及其下游分
子在缺氧缺血新生大鼠海马中的表达及作用[J].实用
医学杂志，2019 , 4(2):369-370.
[14] Main BS, Villapol S, Sloley SS, et al. Apolipoprotein E4
impairs spontaneous blood brain barrier repair following
traumatic brain injury [ J j. Mol Neurodegener, 2018, 13
(1): 17-18.
[15] Robinson BI), Tharakan B, Lomas A, et al. Exploring
blood - brain barrier hyperpermeability and potential bio­
markers in traumatic brain injury [j]. Proc (Bayl Univ Med
Cent), 2020, 33(2) ： 199-204.
(收稿日期：2021-01-21)
113
(上接第107页）
tary cerebral small vessel disease and stroke [j]. Clin Neu­
rol Neurosurg, 155:45-57.
[5]朱慧，付文君，赵丽贤，等.脑小血管病总体负担与大
动脉粥样硬化性卒中转归的相关性[J].国际脑血管病
杂志，2018, 26(3): 167-171.
[6]刘瑞霞，魏森，许予明，等.脑小血管病影像学总体负
担与卒中转归[J].国际脑血管病杂志，2018, 26(12):
927-932.
[7]刘莉，杨同聚，王玉秋，等.荣脑通络益智颗粒配合盐
酸氟桂利嗪胶*对慢性脑供血不足认知功能的影响
[J].国际中医中药杂志，2018, 40(5):394-397.
[8]吴杰华.尼可地尔在冠心病治疗中的临床应用进展
[J].中西医结合心血管病电子杂志，2018,6(15): 17-
18.
[9]张雪，张宏，杨世诚，等.尼可地尔对老年冠心病患者
介入治疗后造影剂肾病的预防作用[J].中华老年心脑
血管病杂志，2019,21(8): 810-813.
[l〇] Dobrynina LA, Zabitova MR, Kalashnikova LA, et al. Hy­pertension and cerebral microangiopathy (cerebral small
vessel disease) ：genetic and epigenetic aspects of their re-
lationship[j]. Acta Naturae, 2018, 10(2)：4-15.
[11 ] Machuca-Parra A l, Bigger-Allen AA , Sanchez AV, et al.
Therapeutic antibody targeting of Notch3 signaling prevents
mural cell loss in CADASIL[j]. J Exp Med, 2017, 214
(8)： 2271-2282.
[12] Shahhoseini M, Bigdeli MR. Time course of neuroprotec­
tion induced by in vivo normobaric hyperoxia precondition­
ing and angiogenesis factors[j]. Iran J Basic Med Sci, 2017 ,
20(l)：67-74.
(收稿日期：2020-10-09)。