水产品兽药残留检测技术课件

水产品兽药残留检测样品前处理技术 2、提取方法
l 超临界流体密度与液体相似，但是溶质在其中的扩 散系数比液体中大得多。
l 极性低的碳氢化合物，醚，酯，环氧化合物，可以 在低压力下提取（7-10MPa）进行萃取，羟基，羧 基难萃取，一个羧基和两个羟基的化合物和三个酚 羟基的苯环衍生物可以被萃取；40 MPa以下，糖和 氨基酸都不能被萃取；分级极性差异和挥发性差异。
2.建立测定方法 建立测定方法和线性范围，为后续的各种工作提供分析手段，最 后根据干扰和使用情况逐步确立测定条件和建立标准曲线。如兽 残及代谢物属中等极性或较高极性化合物，不能直接进行GC分析， HPLC常用的检测器有紫外（UVD），荧光（FLD，共轭双烯）,电 化学（EehlD）。MS为非常规检测器。
8. MRM优化模式优化Tube Lens Offset和Collision Pressure
9.记录并保存子离子全扫描质谱图。保存Tune Method文 件。
建立液质定量分析方法
1、确立质谱条件（化合物优化）
建立液质定量分析方法
1、确立质谱条件（化合确立LC条件
5. 选择MS Only优化模式和Syringe Pump Infusion入口类 型选项
6.优化Tube Lens Offset、Spray Voltage、Sheath Gas Pressure、Aux Gas Pressure获得待测化合物稳定的准 分子离子峰。
7.选择MS+MS/MS优化模式设置Parent Mass、Charge State和Num Product对子离子进行优化。
水产品兽药残留检测样品前处理技术
3、净化方法
固相萃取（SPE）
水产品兽药残留检测样品前处理技术
3、净化方法
固相萃取（SPE）操作步骤：活化，上样，洗涤，洗脱。
其他方法
固相微萃取：固液吸附平衡 制备色谱法：制备HPLC分析激素残留 凝胶渗透色谱法：分子筛作用 膜分离技术：硝酸纤维，醋酸纤维等半透膜 基质固相分散技术：样品和填料的比例是1：4 免疫亲和色谱：连接有抗体的惰性基质做固定相，选择性吸附。 分子印迹技术：印迹聚合物，塑料抗体
主要内容
l 兽药残留概述 l 前处理技术 l 液质分析残留方法的建立步骤 l 方法验证 l 能力验证思路和经验
水产品兽药残留分析概述
兽药残留（animal drug residues） 是指给动物使用药物后蓄积或贮存 在细胞、组织或器官内的药物原形、 代谢产物和药物杂质。
水产品兽药残留分析概述
农业部193号公告兽药禁用清单有21类， 包括硝基呋喃类，孔雀石绿类，氯霉素类， 汞制品类等，出口水产品重点监测的兽药 还包扣磺胺类，喹诺酮类，大环内酯类， 青霉素类，四环素类等。出口指定的兽药 检测项目要求不得检出。
3、内标选择
内标工作方式：
l 在每个样品、标准和空白中加入 l 测定到每个样品中内标的响应 l 根据实际测定内标响应值与预期内标响应值的比值
来校正其他化合物的信号 l 用分析信号和内标的比作标准曲线或乘校正因子或
除内标回收率 l 计算未知样品的分析信号和内标的比值并从标准曲
线中读出信号
建立液质定量分析方法
能力验证经验及基质效应
考核中的质量控制方法
l 控制样品空白 l 平行双样测定或三样 l 加标回收 l 标准参考物质的同步分析 l 重复测定和仪器比对
能力验证经验及基质效应
加标回收：可分为前处理加标回收和上机加 标（单点标准加入）
能力验证经验及基质效应
加标回收：可分为前处理加标回收和上机加 标（单点标准加入） l 加标回收接近100％不能代表考核结果完全 准确无误 。 l 不能检查标准物质本身所带来的误差； l 不能检查加和性干扰 ，如污染和质谱干扰 ；
水产品兽药残留分析概述
兽药残留超标的主要原因 1、非法使用违禁药品 2、不遵守休药期，《中国兽药典》。 3、其他原因如饲料加工的交叉污染，
动物个体代谢差异等。
水产品兽药残留分析概述
对兽药残留实施监控是一种复杂的系统工程， 包括从药物研制、注册登记、生产、使用及食品和 环境监测等诸多环节。建立残留分析方法和制定最 高残留限量、休药期是最基本的方面。
3、内标选择
1.样品中不存在或者可以忽略 2.没有受到质谱干扰 3.没有对分析对象产生质谱干扰 4.不容易受到环境污染 5.和分析对象质量数接近（氘代物） 6.离解方式和分析对象接近
能力验证经验及基质效应
为什么要采用LC-MS l 考核化合物的含量越来越低 l 基体越来越复杂 l 药残的能力验证建议的第一方法 例如： l 干鱼粉中的恩诺沙星和环丙沙星 l 鱼肉中的氟苯尼考
水产品兽药残留检测样品前处理技术
3、净化方法
固相萃取（SPE）
采用固相萃取小柱作为分离媒介，小柱中添加了不 同填料的固定相，以键合硅胶为基质的C18、NH2、 COOH、PSA、SAX等，是硅胶的表面活性大为降 低，最大程度的降低了极性化合物的不可吸附和拖 尾，使样品回收率和重现性得到保障；以高分子聚 合物为基质的如PEP、HXN、PAX、PCX等，具有 高纯度、高比表面的特点；以吸附型填料为固定相 的如硅酸镁、氧化铝等，主要通过表面的极性吸附 达到分离的目的。因此，固相萃取法适用于各种极 性的化合物
水产品兽药残留检测样品前处理技术
2、提取方法
超临界流体萃取仪— 流体源，加压装置， 控温装置，萃取容器， 节流装置，收集装置。 CO2作为流体操作温 度低，利于热不稳定 的化合物，组分中不 含氧，防止氧化。
水产品兽药残留检测样品前处理技术
3、净化方法
液-液萃取LLE
LLE利用待测组分与样品杂质在互不相溶的 两相中溶解性差异进行净化。设计的基础为： 极性组分与非极性组分；极性物质再分成酸 性，中性，碱性物质。正己烷（石油醚）乙腈；正己烷-甲醇；正己烷-丙酮；异辛烷 -80%丙酮；氯仿-水；乙酸乙酯-水。 影响因素：溶剂，PH值（磺胺，喹诺酮，苯 并米唑类，苯乙胺类等）
建立液质定量分析方法
文献检索：了解化合物的性质包括化合物的结 构、化合物的极性及化合物的pKa值。首先了 解化合物的结构，可大概的推断其碎片离子的 断裂方式，选择较为稳定的碎片离子作为定量 的子离子，也可以根据经验判断选用哪种离子 源更为合适；根据化合物的极性大小，可以选 择一种或几种恰当的溶剂作为溶媒，既能保证 完全将样品溶解，又能提高化合物的质谱响应； 化合物的pKa值，有助于选择流动相的添加剂 及其pH值，从而提高质谱响应。
l 在液相-紫外检测中，使用的添加剂的种类繁多，可以是挥 发性的酸或者碱（如甲酸、乙酸和氨水等），也可以是不 易挥发的缓冲盐（如磷酸二氢钠-磷酸缓冲液、磷酸二氢钾 -磷酸缓冲盐）。但是在液质分析中，基于质谱检测的原理， 我们只能使用可挥发的酸碱或缓冲盐，那么种类就会受到 极大的限制。在日常分析中使用到的添加剂主要有甲酸、 乙酸、三氟乙酸、氨水和甲酸铵、乙酸铵等缓冲盐。三乙 胺在紫外检测中，常作为扫尾剂，但是在液质检测中是绝 对禁止的。因为三乙胺进入质谱后不易清除，残留及其严 重，能够抑制离子的响应。
水产品兽药残留检测样品前处理技术
3、净化方法
液-液萃取操作方法
分液漏斗震荡，漩涡萃取，逆流萃取，特殊容器萃 取。
从水相中提取药物时溶剂中常带如少量的水分，可 干扰固相萃取，延长浓缩时间和增加杂质，加无水 硫酸钠脱水。高极性的药物在净化中发生吸附，硅 烷化玻璃器皿（1%三甲基氯硅烷的甲苯溶液淌一次， 100℃下干燥30min）；加异丙醇或二乙胺也能降 低吸附。
建立液质定量分析方法
2、确立LC条件
l 由于生物样品中含有大量的基质，这些基质 的存在会严重的干扰和影响化合物的测定， 因而我们需要利用色谱将化合物与基质分开， 从而降低基质效应的影响，即降低离子抑制。
l 待测化合物要在色谱柱上有保留，并且适当 延长保留时间。三聚氰胺最好用离子柱。
建立液质定量分析方法
l 加无水硫酸钠，盐析提高回收率。干样（含水小
10%）加水增强提取。
水产品兽药残留检测样品前处理技术
2、提取方法
l 均浆提取法；震荡法；索氏提取法（考虑热 稳定性，适合水分少如饲料样品，水产品组 织要和海砂或无水硫酸钠一起研磨成干粉）； 超声波提取（SAE，空化作用，增加溶解， 时间不能长，发热）；超临界流体萃取 （SFE），强化溶剂萃取（ASE）和微波辅助 萃取（MAE）
随着兽药科技的发展，新兽药品种还会不断出 现，因此需要不断地制定和修订在水产品的兽药最 高残留限量规定及相应的残留检测方法。
兽药残留检测概述
兽药残留检测 涉及到稳定性试 验方法，提取方 法，净化方法， 测定方法(分离方 法检测方法)。
兽药残留检测概述
1.文献检索 文献检索仅能显示最适宜的分析方法可能是什么，提供样品处理， 分离和检测方面粗略信息，进行方法的比较和借鉴，调整具体的 实验条件，改进和建立符合要求的新方法。如针对新对象或采用 新技术，可以从较早的化学合成文献得到待测物的物理性质或分 离方面的原始资料，或从具有相近结构或官能团化合物的方法方 法中获得某些信息和提示。有现成标准方法的采用现成标准方法 （验证）。
目前国内颁布的法定检测方法还缺乏系统性和 完善性，其他危害性比较大，特别是出口欧盟产品 必须要检测的品种如抗甲状腺制剂、类固醇类、硝 基咪唑类药物、精神类药物、抗蠕虫药物、环境污 染物等的检测方法尚在研究之中。
2002年农业部再次对已发布的兽药最高残留限 量标准进行了修订并重新发布，此次共规定了134 种兽药的《动物性食品中兽药最高残留限量标准》。
水产品兽药残留检测样品前处理技术 4、浓缩富集及再溶解
旋转蒸发：溶剂可回收 气流吹蒸：少量溶剂 K-D浓缩器：浓缩，回流，洗涤，定容 真空离心：热敏性组分，粘稠液体 再溶解使用流动相的初始比例作溶剂
建立液相色谱串联质谱定量分析方法
步骤
1.确立质谱条件 2.建立LC方法 3.内标选择 4.前处理方法选择
l 在液相色谱紫外检测中，要求化合物之间R≥1.5，进行定 量，那R最好≥2.0，要求准确的配制流动相，精确的调好 流动相的pH及添加剂的浓度。但在液质分析中，我们经常 使用多反应监测（MRM/SRM）对化合物进行定量，由于 MRM要求选择两次离子，因此它具有很高的专属性，基于 这点我们对多个化合物同时进行检测时，不需要彼此间达 到完全分离就可以对他们进行定量分析。
兽药残留检测概述
3.建立样品处理方法 提取，净化，衍生
4.标准曲线 LC-MS/MS要求设4个点，相关系数大于0.995，有外标 （基质匹配法）和内标，标准加入法，基质匹配法。
5.稳定性试验 一般包括标准溶液（溶剂）和样品中贮存条件下的稳 定性试验，如室温，冷冻，反复冷冻-解冻条件下的稳 定性。
6.方法评价 准确度，精密度，灵敏度等。
能力验证经验及基质效应
标准参考物质的同步分析 ：选择基体和浓度 相似的标准参考物质同步进行分析
水产品兽药残留检测样品前处理技术
样品处理方法涉及的因素很多，操作复 杂，方法灵活，直接影响各项分析指标、 成本和效率，一般占70%的分析工作量。
水产品兽药残留检测样品前处理技术
1、提取溶剂的选择
常用的提取溶剂有乙腈，甲醇，丙酮，这些 溶剂与水，稀酸，稀碱的混合溶剂如乙腈-甲 醇，氯仿-甲醇，乙腈-水，或酸化，碱化等。 乙酸乙酯，氯仿，二氯甲烷，乙醚和叔丁基 甲醚。叔丁基甲醚可代替卤代溶剂。
建立液质定量分析方法
建立液质定量分析方法
1、确立质谱条件（化合物优化）
1.连接管路 2. 选择Q1MS扫描模式和Full Scan扫描类型 3. 设置离子源参数 4.将流动相导入质谱仪，观察到待测化合
物的准分子离子峰峰强度在10的6次方左 右。
建立液质定量分析方法
1、确立质谱条件（化合物优化）
1、提取溶剂的选择
l 乙腈，甲醇，丙酮与样品容易结合，溶剂化作用和 渗透能力强，粘度小，提取速度快，能使结合态的 药物释放，提取的同时脱蛋白脱脂，PH值可调，待 测物分布均匀。但提取的杂质较多，进一步萃取乳 化严重，效果相似，甲醇提取液的杂质最高。“万 能溶剂”DMSO沸点高极少用。
l 在酯溶性的残留物中，采用非水溶性极性溶剂，乙 酸乙酯，氯仿，二氯甲烷，乙醚。