大黄素、黄芪多糖在体外对乙型肝炎病毒的抑制作用(精)

大黄素、黄芪多糖在体外对乙型肝炎病毒的抑制作
用
[ 08-01-15 11:18:00 ] 编辑：studa20
作者：党双锁张正国张欣宋平边静程延安
【摘要】目的体外观察大黄素、黄芪多糖单用与联合应用抗HBV的作用。

方法以HepG2.2.15细胞为研究模型，选用干扰素α、拉米夫定为阳性对照药物，观察培养液中加入不同浓度大黄素、黄芪多糖及两药联合应用抗HBV
作用的效果。

采用Taq man荧光定量PCR检测细胞上清HBV DNA，ELISA检测培养上清液HBsAg、HBeAg水平的变化。

采用MTT法观察它们对细胞生长的影响。

结果大黄素的3个剂量组(12.5、25.0、50.0mg/L)和所观察的时间点(3、6、9d)对HBV DNA、HBsAg、HBeAg表现出剂量与时间依赖的抑制作用(P<0.05)。

大黄素对HBV DNA抑制的半数抑制浓度为21mg/L，对HepG2.2.15细胞半数细胞
毒性浓度为40.66mg/L，治疗指数为1.94。

同时发现黄芪多糖各剂量组对HBV
无明显的抑制作用(P>0.05)。

大黄素、黄芪多糖联合应用在疗效方面无明显的交互作用(P>0.05)。

结论大黄素在体外对HBV具有一定的抑制作用，黄芪多糖无明显抑制HBV的作用，两药联用无明显协同抗HBV的作用。

【关键词】大黄素；黄芪多糖；乙型肝炎病毒；细胞培养
Inhibition on hepatitis B virus by emodin and astragalus polysaccharides in vitro
ABSTRACT: Objective To investigate the effects of emodin, astragalus polysaccharides (APS) on hepatitis B virus (HBV) in vitro. Methods Human hepatoma G2.2.15 cell line stably expressed hepatitis B virus particles in culture. The cells were exposed to different concentrations of emodin, APS, interferon α, and lamivudin, respectively. Real time PCR was applied to quantify extracellular HBV DNA and ELISA was applied to assess HBsAg and HBeAg. MTT assay was used to evaluate the cytotoxicity of drugs. Results The results showed that exposure of HepG2.2.15 cells to emodin resulted in a time and concentration dependent inhibition of HBV DNA replication and HBsAg, HBeAg secretion (P<0.05). IC50 to HBV DNA was 21mg/L, CC50 to HepG2.2.15 cells was 40.66mg/L, and the treatment index (TI) was 1.94. APS could not restrain HBV DNA, HBsAg and HBeAg obviously in vitro (P>0.05). The interaction was not significant between emodin and APS (P>0.05). Conclusion Emodin had time and concentration dependent inhibitory effects to HBV in vitro in some extent; APS could not inhibit HBV obviously in vitro; Co administration of
emodin and APS had not significant interaction in restraining HBV in vitro.
KEY WORDS: emodin; astragalus polysaccharides; hepatitis B virus; cell culture
病毒性乙型肝炎的治疗关键是抗病毒治疗。

中药在肝病治疗中起着很重要
的作用。

大黄和黄芪是治疗乙肝复方中最常用到的两味中药。

近年来，研究证
明它们对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)有一定的治疗作用。

大黄素(emodin)是中药大黄的主要有效单体，黄芪多糖(astragalus polysaccharides, APS)是黄芪的主要有效成分。

本研究以HepG2.2.15细胞为体外HBV复制模型，初步观察大黄素、黄芪多糖单独及联合应用对HBV的抑制作用。

1 材料与方法
1.1 药物大黄素(纯度950g/L购自西安崇信天然添加剂有限公司，由国家中药鉴定所鉴定，批文号：25100806)，黄芪多糖(纯度为600g/L，西安鸿
生生物技术有限公司生产，国家中药鉴定所鉴定，批号：040618)，干扰素
α(购自罗氏公司，批号：010801 I)，拉米夫定(3TC)0.1mmol/L的母液，由
西安交通大学药学院提供。

1.2 试剂及主要仪器噻唑蓝(MTT，Sigma)，二甲基亚砜(DMSO, Sigma)，HBsAg和HBeAg的ELESA检测试剂盒(上海华泰生物工程公司)，HBV DNA提取及扩增荧光检测试剂盒(广州中山大学达安基因股份有限公司)，和
PE7700型自动荧光PCR仪(美国Perkin Elmer公司)。

1.3 细胞 HepG
2.2.15细胞由第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗
中心惠赠，可稳定表达乙肝病毒蛋白并分泌病毒颗粒。

培养液为
DMEM(Gibco)，含200mL/L胎牛血清(杭州四季青生物材料公司)、0.3g/L谷氨
酰胺(Gibco)，1×105u/L青链霉素(华北制药厂)，碳酸氢钠调整pH值到7.2。

消化细胞用2.5g/L胰蛋白酶(Gibco)。

1.4 细胞培养
2.5g/L胰蛋白酶消化细胞，以1×104个/孔接种于96
孔板，每孔200μL，于37℃、50mL/L CO2培养箱培养24h，待细胞贴壁后，换培养液进行实验。

1.5 实验分组实验共分3大组，17个剂量组，分组如下：阳性对照
组分别为干扰素(INFα)、拉米夫定，各设3个剂量组(125000、250000、500000u/L INF α；0.025、0.05、0.1μmol/L 3TC)；实验组为3个组，即大
黄素组(12.5、25.0、50.0mg/L)，黄芪多糖组(120、240、480g/L)，联合用药
组(25.0mg/L大黄素＋120g/L黄芪多糖，50.0mg/L大黄素＋120g/L黄芪多糖，25.0mg/L大黄素＋240g/L黄芪多糖，50.0mg/L大黄素＋240g/L黄芪多糖)；阴性对照组即生理盐水组，用等体积生理盐水加入。

实验中除阴性对照组设10个复孔外，其余每个剂量组设5个复孔，用含药物培养液进行干预培养。

每3d换
同样浓度含药培养液及对照培养液1次。

各孔在3、6、9d时，将吸去的上清液置于-20℃冰箱保存待检。

1.6 MTT实验加药第9天吸去上清，每孔加5g/L的MTT 20μL，37℃培养4h，弃上清后，每孔加入150μL DMSO，震荡10min，测定570nm吸光度。

按下列公式计算细胞的抑制百分率。

细胞抑制百分率=阴性对照组平均A值-实验组平均A值阴性对照组平均A 值×100%按下列公式计算药物的半数细胞毒性浓度(CC50)。

CC50= lg-1B+0.5-<50%抑制百分率>50%抑制百分率-<50%抑制百分率
×C (B=lg<50%药物浓度，C=lg2)
1.7 荧光定量PCR法检测细胞外HBV DNA[1] 按照达安基因股份有限公司HBV核酸提取与核酸扩增荧光检测试剂盒说明书操作。

两引物序列分别为P15′ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT3′，P25′ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA3′，荧光探针序列为5′TGGCTAGTTTACTAGTGCCA TTTG3′。

各反应管放入PE7700自动荧光PCR仪，按下列条件扩增：93℃ 2min预变性，然后93℃ 45s到55℃ 1min循环扩增10个循环，再按93℃ 30s到55℃ 45s 循环扩增，共30个循环。

反应结束后由计算机自动分析出HBV DNA定量结果。

按照下面公式计算药物对HBV DNA的抑制率。

HBV DNA抑制率=阴性对照组HBV DNA拷贝数-实验组HBV DNA拷贝数阴性对照组HBV DNA拷贝数×100%按下列公式计算药物的半数抑制浓度(IC50)。

IC50=lg-1B+0.5-<50%抑制百分率>50%抑制百分率-<50%抑制百分率×C
(B= lg <50%药物浓度，C=lg 稀释倍数的倒数)
治疗指数(TI)= CC50/IC50。

1.8 HBsAg和HBeAg的测定使用双抗体加心ELESA法[1]。

根据试剂盒说明测定培养上清液的HBsAg和HBeAg，记录P/N值，按照下面公式计算药物对HBV DNA的抑制率。

HBsAg(HBeAg)抑制率=对照组P/N值-药物组P/N值对照组P/N值-
2.1×100%
1.9 统计学处理计量资料用均数±标准差表示，应用SPSS11.0软件进行方差分析检验，Student Newman Keuls进行不同组之间的两两比较。

采用析因分析观察两种药物的交互作用，检验水准α=0.05。