细菌总DNA提取原理与方法

琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子 筛效应使不同大小的DNA分子分离 把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得 到检测 溴化乙锭（EB）在紫外光照射下发射荧光， EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物
[实验材料] 细菌总DNA溶液 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头， 微波炉，紫外透射检测仪等 琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，溴化乙锭 （EB），6X载样缓冲液
方法二： 1. 加入DNA提取液100 mmol/l， （Tris100 mmol/l EDTA，100 mmol/l Nacl，1%pvp , 2%SDS，pH=8）旋涡混匀 2. 在摇床上250 r/min振荡2h，4℃沉淀DNA 1 h，13000 r/min离心10min收集DNA 沉淀 3. 用100μlTE溶解 DNA
方法四：
1. 取20μl TE、 20μl 饱和酚与无菌小离心管中 2. 取已经培养好的菌一环到上述离心管中 3. 震荡离心管30秒 4. 离心， 8000rpm, 10min 5. 取上清 3-5 μl 进行琼脂糖凝胶电泳检测
（二）DNA的琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成 具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂 糖的浓度 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电 场作用下向正极泳动 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效 应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构 型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不 同的区带
常用的电泳缓冲液
4℃ 保存备用
常用的6X载样缓冲液
Ⅰ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液 Ⅱ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液
ຫໍສະໝຸດ Baidu
制
胶
加
样
细菌总DNA样品应呈现一条迁移率很 小的整齐条带，前端有大量RNA分子
[注意事项]
1.
2.
EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环 境。 总DNA提取过程中，离心管不可剧烈震动，防 止过多的断裂。
[作业] 1. 实验报告：题目、材料方法、实验结果与分析 2. 为什么DNA提取时，革兰氏阳性菌和革兰氏 阴性菌的方法有所不同？ 3. 影响DNA迁移率的因素有那些？
2.
[实验步骤和过程] （一）细菌总 DNAD 提取 革兰氏阳性菌DNA提取方法(提取基因组DNA) 1. 3-6ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 弃上清 2. 加0.5ml TE悬浮沉淀,并加75μl 溶菌酶（20mg/ml） 溶液，40°C保温30分钟 3. 加50μl, 10% SDS, 5μl 蛋白酶 K （20mg/ml）,混 匀, 37℃保温30分钟 4. 加0.75ml, 5mol/L NaCl, 混匀 5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离 心10分钟, 将上清液移至干净离心管
方法三：
1.
加入DNA提取液（100 mmol/l， Tris100 mmol/l EDTA，100 mmol/l磷酸钠，1.5mol/l Nacl，1%CTAB，pH=8），20μl蛋 白酶K（20mg/ml）和500μl溶菌酶（0.15mol/l Nacl,0.1mol/l Na2EDTA, 15mg/ml溶菌酶，pH=8），37℃温浴2h。
[实验步骤] 1. 1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液 中，摇匀，微波炉加热溶解。 2. 将冷却至50℃的凝胶倒入制胶室，插入梳 子，室温冷却凝固 3. 将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液 至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出 梳子
4.
5.
6.
7.
用移液器吸取总DNA 4μl于封口膜上，再加 入1μl 的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入 点样孔 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见 到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约 30min-60min 电泳结束后取出凝胶，置EB 溶液中染色 5~10min，清水漂洗 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖 上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧 光的DNA条带
2. 3. 4.
加入1 ml 20%SDS，65℃水浴过夜 加入1/3倍体积饱和Nacl,剧烈振荡，12000 r/min 离心10min 取上清，用等体积苯酚：氯仿：异戊醇各抽提1次，水相中加入 等体积TE，再加入0.6倍体积的异丙醇室温沉淀DNA 2h
5.
12000 r/min 离心10min收集DNA沉淀，用200μlTE溶解
6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 静置10分 钟，5000转离心10分钟，转移上清到干净管 中。 7. 加2倍体积乙醇沉淀DNA, 颠倒混合, 室温下静 止10分钟， 离心沉淀DNA 8. 70%乙醇漂洗DNA后, 吸干, 用30-50μl TE溶 解DNA, -20℃保存
革兰氏阴性菌总DNA提取方法 方法一： 1. 将菌液悬于1.5ml溶菌酶溶液（0.15mol/l Nacl, 0.1mol/l Na2EDTA, 15mg/ml溶菌酶，pH=8）. 2. 37℃温浴2h， 3. 加入1.5ml 10%SDS（0.1mol/l Nacl，0.5mol/l Tris，10%SDS，pH=8）反复颠倒混匀10min， 10000r/min离心10min，取上清 4. 用等体积苯酚：氯仿：异戊醇各抽提1次，水相中加 入40μl的3mol/l乙酸铵和3ml无水乙醇，-20℃沉淀 DNA1h，12000r/min 离心10min 5. 收集DNA沉淀，用100μl TE溶解
实验十二、细菌总DNA提取、凝胶电泳检测 基本概念： 总DNA（total DNA, genomic DNA ） 凝胶电泳
[实验目的] 1.学习细菌总DNA提取的原理和方法 2. 学习琼脂糖凝胶电泳方法
[实验材料]
1.
菌种 自己分离纯化后的细菌菌株
试剂 TE、溶菌酶溶液（20mg/ml）、10% SDS、 蛋白酶K（20mg/ml）、5mol/L NaCl 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、乙醇 3. 仪器 高速台式离心机、紫外检测仪 4. 其他材料：离心管、无菌吸头 、移液器等
附：背景资料
琼脂糖电泳的优点
（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由 电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。 （2）电泳速度快。 （3）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测 仪作定量测定。 （4）样品易回收，常用于制备。
配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据 被检的DNA分子大小来确定，琼脂糖 凝胶浓度与线性DNA分辨范围见下表