基因分析的基本策略
基因组测序数据分析中常见问题及解决策略
基因组测序数据分析中常见问题及解决策略基因组测序是一项重要的技术，已经广泛应用于生物医学研究、疾病诊断和个体化治疗等领域。
然而，基因组测序数据分析过程中常会遇到一些问题，正确解决这些问题对于准确地分析基因组数据至关重要。
本文将探讨基因组测序数据分析中常见的问题，并提出解决策略。
一、质量控制问题质量控制是基因组测序数据分析的第一步，主要目的是检查测序数据的质量，并去除质量较差的数据。
常见的质量控制问题包括低质量碱基、接头污染和重复序列等。
针对这些问题，可以采取以下策略。
首先，使用质量评估工具（如FastQC）检查测序数据的质量分布。
对于低质量碱基，可以通过Trimming或过滤掉具有低质量碱基的序列来解决。
接头污染可以通过使用Trimming工具删除接头序列来解决。
对于重复序列，可以利用特定软件（如Prinseq）去除这些序列，以保证数据的准确性和可靠性。
二、序列比对问题在基因组测序数据分析中，序列比对是其中一个关键步骤，目的是将测序数据与参考基因组进行比对，并得到每个位置的reads覆盖度。
常见的问题包括参考基因组选择和序列比对比对率等。
针对这些问题，可以考虑以下解决策略。
首先，对于参考基因组的选择，应根据具体研究目的和样本特点选择最适合的参考基因组。
对于高变异的样本，可以选择一致性较高的参考基因组进行比对。
其次，比对率低的问题可以通过选择合适的比对工具来解决。
目前常用的比对工具包括Bowtie、BWA等，根据具体情况选择适合的工具进行比对。
三、变异检测问题基因组测序数据分析的主要目的之一是检测样本中的变异，包括单核苷酸变异（SNV）、插入缺失变异（Indel）等。
常见的变异检测问题包括假阳性和假阴性。
针对这些问题，可以考虑以下策略。
首先，采用多个变异检测工具进行分析，不仅能够减少假阳性结果的产生，更能提高结果的准确性。
其次，对于假阴性结果，可以根据实验的目的进行进一步的验证，如采用Sanger测序等验证方法来提高结果的可信度。
全基因组关联分析（GWAS）取样策略
全基因组关联分析（GWAS）取样策略GWAS要想做得好，材料选择是至关重要的一环。
So，小编查阅了上百篇GWAS文献，精心梳理了一套GWAS的取样策略，是不是很贴心呢？赶紧来学习一下吧！一、常见经济作物样本选择对于经济作物来说，一般都有成百上千个品系，其中包括野生种、地方栽培种、驯化种及商业品种。
一般选择多个品系来确保群体遗传多样性。
文献中常见的经济作物的样本收集于全国或者全世界各地。
表1 常见经济作物样本收集二、常见哺乳动物样本选择对于哺乳动物，一般选择雄性个体作为研究对象（除研究产奶、产仔等性状外），并且要求所研究的对象年龄相近。
下表是我们统计的一些已发表的哺乳动物取材案例，供大家参考。
表2 常见哺乳动物样本收集三、常见家禽类样本选择对于家禽而言，一般会选择家系群体（全同胞家系或半同胞家系）。
为了增加分析内容，可以构建多个家系群体进行研究。
此外，尽量使群体所有个体生长环境以及营养程度保持一致，同时家禽的年龄也尽量保持一致，这对表型鉴定的准确性有很大的帮助。
表3 常见家禽类样本收集四、林木类样本选择对于林木类，一般选择同一物种的多个样本，多个样本做到表型丰富。
表4 林木类样本收集五、其他物种样本选择对于原生生物以及昆虫等的取样策略，可以参考表5中已发表的文献。
表5 其他物种样本收集有这么多文献支持，各位看官是不是已经整明白了GWAS该如何取材呢？最后，小编再温馨提示一句，根据文献统计及项目经验，一般来说，GWAS的样本大小要不少于300个才是极好的。
参考文献[1] Jia G, Huang X, Zhi H, et al. A haplotype map of genomic variations and genome-wide association studies of agronomic traits in foxtail millet (Setaria italica)[J]. Nature Genetics, 2013, 45(8):957-61.[2] Zhou L, Wang S B, Jian J, et al. Identification of domestication-related loci associated with flowering time and seed size in soybean with the RAD-seqgenotyping method[J]. Scientific reports, 2015, 5.[3]Zhou Z, Jiang Y, Wang Z, et al. Resequencing 302 wild and cultivated accessions identifies genes related to domesticatio n and improvement in soybean[J]. Nature Biotechnology, 2015, 33(4):408-414.[4] MorrisG P, Ramu P, Deshpande S P, et al. Population genomic and genome-wide association studies of agroclimatic traits in sorghum[J].Proceedings of the National Academy of Sciences, 2013, 110(2): 453-458.[5] Yano K, Yamamoto E, Aya K,et al. Genome-wide association study using whole-genome sequencing rapidly identifies new genes influencing agronomic traits in rice[J]. Nature Genetics, 2016, 48(8).[6] Wang X, Wang H, Liu S, et al. Genetic variation in ZmVPP1 contributes to drought tolerance in maize seedlings[J]. Nature Genetics, 2016.[7] Pryce J E, Bolormaa S, Chamberlain A J, et al. A validated genome-wide association study in 2 dairy cattle breeds for milk production and fertility traits using variable length haplotypes[J]. Journal of dairy science, 2010, 93(7):3331-3345.[8] Hayes B J, Pryce J, Chamberlain A J, et al. Genetic architecture of complex traits and accuracy of genomic prediction:coat colour, milk-fat percentage, and type in Holstein cattle as contrastingmodel traits[J]. PLoS Genet, 2010, 6(9): e1001139.[9] Heaton M P, Clawson M L, Chitko-Mckown C G,et al. Reduced lentivirus susceptibility in sheep with TMEM154 mutations[J].PLoS Genet, 2012, 8(1): e1002467.[10] Tsai K L, Noorai R E, Starr-Moss A N, et al. Genome-wide association studies for multiple diseases of the German Shepherd Dog[J]. Mammalian Genome, 2012, 23(1-2): 203-211.[11] Petersen J L, Mickelson J R, Rendahl A K, et al. Genome-wide analysis reveals selection for important traits in domestic horse breeds[J]. PLoS Genet, 2013,9(1): e1003211.[12] Do D N, Strathe A B, Ostersen T, et al. Genome-wide association study reveals genetic architecture of eating behaviorin pigs and its implications for humans obesity by comparative mapping[J]. PLoS One, 2013, 8(8).[13] Daetwyler H D, Capitan A, Pausch H, et al. Whole-genome sequencing of 234 bulls facilitates mapping of monogenic andcomplex traits in cattle[J]. Nature genetics, 2014, 46(8): 858-865.[14] Wu Y, Fan H, Wang Y, et al. Genome-Wide Association Studies Using Haplotypes and Individual SNPs in Simmental Cattle[J]. PLoS One,2014,9(10): e109330.[15] Parker C C, Gopalakrishnan S, Carbonetto P,et al.Genome-wide association study of behavioral, physiological and gene expression traits in outbred CFW mice[J]. Nature Genetics, 2016.[16] Gu X, Feng C, Ma L, et al. Genome-wide association study of body weight in chicken F2 resource population[J]. PLoS One, 2011, 6(7): e21872.[17] Xie L, Luo C, Zhang C, et al. Genome-wide association study identified a narrow chromosome 1 region associated with chicken growth traits[J]. PLoS One, 2012, 7(2): e30910.[18] Liu R, Sun Y, Zhao G, et al. Genome-Wide Association Study Identifies Loci and Candidate Genes for Body Composition and Meat Quality Traits in Beijing-You Chickens[J]. Plos One, 2012, 8(4):-.[19] Evans L M, Slavov G T, Rodgers-Melnick E, et al. Population genomics of Populus trichocarpa identifies signatures of selection and adaptive trait associations[J]. Nature genetics, 2014.[20] Porth I, Klapšte J, Skyba O,et al. Genome‐wide association mapping for wood characteristics in Populus identifiesan array of candidate single nucleotide polymorphisms[J]. New Phytologist,2013, 200(3): 710-726.[21] Van Tyne D, Park D J, Schaffner S F, et al. Identification and functional validation of the novel antimalarial resistance locus PF10_0355 in Plasmodium falciparum[J]. PLoS Genet, 2011, 7(4): e1001383.[22] Ke C, Zhou Z, Qi W, et al. Genome-wide association study of 12 agronomic traits in peach[J]. Nature Communications,2016, 7:13246.[23] Miotto O, Amato R, Ashley E A, et al. Genetic architecture of artemisinin-resistant Plasmodium falciparum[J]. Naturegenetics, 2015, 47(3): 226-234.[24] Spötter A, Gupta P, Nürnberg G, et al. Development of a 44K SNP assay focussing on the analysis of a varroa‐specific defence behaviour in honey bees (Apis mellifera carnica)[J]. Molecular ecology resources, 2012, 12(2): 323-332.重测序业务线靳姣姣丨文案武苾菲丨编辑。
基因组测序及功能解析
基因组测序及功能解析【引言】基因组测序和功能解析是现代遗传学研究中的重要技术和方法之一。
通过对生物体基因组的测序，我们可以获取关于基因组的详细信息，进而了解其组成、结构和功能。
基因组的功能解析则指的是对基因组序列进行解读和理解，以揭示基因之间的相互作用、功能和调控机制。
本文将介绍基因组测序的基本原理和方法，以及基因组功能解析的常见策略和意义。
【基因组测序】基因组测序是指对一个生物体的整个基因组进行测序，即获取其所有基因的DNA序列信息。
其基本原理是利用高通量测序技术将DNA分子断裂、重复复制、测序和组装，最终获得完整而准确的基因组序列。
目前常用的基因组测序技术有两类：Sanger测序和下一代测序。
Sanger测序是早期开发的一种经典测序方法，基于链终止和荧光标记的原理，逐个测定每个碱基的序列。
尽管Sanger测序准确可靠，但其运行周期较长、成本较高，适用于小规模基因组测序。
相比之下，下一代测序技术（如Illumina、454和Ion Torrent等）以其高通量、高效率和低成本的特点成为当前主流。
这些技术通过将DNA分子打断成片段，并在平行的DNA模板合成、扩增和测序过程中，有效提高了测序的速度和准确度。
【基因组功能解析】基因组功能解析是对基因组序列进行解读和研究，以了解基因之间的相互作用、功能和调控机制。
基因组的功能包括编码蛋白质的基因、非编码RNA等。
基因组功能解析的目标之一是鉴定和注释基因组中的基因和功能元件，以帮助我们理解基因组的结构和功能。
基因组注释是确定基因、非编码RNA以及其他功能元件如启动子、转录因子结合位点等的位置和功能。
基因组功能解析的常见策略包括基因预测、同源序列比对、基因表达分析、DNA甲基化分析等。
基因预测是通过计算机算法和生物信息学工具对序列进行比对、搜索和分析，预测出具有编码潜力的DNA序列，即基因。
同源序列比对则是将所研究生物的基因组序列与已知的功能注释良好的生物基因组进行比对，以推断序列的功能和结构。
基因功能分析的基本策略
基因功能分析的重要性
基因功能分析是理解生物学过程和疾病机制的关键，有助于发现新的治疗靶点和发展个性化医疗策略。
通过基因功能分析，可以深入了解基因与表型之间的关系，为遗传性疾病和复杂性疾病的预防、诊断 和治疗提供科学依据。
详细描述：基因变异与药物反应关联分析旨在了解不同基因变异对药物 疗效和副作用的影响。这种分析有助于实现个性化用药，提高治疗效果
并减少副作用。
通过以上三种策略，基因功能分析有助于深入了解基因与疾病的关系， 为疾病的预防、诊断和治疗提供有力支持。
基因功能研究的挑战与展望
基因功能研究的挑 战
技术限制
目前的技术手段在研究基因功能时仍存在局限性，例如难以对所有 基因进行全面研究，难以精确分析基因间的相互作用。
04
数据处理与分析
对收集到的数据进行处理、统计分析 和可视化，挖掘基因功能相关的模式 和规律。
基因表达分析
基因表达的检测方法
基因芯片技术
通过微阵列芯片检测基因 表达谱，可同时检测大量 基因的表达水平。
测序技术
利用高通量测序技术，对 特定组织或细胞中的基因 表达进行全面检测。
荧光定量PCR
通过荧光染料或探针，实 时监测PCR扩增过程中荧 光信号的变化，从而确定 基因表达量。
跨学科合作 基因功能研究需要多学科的交叉合作，包括生物 学、医学、化学、物理学等，以更全面地理解基 因的功能。
个性化医疗 随着基因功能研究的深入，将有助于实现基于个 体基因信息的个性化医疗，提高疾病预防和治疗 效果。
未来研究方向
深入研究基因间的相互作用
未来研究将更深入地探索基因间的相互作用， 以更准确地理解基因的功能。
多基因遗传病基因研究的策略和方法
多基因遗传病基因研究的策略和方法多基因遗传病是由多个基因的遗传变异所致的疾病，其研究策略和方法主要包括以下几个方面：1.基因组关联分析（GWAS）GWAS是一种广泛应用于多基因遗传病研究的方法，它通过对大量样本进行基因组分析，寻找与疾病相关的基因位点。
GWAS可以发现与疾病相关的单核苷酸多态性（SNP），从而确定疾病的遗传风险因子。
GWAS的优点是可以发现新的遗传变异，但其缺点是只能发现单个基因的影响，而无法考虑基因之间的相互作用。
2.基因组学数据整合分析基因组学数据整合分析是将不同来源的基因组学数据整合起来，以发现与疾病相关的基因和通路。
这种方法可以将GWAS、转录组、蛋白质组等多种数据整合起来，从而更全面地了解疾病的遗传机制。
3.基因组学功能研究基因组学功能研究是通过对基因的功能进行研究，以了解其在疾病发生和发展中的作用。
这种方法包括基因敲除、基因表达调控、蛋白质相互作用等实验手段，可以揭示基因在疾病中的作用机制。
4.系统生物学分析系统生物学分析是将基因组学数据与生物学网络相结合，以了解基因之间的相互作用和通路。
这种方法可以揭示疾病的复杂性和多样性，从而为疾病的预防和治疗提供新的思路。
总之，多基因遗传病的研究需要综合运用多种方法和技术，以全面了解疾病的遗传机制和发展规律。
基因功能分析的基本策略课件(共 71张PPT)
RNAi 是真核生物中广泛存在的现象
植物：干扰因素自叶脉向外扩散，绿色荧光蛋白 线虫：左侧为 转基因线虫；右侧线虫则经 (GFP) GFP dsRNA 基因 Hela 细胞：经GFP ORC6 siRNA 作用后，细胞出现多核现象。 果蝇：右侧果蝇为野生型，左侧为 shRNA 造成的色素缺乏的 被抑制，显露出红色。 处理。部分细胞 RNAi 相关蛋白表达较低，仍有绿色荧光。 绿色为 tubulin， 缺陷型。 红色为 DNA。ORC6 细胞分裂调控蛋白。
检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、 LUC。
融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告
基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完 整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。
2. 中游—基因转移、胚胎移植与建系
基本原理
转基因动物
基本过程
上游—基因改造和载体构建
中游—基因转移、胚胎移植与建系 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建
外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构
基因和转录终止信号组成。
报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中引入易于
第十二章
基因功能分析的基本策略
转基因模型是研究基因功能的主要手段
转基因生物： 外源基因导入生物体表达。 基因打靶： 外源基因替换内源基因。 基因敲除。 基因敲入。 基因沉默： 导入特定基因，抑制内源性基因表达。
第一节 转基因技术
转基因技术(transgenic technology)：将外源 基因导入细胞，随机整合到受体基因组内， 并随细胞分裂而遗传给后代。 细胞模型。 转基因动物。 转基因植物。
基因功能分析的基本策略
2、双链干涉RNA的合成； 化学合成法；体外转录法
3、双链干涉RNA对目标RNA的干涉： 首先，将干涉RNA转染到靶细胞； 其次，是对目标RNA干涉程度进行分析：可采用RT-
PCR在RNA水平上监测、Western blot在蛋白质水平上 进行监测
RT-PCR Western blot
后代
受精
植入
全能性细胞
假孕小鼠
转基因动物应用：
1、通过转基因动物来研究特定基因在组织中特异表达或表达 的时相； 2、在活体内研究或发现基因的新功能； 3、可用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能研究； 4、建立研究外源基因表达、调控的动物模型； 5、遗传性疾病的研究； 6、建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据； 7、动物新品种的培育； 8、基因工程产品的制备；
转基因技术存在的问题
1、不能将外源基因定向地插入受精卵细胞染色体的特 定部位； 2、外源基因随机整合可能引起插入突变，破坏宿主基 因组功能； 3、外源基因随机整合在宿主染色体上的拷贝数不同， 可能出现不同表现型； 4、整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的 不稳定遗传。
二、稳定转染细胞
稳定转染细胞是一种最常用的细胞水平的转基因模 型，外源基因通过转基因过程插入到细胞染色体中，使 外源基因可以作为细胞染色体的一部分得以在细胞中稳 定表达。
RNA干涉的机制：
在植物、动物和人的细胞内存在着无活性或低活性的被 称为Dicer的由核酸内切酶和解旋酶等组成的酶复合体。 当细胞内出现异常双链RNA时，如病毒RNA，可以激活 Dicer，被激活的Dicer识别并将其切割成短的双链RNA， 同时生成的短的双链RNA又可以进一步激活Dicer，并 与之结合，形成的复合物称为RNA诱导的沉默复合物。 该复合物通过Dicer中的解旋酶将短的双链RNA变成互 补单链RNA，此单链RNA即可识别并结合到细胞内与其 互补的靶RNA分子上，并通过Dicer中的核酸内切酶将 靶RNA切割，使其失去功能。RNA干涉可以被认为是机 体的一种防御机制。
生物化学及分子生物学(人卫第九版)-26基因诊断与基因治疗
基因诊断与基因治疗
作者 : 李存保 单位 : 内蒙古医科大学
目录
第一节 基因诊断
第二节 基因治疗
重点难点
掌握
基因诊断与基因治疗的概念
熟悉
基因诊断技术、基因治疗的基本策略和基本程序
了解
基因诊断和基因治疗在医学中的应用
第1节
基因诊断
一、基因诊断的概念与特点
（1） 基因诊断的概念：
是指利用分子生物学技术和方法直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而 对疾病作出诊断的方法。
（2）直接体内疗法
临床上可用于基因诊断的样品有血液、组织块、羊水和绒毛、精液、毛发、唾液 和尿液等。
三、基因诊断的基本技术
（一）核酸分子杂交技术
1. Southern 印迹法 其可以区分正常和突变样品的基因型，并可获得基因缺失或插入片段大小等信息。 DNA印迹一般可以显示50 bp～20 kbp的DNA片段，片段大小的信息是该技术诊断基因缺 陷的重要依据。 2. Northern 印迹法 Northern印迹法（Northern blot）能够对组织或细胞的总RNA或mRNA进行定性 或定量分析，及基因表达分析。Northern印迹杂交对样品RNA纯度要求非常高，限制了 该技术在临床诊断中的应用。
是以改变人遗传物质为基础的生物医学治疗，即通过一定方式将人 正常基因或有治疗作用的DNA片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因 的治疗方法。它针对的是疾病的根源，即异常的基因本身。
一、基因治疗的基本策略
（一）缺陷基因精确的原位修复
1.基因矫正 gene correction 致病基因的突变碱基进行纠正 2.基因置换 gene replacement 用正常基因通过重组原位替换致病基因 这两种方法属于对缺陷基因精确的原位修复，既不破坏整个基因组的结构，又可达到治 疗疾病的目的，是最为理想的治疗方法。
基因表达及功能分析基本策略
目录
Western blot基本程序
1. 蛋白质样品的制备 2. SDS-PAGE分离 3. 蛋白质转膜 4. 特异抗体（即第一抗体）与膜上的蛋白质（抗原）印
迹杂交 5. 再经偶联了可检测标记信号的第二抗体（即抗抗体，
商品试剂盒中多采用偶联辣根过氧化物酶的Ig） 6. 最后经与酶的底物反应而显影、成像，经扫描后获取
26
目录
根据蛋白质芯片制作方法和用途不同，可将其分为 1. 蛋白质检测芯片 2. 蛋白质功能芯片两大类
蛋白质检测芯片包括: 1. 抗体芯片 2. 抗原芯片 3. 配体芯片 4. 碳水化合物芯片等
27
目录ห้องสมุดไป่ตู้
2．双向电泳结合质谱普遍用于蛋白质表达 谱的分析和鉴定
目前比较和鉴定蛋白质表达谱更多采用双向聚丙烯酰 胺凝胶电泳结合质谱技术。双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 又称二维电泳（two-dimensional electrophoresis, 简称2-D电 泳）。
➢虽然原位杂交在功能性方面提供的信息较少，但是该 技术还是被广泛用于组织中的基因表达分析，这是因 为其较高的稳定性、较广泛的靶点和组织适用性。
8
目录
（二）两种变换的聚合酶链式反应是常用的 mRNA检测方法
1．反转录PCR
➢ 可用于mRNA的半定量分析
➢ 反转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 是 一种简单、快捷地对RNA进行定性、定量分析的方法。 它是以mRNA为模板，体外扩增cDNA，再以cDNA为模 板进行特定基因转录产物的PCR扩增。RT-PCR技术一般 用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测 RNA样品进行半定量分析。
➢ 运用双重着色或多重着色程序同时对多个感兴趣的靶分子 进行检测，是一种揭示更多有关细胞群的功能和它们之间 相互作用信息的有效方法。
基因分析的基本策略
基因分析的基本策略引言基因分析是生物领域中一项重要的研究工具，通过对基因的分析可以揭示生物的遗传信息、功能以及与疾病相关的遗传变异。
基因分析的基本策略是一系列针对基因组的实验和计算方法，旨在深入理解基因的结构、功能和作用机制。
本文将介绍基因分析的基本策略和常用的分析方法。
1. 基因组测序基因组测序是基因分析的第一步，通过测序技术可以获取基因组的完整序列。
现代基因组测序技术包括传统的链终止法（Sanger测序），以及高通量测序技术，如 Illumina HiSeq、Pacific Biosciences 和Oxford Nanopore Technologies 等。
基因组测序的产出是一系列的DNA片段，通过生物信息学工具进行序列拼接和组装，可以得到完整的基因组序列。
2. 基因注释基因注释是对基因组进行功能和结构的标注，将序列信息翻译成有意义的生物学信息。
基因注释可以分为结构注释和功能注释两个层次。
结构注释结构注释主要用于预测基因的结构和组织结构。
常见的结构注释方法包括基因预测、剪接位点预测和重复序列识别等。
基因预测是确定基因的位置和转录本的起始和终止位点的过程。
剪接位点预测用于确定基因的剪接方式，即基因转录本的选择性剪接。
重复序列识别可以帮助鉴定基因组中的重复序列，例如转座子等。
功能注释功能注释主要通过比对基因组序列和已知功能基因库，将未知基因序列进行功能注释。
常见的功能注释方法包括BLAST、GO富集分析和KEGG通路分析等。
BLAST是一种比对算法，可以通过比对基因组序列和已知序列库，找到相似的序列并推断基因的功能。
GO富集分析是根据基因的注释信息，统计出某一功能术语在基因集中的富集程度，从而推断基因集的功能。
KEGG通路分析则是通过比对基因组序列和KEGG数据库，分析基因在代谢通路中的功能。
3. 基因表达分析基因表达分析是研究基因在不同条件下的表达水平和变化趋势。
通过基因表达分析可以了解基因在发育和疾病等生物过程中的功能和调控机制。
研究植物基因功能的策略和方法_3110
研究植物基因功能的策略和方法研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学（forward genetics）和反向遗传学（reverse genetics）策略。
正向遗传学即通过生物个体或细胞基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关表型或性状改变，然后通过图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能，例如遗传病基因的克隆。
反向遗传学的原理正好相反，人们首先是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再去寻找与之有关的表型变化，例如基因剔除技术或转基因研究。
简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，而反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。
研究植物体内基因功能的方法主要有以下几种：（1）基因功能丧失或减少，即筛选目的基因功能部分丧失或全部丧失的突变体，比较其与野生型的表型差异来确定该基因功能；（2）基因功能增加或获得，即筛选目的基因高水平表达的植株，比较其与相应对照植株（野生型植株，功能丧失突变体或模式植物植株）差异，观察其表型性状变化来鉴定基因功能；（3）基因异位表达（Ectopic expression），通过定向调控靶基因的时空表达模式来研究基因功能；（4）微阵列（Microarray）是一种在全基因组水平对基因表达进行高通量检测的技术；（5）酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid system）用于分析基因产物即蛋白质之间的互作。
1 基因功能丧失或减少以前，通常通过筛选自然突变体来获得基因功能部分或全部丧失的突变体，但概率较低；现在一般通过各种人工方法来获得合适突变体。
人工产生基因功能丧失的方法有插入突变、反义抑制（antisense suppression）、共抑制（cosuppression）、双链RNA干扰（double-stranded RNA interference, dsRNAi）。
多基因遗传病基因研究的策略和方法
多基因遗传病基因研究的策略和方法多基因遗传病是由多个基因的遗传变异引起的疾病。
与单基因遗传病不同，多基因遗传病的研究策略和方法更为复杂，涉及到许多基因的相互作用和环境因素的影响。
下面将介绍一些常用的多基因遗传病基因研究的策略和方法。
1.家系研究：家系研究是通过调查家族中患者和正常人的亲属关系，分析遗传特点和传递规律，确定哪些基因可能与疾病有关。
家系研究需要建立家族数据库，收集每个成员的临床表型和基因型信息。
2.关联研究：关联研究是通过统计分析疾病患者和正常人的基因型频率差异，探索遗传变异与疾病之间的关系。
常用的关联研究方法包括基因关联分析（GWAS）和候选基因研究。
GWAS采用全基因组筛查的方式，分析大规模的单核苷酸多态性（SNP）位点与疾病的关联关系。
候选基因研究则是在基因位点和疾病之间已有先验假设的基础上，选取相关的基因进行深入研究。
3. 功能研究：功能研究是为了确定遗传变异对基因和蛋白质功能的影响，以及这些影响如何导致疾病。
功能研究可以通过in vitro实验、动物模型或人类疾病样本来进行。
常用的功能研究方法包括构建突变体细胞系、表达蛋白质和基因功能鉴定。
4.环境因素的研究：多基因遗传病的发病风险受到遗传变异和环境因素的相互作用影响。
因此，研究环境因素对遗传变异的调控作用十分重要。
该研究策略包括研究环境因素对基因表达的调控、研究环境因素与遗传变异之间的相互作用。
5.罕见出现的突变研究：许多多基因遗传病病因并不明确，因为疾病相关的遗传变异在人群中非常罕见。
通过对少数患者进行突变筛查，并对突变位点进行详细的功能研究，可以发现新的和罕见的基因突变，从而深入研究疾病的机制。
总的来说，多基因遗传病的研究策略和方法涉及到家系研究、关联研究、功能研究、环境因素研究和罕见基因突变研究。
这些方法的综合应用可以帮助科学家更好地了解多基因遗传病的病因和发病机制，为相关疾病的预防、诊断和治疗提供科学依据。
基因功能分析的基本策略
基因功能分析的基本策略一、利用转基因模型研究基因的功能1转基因动物：是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。
2基本原理：将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物园的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。
导入基因的方法有显微注射法、胚胎干细胞法、逆转录病毒感染法、精子载体法。
二、利用基因敲除模型研究基因的功能1基因打靶：是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。
若定向敲除某个基因，称为基因敲除，若定向将一段基因序列替代另一段基因序列，称为基因敲入。
2同源重组：是指发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列之间进行单链或双链片段的交换。
又称基本重组。
3基因敲除：是目前在体内研究基因功能的最佳方法，是指通过DNA同源重组定向的将外源基因插入宿主细胞染色体DNA，从而使特定基因在细胞内或生物或体内失活的过程。
4基因打靶的必备条件：胚胎干细胞（ES）、打靶载体5打靶载体的筛选标志：neo（新霉素）阳性筛选标志；HSV-tk阴性筛选标志。
6基因敲除的基本程序：①打靶载体的构建②打靶载体导入ES细胞③基因敲除ES细胞注射入胚泡④胚泡植入假孕小鼠的子宫中⑤嵌合体的杂交育种7构建打靶载体的基本过程①获得目的基因的同源片段，将此DNA片段克隆到一般的质粒载体中；②从重组质粒中切除目的基因的大部分同源DNA序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端；③将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源顺序的中间；④在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体，将HSV-tk基因克隆到此线性载体中。
三、通过抑制或沉默基因表达对基因的功能进行分析研究1利用反义RNA抑制基因表达水平2利用RNAi技术在细胞中沉默特定基因已研究其功能1。
家猪主效基因的经典鉴别策略
目前，猪数量性状主效基因鉴别的经典策略是：（1）先通过全基因组连锁分析将影响性状变异的QTL定位在染色体上一个较大的目标区域内(10-30cM)；（2）再通过增加标记密度和群体重组事件发生的频率等方法精细定位QTL区间，将目标区间缩至最小范围（1-5cM）以下；（3）最后结合区域内各候选基因的生理生化功能进行候选基因的挑选和验证。
家猪大部分性状如生长速度、繁殖性能，耳面积等属于数量性状，受到大量具有微小效应的基因和环境的共同作用，且对环境影响敏感。
Gelderman等（1975）将基因组上的一段含有一个或多个影响数量性状的基因的片段定义为数量性状座位（QTL）。
目前，QTL定位主要通过遗传标记与QTL的连锁分析来实现。
其主要过程是：（1）先根据所定位QTL的性质构建合适的研究群体，并详细记录待测数量性状表型值，（2）再选择覆盖全基因组，分布较均匀的分子标记对各世代群体的标记基因型进行检测，（3）最后利用遗传标记与QTL 的连锁关系，通过标记的基因型来推测QTL的基因型。
通过比较不同QTL基因型的表型之间是否存在差异显著，来推断QTL存在与否，并估计QTL在染色体上的相对位置及效应大小。
QTL定位的统计分析方法主要有回归分析、方差分析和最大似然法等，常用的数据分析软件有QTLExpress和MultiQTL。
1.4.1.2 QTL精细定位连锁分析是一种利用当前研究群体标记与QTL之间的连锁不平衡信息(Linkage Disequilibrium，LD)来定位QTL的方法，然而由于受群体规模大小和代数限制，群体内发生的重组事件很有限，导致标记与QTL之间的LD很大，全基因组只需要覆盖100-300个标记便能检测到QTL的有无。
然而，较低的标记密度和较大的LD会导致QTL定位的置信区间常常大于10厘摩尔（cent Morgan，cM），这样大的区域可能含有上百个基因存在，很难揭示出影响相关性状位点的QTG。
基因测序技术的操作方法与分析策略
基因测序技术的操作方法与分析策略基因测序技术的快速发展使得人们能够更深入地了解生物体内基因的组成和功能。
它不仅在医学诊断和治疗上起到了重要作用，还在农业育种和环境保护等领域有广泛应用。
本文将介绍基因测序技术的操作方法和分析策略，旨在帮助读者更好地理解和使用这一技术。
一、基因测序技术的操作方法基因测序技术可以分为传统的Sanger测序和高通量测序两种方法。
传统的Sanger测序主要依靠荧光原位杂交技术进行，而高通量测序则采用了二代测序和第三代测序技术。
1. 传统的Sanger测序方法在传统的Sanger测序方法中，DNA片段首先被引物引导合成，形成不同长度的DDN基因片段。
然后，这些片段通过凝胶电泳分离，并使用荧光探针对其进行检测。
最后，测序结果会通过电泳图进行分析和解读。
2. 高通量测序方法高通量测序方法通过平行测序大量不同的DNA片段，从而实现了对整个基因组的测序。
目前常用的高通量测序技术主要包括Illumina测序、Ion Torrent测序、PacBio测序和Nanopore测序等。
Illumina测序是目前应用最广泛的高通量测序技术之一。
该技术通过将DNA片段连接到测序芯片上的特定位置，并进行多轮的合成和测序，最终得到高质量的测序结果。
Ion Torrent测序则是利用DNA链延伸的过程中产生的氢离子释放来进行测序。
这种方法速度快、成本低，并且适用于小规模测序项目。
PacBio测序利用了DNA链扩增和电泳分离的技术，可以获得较长的读取长度，并用于研究基因组的结构和变异。
然而，其测序错误率相对较高。
Nanopore测序技术则是通过将DNA片段通过纳米孔进行测序，通过对电流的变化进行分析和解读，进而得到基因序列信息。
这种方法具有实时性、易于操作等优点。
二、基因测序技术的分析策略基因测序技术的快速发展不仅使我们能够快速获取基因组信息，还需要相应的分析策略来对这些数据进行解读。
1. 数据质量控制在基因测序过程中，数据的质量控制非常重要。
简述基因治疗的基本策略
简述基因治疗的基本策略
基因治疗是一种新型的治疗方法，通过改变患者体内的基因表达来治疗疾病。
基因治疗的基本策略可以概括为以下几个步骤：
1. 基因传递：将治疗相关的基因传递到患者体内。
这可以通过多种方式实现，包括使用病毒载体、质粒DNA、纳米粒子等方法。
传递的基因可以是正常的修复基因、抑制异常基因的RNA或DNA等。
2. 基因表达：传递到患者体内的基因需要能够被细胞识别并表达。
为此，需要使用适当的信号序列或启动子来确保基因在目标细胞中得到表达。
这些信号序列可以使基因在细胞核内被转录和翻译成蛋白质。
3. 治疗效应：基因治疗的目标是通过改变基因表达来修复或治疗疾病。
这可以通过多种方式实现，例如增加缺失的基因表达、抑制异常基因的表达、引入新的功能基因等。
治疗效应的具体机制取决于所治疗疾病的类型和基因治疗的设计。
4. 监测和调整：基因治疗后需要对患者进行监测，以评估治疗效果和安全性。
这可以通过检测基因表达水平、蛋白质表达水平、病理学评估等方法来实现。
根据监测结果，可以对治疗方案进行调整，以优化治疗效果。
总的来说，基因治疗的基本策略是将治疗相关的基因传递到患者体内，使其在目标细胞中得到表达，并通过改变基
因表达来治疗疾病。
这一策略需要综合考虑基因传递、基因表达、治疗效应和监测调整等方面的问题，以实现有效的治疗效果。
高中生物基因工程专题教学的完善策略分析
高中生物基因工程专题教学的完善策略分析一、教学现状与问题分析目前，高中生物基因工程专题教学面临着以下几个主要问题：1.知识晦涩难懂：基因工程领域涉及的专业术语、概念和原理较为复杂，不易为学生所掌握。
基因克隆、DNA重组、转基因技术等概念对于普通高中生来说是一种抽象和陌生的存在。
2.缺乏实践机会：基因工程是一个需要实际操作的领域，但由于实验设备昂贵、实验材料稀少等原因，学校很难为学生提供充分的实验机会，学生们对于基因工程技术的实际操作和应用了解不足。
3.关注度不高：尽管基因工程在当今社会已经得到了广泛的应用和重视，但学生们对于这一领域的关注度并不高。
一方面，学生们对于基因工程的认识还停留在表面，没有深入了解其实质和意义；学生们对于基因工程中的伦理道德问题和社会影响的认识程度不够。
以上问题的存在，直接影响了高中生物基因工程专题教学的深入和有效进行。
需要从教学内容、教学方法和教学手段等多方面进行完善和提高。
二、学生兴趣引导策略学生的兴趣是教学成功的关键，而基因工程这一知识领域的前沿性和实用性本身就具有较大的吸引力。
教师在进行基因工程专题教学时，可以采取一些策略来引导学生的兴趣，例如：1.引入生动实例：可以在教学中引入一些生动的基因工程实例，如转基因作物的应用、基因编辑技术治疗遗传病等。
这些具体的例子能够引起学生的浓厚兴趣，增强他们对基因工程的认识和理解。
2.开展课外学习活动：可以鼓励学生利用课余时间，通过阅读相关书籍、参加科普讲座、观看纪录片等方式，深入了解基因工程的最新发展和应用，从而提高对这一领域的兴趣和追求。
3.与社会热点结合：可以将基因工程的相关知识与当下社会热点结合起来，例如通过分析转基因食品争议、基因检测技术的伦理道德问题等，引导学生对基因工程领域的关注和思考。
通过上述策略的应用，可以有效提高学生对基因工程专题的兴趣和关注度，从而为教学打下良好的基础。
三、教学内容设计策略基因工程是一个包罗万象的复杂领域，其内容涵盖了基因克隆、转基因技术、基因编辑技术、CRISPR-Cas9等多个方面。
基因分离的策略
基因分离的策略一、概念基因克隆是指通过分子生物学手段进行基因分离，从而进一步研究其结构功能。
分子克隆是指在体外对不同生物的DNA分子进行人工剪切，重新组合得到新的遗传物质通过载体转入到宿主菌或细胞中表达，扩增带目的基因的重组DNA。
基因克隆的目的是分离基因，分子克隆是分离基因的最终手段。
基因的分离是基因工程研究中最主要的要素，目的基因的成功分离是基因工程操作的关键。
由于每种基因，特别是单拷贝基因占整个生物基因组的很小部分，且DNA的化学结构相似，都是由A、T、C、G四种碱基组成，具有极相似的理化性质，这给分离特定的目的基因带来很大困难。
二、基因克隆的总体策略1、功能克隆法：依赖于基因表达产物及其生物功能进行基因克隆。
①通过分析蛋白质中氨基酸顺序合成寡核苷酸探针从cDNA文库中分离cDNA克隆②通过制备基因产物单抗来进行cDNA片段分离③通过构建cDNA的表达文库，利用基因产物的功能来筛选基因2、定位克隆法：在事先不知道基因的相关功能信息的条件下，通过遗传连锁或细胞学定位技术将基因定位于染色体某一区段，再通过该区域的精细物理图或表达图分析、寻找候选基因并进行突变分析从而确定疾病的相关基因。
CpG岛筛选法、NotI连锁片段筛选法、外显子捕捉法和外显子扩增法、剪切位点筛选法、启动子捕捉法、polyA捕捉法、显微切割微克隆法、候选基因法。
3、消减杂交：将不同来源的基因组DNA或mRNA进行杂交，两者之间相同的核酸片段互补，或通过随机引物进行差别显示PCR扩增不同来源的cDNA，比较其中的mRNA表达差异，从而将两种之间的差异mRNA被筛选出来。
该法有两种思路：①采用杂交的方法：消减文库、代表性差异显示、比较基因组错配筛选② mRNA差别显示，采用PCR扩增，比较其mRNA的表达差异。
4、动物园杂交：利用一些基因在进化中高度保守的特点，在同种或不同种生物的基因组中有许多高度同源的基因，或具有共同的结构，因而可以利用已经有的基因与基因组文库或cDNA文库杂交，来调取高度同源、或结构相似、功能相似的基因。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
•Southern blot步骤
•（1）待测核酸样品的制备：提取基因组DNA，并用 适当的限制性内切酶消化水解基因组DNA，成大小不 一的DNA片段。 •（2）待测DNA样品的电泳分离。 •（3）凝胶中核酸的变性：DNA在制备与电泳过程中 DNA片段始终保持双链结构。电泳结束后DNA变性并 转移到适当的固定支持物上才能进行Southern blot。 •变性通常用碱变性法。
将差别表达条带中的DNA回收，扩增至所需含量，进行 Southernblot或Northernblot或直接测序，从而对差异条带鉴定分析， 以便最终获得差异表达的目的基因。
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
尽管应用 差异显示PCR方法已经取得了不少成果 ，而且该方法还在不断改进之中，但它仍然存在几个 难以解决的问题：但它仍然存在几个难以解决的问题 ：(1)重复率低，至少有20%的差异条带不能被准确重 复；(2)假阳性率可以高达90%；(3)获得的差异表达序 列极少包含编码信息。
•G
•5`* GATCACTACTG •5`*G
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
•G+A •甲酸 •C+T •肼
•5`*GATCACTACTG
•5`*GATCACTACT •5`*GATCACTAC
•5`*GATCACTA •5`*GATCA •5`*GA •5`*G
•5`*GATCACT •5`*GATCAC •5`*GATC •5`*GAT
•G+A
甲酸
脱嘌呤作用 六氢吡啶 G/A
•C+T
肼
嘧啶开环 六氢吡啶 C/T
•C
肼（加盐） 胞嘧啶开环 六氢吡啶 C
•在化学修饰反应中，通过控制反应温度和反应时间，只有 一小部分碱基被修饰，随后进行断裂反应也是定量。
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
•5`-GATCACTACTG-3`
•硫酸二甲酯
•5`*•-GATCACTACTG-3`
路漫漫其修远, 吾将上下而求索
（6） Southern杂交：在将固定于膜上的DNA片段与探 针进行杂交前，必须先进行一个预杂交的过程。因为 能够结合DNA的膜同样可以和探针DNA结合，在进行 杂交实验前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全 部封闭。
（7）杂交结果的检测：采用核素标记的探针或发光剂标 记的探针进行杂交时，在杂交洗膜后，将滤膜和X线片 装入暗盒，感光后，经冲洗，在X线片上可见黑色条带 。
•
2、化学裂解法
•
3、PCR测序技术
•
4、全自动DNA测序仪
•这些技术的发明,都依赖于高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
•双脱氧测序方法原理
Sanger双脱氧链终止法引入了双脱氧核苷三磷酸（ 2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂。2ˊ,3ˊ-ddNTP脱氧核 糖的3ˊ位缺少羟基，它可以与多核苷酸链的3ˊ羟基形 成磷酸二酯键，但却不能与下一个核苷酸缩合，导致多 核苷酸链的延伸终止。 如果在DNA的合成反应中，加入一种少量的ddNTP，则多 核苷酸链的延伸将在随机的位点终止，生成一系列长短 不一的核苷酸链。在4组独立的DNA合成反应中，分别加 入4种不同的ddNTP，结果生成的4组核苷酸链将分别终止 于各个A，G，C，T的位置上。对这4组核苷酸链进行高分 辨变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。
原位杂交不需要从组织提取核酸，对组织中含量 极低的靶序列有很高的灵敏度，并可完整保持组织与 细胞形态，更能准确反映出组织细胞的相互关系及功 能状态。
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
根据检测对象不同可将原位杂交分为细胞内原位 杂交和组织切片原位杂交。同时原位杂交既可检测 DNA，也可检测RNA，所用探针不同而以。
4、通过具有可分辨链长短仅一个核苷酸之差的聚丙烯胺 凝胶电泳，将DNA断裂片段按分子大小分离开
5、根据放射自显影胶片上显示的末端标记片段分布情况 ，直接读出DNA序列。
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
•反应体系 碱基修饰
•
试剂
•
•G
硫酸二甲酯
碱基修饰 反应
鸟嘌呤甲基化
主链断裂 试剂
六氢吡啶
断裂点 G
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
•化学裂解法（Maxam-Gilbert）
•
1977
基本步骤：
1、先将DNA的末端之一标记放射性同位素（32P、35S），
2、再将DNA样品分别进行多组具碱基特异性、随机的、 不完全的化学修饰；
3、采用修饰碱基敏感的特异化学试剂在修饰碱基位置断 开DNA链；
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
实时PCR原理是：在PCR反应体系中加入一种双色 荧光标记的寡核苷酸探针，并根据探针上荧光信号的 变化计算模板DNA含量。如：TaqMan系统
在寡核苷酸探针的5`端标记一个报告荧光染料， 3`端标记一个猝灭染料。当光源照射到探针时，被激 活的报告荧光染料将能量转移给附近的猝灭染料而不 发光。当PCR产物扩增时，聚合酶遇到结合在模板上的 荧光探针时，利用聚合酶所具有的5`-3`外切酶作用， 将两种染料分离，因此根据报告荧光所发射的荧光强 度与被切探针成正比，由此可以计算出PCR产物的含量 。
•5`* GATCACTACTG
•5`*GATCACTACT
•5`*GATCACTAC •5`*GATCACTA
•5`*GATCACT
•5`*GATCAC •5`*GATCA
•5`*GATC •5`*GAT
•5`*GA •5`*G
•C•肼（加盐）
•5`*GATCACTAC •5`*GATCAC •5`*GATC
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
•（3）实时PCR用于基因拷贝数分析
实时PCR根据PCR反应动力学特点设计的分析方法 。在PCR反应的初始阶段，反应体系中的模板的产物深 度较低，而引物是过量的，产物和模板复性不会形成 与引物竞争，此时产物含量呈指数增加。当PCR产物积 累后，产物的复性可以竞争引物与模板的结合，产物 增加减慢，最后进入平台期。所以对样品中的cDNA进 行定量分析的最佳时期是反应早期。有人试图依靠循 环次数减少来分析样品中的cDNA含量，但因样品的差 异使之很不可靠。在一定的循环中，mRNA丰度低的样 品产量少，可能尚不能检测，丰度高的样品可能已进 入平台期，故难以较。
实时PCR技术 5、研究基因表达产物的水平：Western Blot、
流式细胞仪（ FACS ）
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
•第一节 利用DNA定性、定量分析可从不同角
度
•
对基因和基因组进行研究
•一、DNA序列测定可以揭示基因和基因组一级结构变化
•DNA测序技术：
•
1、双脱氧链终止法(Sanger法)
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
•（2）、代表性差异分析技术
•该技术是将差减杂交与PCR有机结合形成的一种方法.主要步 骤: •1、将对照组(driver)和待测组(tester)mRNA逆转录成cDNA 片段群,接上接头进行第一次PCR扩增; •2、将两组PCR产物片段群用限制性内切酶酶切,形成平均长 度256bp的长度. •3、将接头消化,在tester组末端接上新的接头,tester组和 driver组按1:100比例混合.过量的driver可与tester中互补 的部分形成双链. •4\复性,按新接头序列设计引物进行第2轮PCR，只有tester 和tester杂合体才能和引物配对,大量拉增.
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
•Southern blot 检测基因拷贝数注意事项
1、对某种生物体基因组拷贝数研究，需要 完整提取出基因组，并需要适当的限制 性内切酶酶切；
2、通常要研究的基因序列是已知的。
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
•二、采用PCR技术也可以分析基因拷贝数
•原理： •细胞内DNA复制是一个复杂过程。参与复制的有多种因 素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，PCR原理与细 胞内DNA复制相似，但反应体系相对简单。 •PCR反应体系： •耐热的Taq DNA聚合酶、化学合成的寡聚核苷酸引物、4 种dNTP、以及合适的缓冲液体系。 •PCR反应的基本过程：变性、退火、延伸
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
•（1）差异显示PCR用于基因拷贝数分析
是根据绝大多数真核细胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾（polyA） 结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转 录成cDNA。
根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设 计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物；同时为扩增出polyA上游 500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随 机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA 条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定 发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
实时PCR技术特别适合于低拷贝基因的定 量。
实时PCR需要包括热循环仪、计算机、光 学仪器用于荧光激发和收集器、数据处 理和分析软件。
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
•三、原位杂交技术可以分析基因在染色体上位置
核酸保持在细胞或组织切片中，经适当方法处理细 胞或组织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核 酸进行杂交，称为原位杂交。
•DNA自动测序仪
•上述两种方法都不适应大规模DNA测定需要。存在操作 步骤繁琐、效率低、速度慢的缺点，特别是读结果的读 片过程。 •1987年发明了一种准确快速的DNA测序方法，即激光 测序法和配套的自动测序仪。（用荧光染料结合引物） 。随后又发明了终止标记系统法。