血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量 实验报告

生物化学实验报告

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生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量

实验日期实验地点

合作者指导老师

评分教师签名批改日期

一、实验目得

1、１、学习醋酸纤维薄膜电泳得基本原理与操作方法；

1、2、了解电泳技术得一般原理；

１、3、掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量得方法。

二、实验原理

2、1、血清中各种蛋白质得等电点不同，一般都低于pＨ７、4。它们在pH8、6得缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动.由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带得电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳得速度也不同。因此可以将它们分离

为清蛋白(Ａlbumin）、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β－球蛋白、γ-球蛋白5条区带.

2、2、血清中不同蛋白质得等电点、分子量及含量

血清蛋白质等电点分子量占总蛋白

得%

清蛋白4、64６9，0０0

57~72

α1－球蛋白5、０6 2００，0０0

2～５

α2—球蛋白 5、06 3０0,000 4～9

β－球蛋白 5、12 ９0，000～１5０，０00 6、5～１２

γ—球蛋白 6、８5～7、３ 1５６,000~950，000 12~2０

缓冲液ｐH=8、6，ｐI＜pH.

血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动。

预测血清蛋白电泳区带图

血清蛋白依次分为清蛋白，球蛋白得α１、α2、β、γ五个区带

2、3、①膜条经过氨基黑1０B染色后显出清晰色带;②各色带蛋白质含量与染料结

合量基本成正比；③可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中；④用分光光度法计算各种

蛋白质得百分数。

三、材料与方法：

3、1、实验材料：

3、1、1、实验试剂：①样品:健康人血清（新鲜、无溶血);②巴比妥—巴比妥钠缓冲液（pH8、６,离子强度０、０6mol/L）;③氨基黑１0Ｂ染色液;④漂洗液;⑤洗脱液：0、4mol/NaOH溶液。

３、１、2、实验器材：①Ｖ－１100分光光度计(×1）；②恒温水浴箱(×１）;

③试管(×6)、试管架(×1）；④1000μL加样枪(×1)、加样枪架(×1);⑤醋酸纤维薄膜（2cm*8ｃm,厚度１20μm）；⑥培养皿(×5)；⑦点样器或载玻片(×１）；⑧平头镊子(×2）;⑨剪刀（×1）;⑩电泳槽（×１)；⑪直流稳压电泳仪（×１)

3、2、实验步骤

３、染色、漂洗：①通电完毕；②取出膜条；③浸于染色液(氨基黑10Ｂ）中，5ｍiｎ;④取出膜条，浸于漂洗液；⑤反复漂洗2次,直至漂净；⑥滤纸吸干薄膜。

4、定量(洗脱比色法）(因实验室等原因，未做)

图一染色后得膜条

４、1、结果分析

本次实验得到得图谱只能够清晰得瞧出清蛋白与γ—球蛋白得区带,其余无法区别。原因可能如下:

①醋酸纤维薄膜质量不足

②薄膜过湿，样品扩散迅速,导致样品分离不成区带.

③点样太少,区带显色不明显.

④电泳时间不足.

⑤薄膜在缓冲液中浸泡得时间不足。

⑤取出电泳后得薄膜过程中曾不慎将薄膜掉到地上。

⑥染色时，因为现场混乱，可能导致醋酸纤维薄膜不就是一张一张放入染色液得，在染色固定前,薄膜与薄膜之间重叠,造成薄膜上还未固定得血清蛋白彼此粘连.

４、２、课后思考题

1.电泳时,点样端置于电场得正极还就是负极？为什么？

答：点样端置于电场得负极。因为人体血清得蛋白质会因电槽中溶质呈碱性而带负电，要成功分离出各类各类蛋白质,理应将点样端置于电场得负极.

2.电泳后各区带应明显分开,如分离不清或不整齐,试分析其可能存在得原因.

答:①醋酸纤维薄膜质量不足;②薄膜过湿，样品扩散迅速，导致样品分离不成区带;③点样太少,区带显色不明显；④染色时，醋酸纤维薄膜不就是一张一张放入染色液得,在染色固定前，薄膜与薄膜之间重叠,造成薄膜上还未固定得血清蛋白彼此粘连。⑤电泳时电压,电流或电泳过小或时间不够,造成区带未分离。