分子生物学

分子标志物：指可以反映机体生理、病理状态的核酸、蛋白质（多肽）、代谢产物等生物分子。

DNA结构：DNA的二级结构是双螺旋结构：DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多核苷酸链组成，两链以-脱氧核糖-磷酸-为骨架，以右手螺旋方式绕同一公共轴盘。

螺旋直径为2nm，形成大沟(major groove) 及小沟(minor groove)相间。

碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对（互补配对形式：A=T;G=C）。

相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。

DNA的三级结构是超螺旋结构：DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。

正超螺旋(positive super coil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同负超螺旋(negative super coil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反。

原核生物DNA的是环状超螺旋结构核小体(nucleosome)是染色质的基本组成单位，由DNA和蛋白质构成。

组蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4 RNA结构：一级结构：核苷酸连接方式同DNA。

RNA的一级结构即指核苷酸的连接方式、数量和排列方式。

主要结构特征：①含有稀有碱基（修饰碱基）；②不遵守Char gaff原则；③多数为单链分子，形成链内双链二级结构（发夹结构）；④碱基配对：A-U，G-C。

t RNA二级结构：DHU环反密码环额外环 TΨC环氨基酸臂t RNA的三级结构是倒L型t RNA的功能：活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。

m RNA的结构与功能:1）基本特点：含量低（约占总RNA的1%～5%）；种类多（上万种）；分子大小差异大（几百～约2万个核苷酸）；半衰期短。

2）结构特点：编码区——决定蛋白质的一级结构，包括起始密码子、终止密码子、外显子。

非编码区——与蛋白质生物合成的调控有关，包括5′非编码区（帽结构、核蛋白体识别结合位点等）、3′非编码区（多聚腺苷酸尾）、间隔序列（内含子）。

大多数真核m RNA 的5´末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C´2甲基化，形成帽子结构m7GpppN-。

大多数真核m RNA的3´末端有一个多聚腺苷酸(poly A)结构，称为多聚A尾3）功能：作为蛋白质合成的模板。

帽子结构和多聚A尾的功能：m RNA核内向胞质的转位、m RNA的稳定性维系、翻译起始的调控增色效应：核酸分子在变性过程中，其溶液的A260会增大，此现象称为增色效应。

融解温度（Tm）：DNA分子热变性程度达到50%时所对应的温度，称为融解温度或解链温度。

Tm的影响因素：①DNA分子的碱基组成Tm与DNA分子碱基组成的关系 AT富集区先解链，GC富集区后解链。

②溶液的离子强度一般情况下，在低离子强度溶液中，DNA的Tm较低，且解链温度范围较宽；在高离子强度溶液中，Tm较高，解链温度范围较窄。

③ pH 一般情况下，核酸溶液的pH在5~9范围内，DNA的Tm变化不明显；当溶液的pH<4或>11时，DNA的Tm会降低。

④变性剂 变性剂可降低DNA 的Tm分子杂交：核酸分子杂交是指来源不同的具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。

分子杂交分类：1.液相杂交：是指待测核酸和探针都存在于杂交液中，探针与待测核酸在液体环境中按照碱基互补配对形成杂交分子的过程。

2.固相杂交：①反向点杂交：（RDB ）：特点：高灵敏度、高特异性和准确性好等。

应用：用于病原体检测，基因分型检测，基因突变检测等②Southern 印迹：用于DNA 的检测，不但能检测出特异的DNA 片段，还能进行定位和测定分子量，可用于基因的限制性内切酶图谱分析、基因突变分析等。

③Northern 印迹:杂交用于RNA 的检测，能对组织细胞中总RNA 或mRNA 进行定性和定量分析3.原位杂交：是细胞学技术与核酸杂交结合的一种核酸分析检测技术。

用标记核酸探针与细胞涂片、压片、细胞悬液滴片或组织切片上具有互补序列的单链DNA 或RNA 进行杂交，然后通过放射自显影或酶底物显色或激发荧光等方法检测待测核酸分子。

4.DNA 芯片技术：特点：高通量、微型化、自动化。

技术基础是核酸分子杂交技术 探针技术：1.探针的种类：①DNA 探针（最常用，一般长度为400--500个碱基）：单链cDNA 是与mRNA 互补的DNA 分子。

② RNA 探针 （长度实际上取决于将重组DNA 分子线性化的限制性内切酶的酶切位点）③寡核酸探针（一般由17--50个核苷酸组成）：易于大批量生产和标记。

最大优势是可以区分仅仅一个碱基序列的靶序列，最大的缺陷是寡核苷酸不如长的杂化核酸稳定，需优化杂交和洗脱条件以保证寡核苷酸杂交的特异性。

2.标记物：①放射性标记物：H S P 33532、、②非放射性标记物：生物素、地高辛或荧光素标记。

3.探针标记方法的选择：①随机引物的标记：最常用的DNA 探针标记，在标记dNTP 存在的条件下，DNA 聚合酶Ⅰ的Klenow 片段催化引物延伸产生标记产物。

②DNA 缺口平移标记：DNase Ⅰ和大肠埃希菌DNA 聚合酶Ⅰ的协同作用，只标记一种dNTP 。

③化学法全程标记：I 125标记法、光敏生物素标记法。

影响杂交速率和杂化分子稳定性的因素：①探针的选择。

②探针的标记方法。

③探针的浓度，探针用量均为0.5--5.0μg/ml 。

④杂交率。

⑤杂交温度（随着逼近Tm 值杂交速率降低，最佳选择低于探针Tm 值20-25℃）。

⑥杂交的严谨性。

核酸酶：水解核苷酸之间的磷酸二酯键。

限制性核酸内切酶及其识别位点特征: 具有回文序列结构。

基因组（genome ）：泛指一个细胞或病毒的全部遗传信息。

真核生物基因组：指一套完整单倍DNA （染色体DNA ）的全部序列，既包括编码序列，也包括大量存在的非编码序列。

原核生物基因组结构特征：其结构比较简单，通常由环状双链DNA 分子组成，具有操纵子结构，基因密度高，编码序列比例大，含有编码同工酶的同基因，不同元和生物基因组中的GC 含量变化大。

其非编码区域主要是一些调控序列，细菌的基因组可产生转座现象，还含有可以自主复制的质粒DNA。

操纵子（operon）：原核生物的绝大多数结构基因按功能相关性成簇地排列于染色体上，连同其上游的调控区（包括启动子和操作元件）以及下游的转录终止信号共同组成一个基因表达单位。

质粒：是细菌细胞内携带的染色体外的DNA分子，是共价闭合的环状DNA分子，能独立进行复制。

质粒只有在宿主细胞内才能够完成自己的复制。

可具有兼容性或不兼容性，可发生构象变化，出现超螺旋、半开环、线状三种构象。

质粒的生物学特性：可移动性；自我复制；携带筛选标记；不相容性R型质粒（抗药性质粒）：生物学特性：可移动性，自我复制能力，携带筛选标记，不可相容性。

真核生物基因组结构特征：真核基因组一般比较庞大，结构基因所占的比例小，编码序列就更少，且存在大量重复序列。

由染色体DNA和染色体外DNA组成，非编码序列多于编码序列，具有多基因家族和假基因转座因子类别及其遗传效应：类别：插入序列、转座子、Mu噬菌体。

遗传效应：①转座因子的转座不是本身的移动，而是由转座因子复制出一个新拷贝转移到基因组中的新位置上去。

②新的转座因子转到靶点后，靶点序列会倍增成为两个靶点序列，并分别排列在转座因子的两侧，形成同向重复序列。

③在转座过程中能够形成共合体。

④转座因子转座后能促使染色体畸变。

⑤转座因子可以从原来位置上切除，这个过程称为切离。

⑥转座可引起插入突变。

⑦带有标志基因，给受体基因组增添了新的基因。

真核生物基因组重复序列：高达总DNA量的50％。

分为1）串联重复序列：高重复序列DNA，重复次数可高达数百万次。

有卫星DNA和反向重复序列。

卫星DNA又分为大卫星DNA、小卫星DNA和微卫星DNA。

2）散在重复序列：中重复序列DNA：散在分布于基因组中，约占基因组DNA总量的35％，常与单拷贝基因间隔排列，有一段结构基因：HLA、rRNA、组蛋白、免疫球蛋白。

多态性：当某种变异相对常见，在群体中的频率高于1％时，则称为多态性。

主要包括：限制性片段长度多态性（RELP），可通过Southern杂交等分析。

小卫星和微卫星多态性（短串联重复序列多态性），通常通过PCR扩增，扩增产物通过电泳分析检测。

单核苷酸多态性（SNP）可通过点杂交、PCR--RFLP、荧光定量PCR、DHPLC以及基因测序、基因芯片分析等分析。

拷贝数多态性（CNP），可通过荧光原位杂交、芯片比较基因组杂交和SNP芯片检测分析。

突变：DNA序列的改变或重排，可分为：①染色体数目的改变（基因组突变）；②染色体机构的改变（染色体突变）；③涉及单个基因的突变，也是通常所讲的基因突变：点突变、插入缺失和动态突变几种类型。

人类基因组计划的内容遗传图谱、物理图谱、序列图谱、转录图谱DNA聚合酶的作用1、5′→3′聚合酶活性与延伸能力活性与校对功能（保真性）2、5′→3′外切酶3、5′→3′外切酶活性与切口平移端粒1、端粒的结构特点1）、GT链的5′→3′总是指向染色体的末端。

2）、重复次数不保守。

3）、链区内有缺口即游离的3′-端羟基存在。

4）、DNA的最末端不能进行末端标记，推测其分子是一个回折结构。

2、端粒酶端粒酶的概念（telomerase）反转录酶，由蛋白质和RNA共同组成，含有引物特异的识别位点，能以自身的RNA为模板反复延伸端粒的重复序列。

3、端粒的功能1）保护染色体末端：使染色体末端免于被化学修饰或被核酶降解；防止端粒酶对端粒进行进一步延伸的作用。

2）防止染色体复制时末端丢失3）决定细胞的寿命：端粒的长度决定了细胞的寿命，故而被称为“生命的时钟”。

4）固定染色体位置：人类端粒DNA和核基质中的蛋白相互作用，以′TTAGGG′结构附着于细胞核基质与转录有关的DNA结构1、启动子：是指DNA分子中能被RNA聚合酶特异的识别、结合并开始转录的一段DNA 序列。

1）、原核生物启动子：起始点、结合部位（Pribnow盒）、识别部位（Sextama盒）2）、真核生物启动子结构：帽子位点：CAT规律TATA盒： -25～ -30bp,作用：控制转录起始点的选择上游启动子元件:包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等, 作用：控制转录起始频率。

CAAT：-70 ～ -80bpGGGCGG：-80 ～ -110bp2、增强子：远上游序列，一般在－100bp以上。

核心序列为TGGAAG。

作用：增强启动子转录活性的DNA序列。

特点：增强效应与位置与取向无关；组织与细胞特异性。

3、终止子：细菌DNA中有两类：1）强终止子－内部终止子；2）弱终止子－需要ρ因子，又称为ρ依赖性终止子。