新生牛血清病毒检测细胞培养法
细胞培养与病毒培养实验步骤
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中得培养一. 实验目得了解倒置显微镜得构造与使用，了解不同传代细胞得形态及接毒后得病变特 征,掌握细胞得传代培养方法、病毒接利方法及收毒方法。
二、常用细胞得种类BHK-21:仓鼠肾传代细胞PK-15：猪肾传代细胞IBRS-2:猪肾传代细胞Hela ：人得子宫瘤细胞Ver 。
：非洲绿猴肾细胞Marc-145:来源于Vero 细胞TK-143:人得胸昔激酶阴性细胞Sf9：昆虫细胞三、材料1、lOOml 细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头BHK-21 (baby hamster kidney)细胞生长液:含10%犊牛血清、200U/inl 青、链霉素得DMEM 2、 3、 0、25%胰酶4、维持液:含2-5%犊牛血清、200U/inl青、链霉素得DMEM5、伪狂犬病病毒液(PRV)四.传代细胞培养得条件要求1)细胞密度:2-3X105个/ml2)pH 范围最适 pH7、0-7、4,耐受 pH6、6-7、83)培养温度哺乳动物细胞一般为37°C昆虫细胞28-3(rC五、常用细胞分散剂与作用原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸得竣基与其她氨基酸得氨基之间得多肽链发生水解, 导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散得单个细胞。
2、乙二胺四乙酸二钠(EDTA):与二价钙、镁离子结合■从而使细胞分散。
3、灰色链丝菌酶川I灰色链丝菌提取得一种酶制剂,就是蛋口酶、氨肽酶与竣肽酶得混合物。
六、营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嚓吟、陀唏、辅助生长因子。
2、血清1)血清得种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。
2)血清得处理无菌采集■过滤除菌。
用前56°C灭活SOmino 3）血清得作用A、能提供细胞生存.生长与增生所必须得生长调节因子。
B、能补充基础培养液中没有或量不足得营养成分。
新生牛血清病毒检测血吸附法
血吸附法检测新生牛血清病毒1原理有些病毒在其敏感宿主细胞中增殖，并不引起细胞病变，但在细胞表层存在病毒蛋白质，用一定百分比的红细胞悬液覆盖细胞表面，置于不同温度条件下一定时间，显微镜下观察，即可出现红细胞被吸附的现象。
血吸附法的技术主要特点是:敏感性高、速度快、成本低。
主要缺点是:病毒特异性检查问题尚未解决，结果判定的客观性较差，是间接检查病毒存在的方法，技术程序也还比较陈旧。
该方法首先使用无病毒血清对实验用Vero细胞进行培养增值，然后分别制备阴性供试品、阳性供试品以及待测试供试品。
取两瓶细胞，分别加入供试品。
然后在适宜的条件下处理，然后观察实验结果。
2材料和方法2.1材料2.1.1病毒牛副流感病毒。
2.1.2细胞Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)：购自中国生物制品检定所；2.1.3试剂无病毒污染的新生牛血清：阴性对照品使用；MEM培养基：细胞基础培养基；0.85%生理盐水：洗脱血细胞；胰蛋白酶：消化细胞；鸡血；豚鼠血。
2.1.4仪器设备①专门的病毒实验室：生物安全柜(CBK一DZOI)操作，符合国家生物安全要求；②洁净工作台；③倒置显微镜；④冰箱；⑤离心机；⑥离心瓶、注射器、吸管。
2.1.5阳性病毒将牛副流感病毒在Vero细胞上连续传代至病毒滴度为5.0lgCCID50/ml以上时进行合并，分为若干批，零下70℃冻存，作为阳性病毒对照液。
2.2方法2.2.1细胞制备以细胞密度为2~3×105/mL的Vero细胞，接种到适宜的细胞培养瓶后置于37℃培养箱培养，每天镜下观察细胞的分裂增殖情况，并记录形成良好单层的时间(镜下观察细胞生长成片率达90%以上为良好单层)。
注意将制备的细胞及时进行编号和标注，以免造成混淆。
2.2.2红细胞悬液配制取体重300一500g豚鼠，心脏采血2一3mL放入内含3一5mL生理盐水的离心管中，盖栓、轻摇。
豚鼠血加入生理盐水洗三次，800一1000转/分钟离心10一15分钟，压积血球，备用。
RPMI-1640培养基和DMEM培养基中HepG-2细胞生长状况
RPMI-1640培养基和DMEM培养基中HepG-2细胞生长状况作者：张迪等来源：《现代养生·下半月版》 2017年第12期【摘要】目的：比较含12% 新生牛血清的RPMI-1640 培养基与含12% 新生牛血清的DMEM 培养基培养HepG-2 细胞的效果。
方法：采用含12% 新生牛血清的RPMI-1640 培养基与含12% 新生牛血清的DMEM 培养基培养HepG-2 细胞, 观察细胞的生长状态，细胞的贴壁情况，并进行细胞计数。
结果：含12% 新生牛血清的RPMI-1640 培养基中的细胞生长状态更好，细胞的存活率更高。
结论：在对HepG-2 细胞进行细胞培养时建议首选含12% 新生牛血清的RPMI-1640。
【关键词】DMEM；HepG-2；RPMI-1640当前大部分学者在对贴壁细胞进行细胞培养时通常选用PRMI-1640 培养液或DMEM 培养液，故在对HeoG-2 细胞进行细胞培养时也可应用PRMI-1640 培养液或DMEM 培养液。
但已有研究发现[1]：由于PRMI-1640 培养基和DMEM 培养基中各成分不同，尤其是氨基酸，维生素和葡萄糖的含量差别很大，因此对细胞的生长速度和生长状态产生一定影响。
在体外细胞培养的过程中，细胞生长状态的好坏和细胞生长速度的快慢等方面与细胞培养基的选择有着密不可分的联系。
已有研究表明：在细胞培养基的制备过程中，需要在培养基中添加一定含量的生物性液体或组织提取液才能支持细胞的正常生长，由于血清中含有天然促生长因子，可以促进细胞贴壁，因此成为被广泛采用的培养基添加物，最常用的为新生牛血清[2]。
赵翔[3] 等人在研究PRMI-1640 和DMEM 培养基中对Hep G2 的影响时并没有充分考虑到血清浓度对于HepG-2 细胞的影响，选用的为浓度为10% 新生牛血清并且没有加入一定量的双抗。
但已有研究表明由于人肝癌细胞株生长缓慢，恶性程度较高，因此对于血清的要求比较严格，其培养时所需要新生牛血清的浓度要比一般的肿瘤细胞高一些。
细胞培养操作指南
细胞培养操作指南细胞培养操作指南1，原代细胞培养原代培养需要严格要求：（1）取材时需要去除脂肪和坏死的组织(2)为减少对组织的损伤，需用锋利的器具(3)适度离心以去除用于解离的酶（4）由于原代培养组织细胞的存活率很低，故用于原代培养的细胞的密度应高于正常的传代培养的细胞密度。
（5）营养丰富的培养基比单一的培养基更可取，如果要添加血清，胎牛血清比牛马的血清更好。
(6)对于取材部位易于感染（如皮肤）应先用70%乙醇消毒，在无菌条件下切除组织，尽快转移入BSS或培养基中。
不要再培养室取材，因为动物可引入微生物污染。
若必须推迟，可保存在4℃，72h。
1. 剪切组织先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除粘附的结缔组织等非培养所需组织。
再次清洗后，用手术剪将组织剪成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。
静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。
2. 消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。
3. 培养细胞悬液用计数板进行细胞计数，用培养液将细胞数调整为2～5×105 cells／m1，或实验所需密度。
分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。
置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。
一般3～5d，原代培养细胞可以粘附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1／2的新培养液，继续培养2～3 d后换液，一般7～14 d可以长满瓶壁，进行传代。
注意事项：1. 无菌操作细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般是很难消除。
2. 培养液所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。
由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。
病毒滴度测定方法
病毒滴度测定方法
病毒滴度测定是一种用于确定病毒在溶液中的浓度的方法。
它通常用于病毒学研究、疫苗生产和药物研发等领域。
正确的病毒滴度测定方法可以帮助科研人员准确地评估病毒的活性和浓度，从而为相关研究工作提供可靠的数据支持。
下面将介绍几种常用的病毒滴度测定方法。
一、细胞培养法。
细胞培养法是一种常用的病毒滴度测定方法。
首先，将待测病毒样品与细胞培养基混合，然后在培养皿中接种一定数量的细胞，并将混合液加入培养皿中。
接下来，将培养皿放入恒温培养箱中，培养一定时间后观察细胞的感染情况，根据感染细胞的数量可以计算出病毒的滴度。
二、血凝法。
血凝法是另一种常用的病毒滴度测定方法。
这种方法利用病毒对红细胞的凝集作用来确定病毒的滴度。
首先，将一定浓度的病毒样品与红细胞混合，然后在琼脂培养皿中进行凝集反应。
根据凝集的程度和范围可以计算出病毒的滴度。
三、动物接种法。
动物接种法是一种直接将病毒样品接种到动物体内，通过观察动物的感染情况来确定病毒滴度的方法。
这种方法通常用于病毒毒力的测定。
通过确定50%动物传染单位（TCID50）或50%致死剂量（LD50）来表示病毒的滴度。
总结。
以上介绍了几种常用的病毒滴度测定方法，每种方法都有其特点和适用范围。
在进行病毒滴度测定时，需要根据实际情况选择合适的方法，并严格按照操作规程进行操作，以确保测定结果的准确性和可靠性。
希望本文对您有所帮助。
动物细胞培养的条件与方法
动物细胞培养的条件与方法动物细胞培养是生物科学研究中重要的一部分，可以为细胞生物学、分子生物学和生物医学研究提供重要的实验材料和平台。
在动物细胞培养过程中，为了保证细胞的生长和繁殖，需要创造适宜的条件和选择合适的方法。
本文将介绍动物细胞培养的条件和方法，并探讨其在生物科学研究中的应用。
一、细胞培养的条件1. 培养基培养基是细胞培养中必不可少的基础物质，它提供了细胞所需的养分和生长因子。
常用的细胞培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）、RPMI（Roswell Park Memorial Institute）、MEM （Minimum Essential Medium）等。
这些培养基中含有适宜的氨基酸、糖类、维生素、微量元素等成分，能够满足细胞正常的生长和代谢需求。
2. pH值和温度细胞培养的过程中，pH值和温度的控制非常重要。
一般来说，细胞培养的pH值范围为7.2-7.4，温度常在37摄氏度左右。
过高或过低的pH值或温度都可能导致细胞受损或死亡。
3. CO2浓度大部分哺乳动物细胞需要适量的CO2浓度来维持其生长和代谢的平衡。
一般情况下，细胞培养使用的培养箱或培养器会控制CO2浓度在5%左右。
CO2的存在可以帮助维持培养基的酸碱平衡，有利于细胞的正常生长。
4. 营养物质和血清除了基础培养基外，细胞培养中的营养物质和血清也是细胞正常生长所必需的。
营养物质主要包括氨基酸、葡萄糖、维生素等，而血清则是提供生长因子和其他重要成分的来源。
细胞培养中常用的血清包括胎牛血清（FBS）和新生牛血清（NBS）等。
二、细胞培养的方法1. 传代培养传代培养是细胞培养中常用的方法之一，可以使细胞持续增殖。
具体步骤包括将细胞从原培养瓶中解离并收集，然后经过计数后按照一定比例重新接种到新的培养瓶中。
传代培养的频率取决于细胞的生长速度和需求。
2. 凝胶培养凝胶培养是一种将细胞培养在凝胶基质中的方法。
牛血清在细胞培养中的作用
一、牛血清在细胞培养基中的主要功能牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。
1.提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。
2. 提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。
3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。
4.是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。
5.起酸碱度缓冲液作用。
6.提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。
二、牛血清的主要成份血清是一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已为人所知，但还有一部分尚不清楚，而且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。
1.蛋白质是牛血清中主要成份。
除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白，球蛋白。
纤维粘连素细胞促进细胞附着；α2 巨球蛋白抑制胰蛋白酶的作用；胎牛血清中含胎球蛋白促细胞附着；转铁蛋白能结合铁离子，减少其毒性和被细胞利用。
2.多肽：血小板促生长因子能促细胞分裂，是多肽家庭的主要成员之一，是主要的促细胞增殖因子；成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，血清中含量虽很少，但对细胞生长也有一定作用。
3.激素：激素对细胞的作用是多方面的。
胰岛素：促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞分裂有关。
类胰岛素生长因子：能与细胞表达的胰岛素受体结合，从而有胰岛素同样的作用。
促生长激素：促细胞增殖效应。
氢化可的松：血清中含有定量的该成分，它可能兼有促细胞贴附和增殖作用，但有人证明，血清中的氢化可的松，如细胞密度高时可能有抑制细胞的作用和诱导其发生分化。
4其他成份氨基酸、葡萄糖、酮酸等对多种营养成分的合成培养基意义不大。
与蛋白相结合状态的微量元素对细胞培养有意义。
三、牛血清的质量要求随着科学技术的发展和生活水平的不断提高对生物医药产品的质量要求也越来越高，所以对制备工艺中所涉及到的各种原材料的质量标准要求也越来越高，特别是对用于细胞培养基中的主要天然成份――牛血清的质量要求也不断提高。
细胞生长促进试验筛选新生牛血清
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文献标识码 ：Ａ
文章编号 ：１０ —９ １（０８ ８０ １－２ ０７０３ ２０ ）０－０２０
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病毒的细胞培养
（9）细胞维持液：用以维持细胞缓慢生长或不死的培养
液。
其是配方：
基础培养基 95％
血清 2％－5％
双抗 100u/ml
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16
五 培养细胞的生长方式及类型
㈠ 贴附生长型细胞
必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大 体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难 以确定其稳定形态的细胞。
㈡ 悬浮生长型细胞
缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生 长需要。
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人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使 细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培 养基（如血清）。
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血清中含有：
①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子 ③激素 ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原
等。 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分
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一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞 可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加10 ％血清．
对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，
但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚． 血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、
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七 病毒的细胞培养
以禽流感感染鸡胚成纤维细胞为例。 （1）病料的处理 （2）病毒分离、繁殖 （3）细胞病变的观察 （4）效价测定 （5）中和实验
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（1）病料的处理
采集疑是感染禽流感禽的心、脑、肺、 淋巴结在含有双抗的PBS液中研磨，4℃过 夜，3000r/min离心10min，上清通过 0.22μm抽滤
常用的传代细胞：PK-15、IBRS-2、Vero、 Marc-145、CHO、MDCK、CRFK、Hela 等
新生牛血清中大肠杆菌噬菌体检测方法的建立
摘
要 ：本研 究 用大肠杆 菌标 准噬 茵体株 选择 确定的大肠杆 菌Ｃ ３ ０ 作为宿主 茵，采 用增 殖法和噬斑法与双 一 ００
层琼脂平板 法 ，对 多个厂 家的新 生牛血清进行 了大肠 杆菌噬 菌体检 测 ，建立 了兽 用生物制品 细胞培 养用新 生
牛血清 中大肠杆 菌噬菌体的检测方 法。
［１ １ ］Ｇｒｙ ｎ Ｍ ，ｅ ． ｈ ｎ ｔｐｃａ ｄｍｏｅｕａ ｈ ｒｃｅｉａｉｎ ａｏ ｔａ Ｐ ｅ ｏｙ ｉ ｎ ｌｃ ｌｒｃ ａａｔｒｚｔ １ ｏ
ｏ Ｂ ｕ ｅ ａｓ ａｎ ｉ ｌｔｄ ｆ ｍ ｎ ｅｗｈ ｌ Ｂ ｌ ｎ ｐ ｅ ａ ｆ ｒ ｃ ｌ ｔ ｉ ｓ ａｅ ｏ ａｍｉｋ ａｅ（ ａａ ｏ ｔｒ ａ ｌ ｒ ｏ ｒ ｅ
Ｉ ｔ ｒ ａｉ ｎ ｌ ｓＥｐ ｚ ｏｔ ｓ２ ０ ． ｎ ｅ ｎ ｔｏ ａ ｉｏ ｉ ， ０ ９ ｄｅ ｅ
［０ １ ］Ｃｌ ａｅ ｕＣ， ｅ ｅ ｎ Ｗ ａ ａ ｅ ｓ Ｔ ｙａ ｄＭ ， ｒ ｅ Ｊ ａ ｒ ａ Ｗ ｌ ｍａ ｓ ｖ ｌ Ｖ， ｔ ｖ ｎ ｒ Ｋ， ｒｌｎ Ｖｅｇ ｒ Ｍ，
ａ ｏ ｔ ｓ ｍｏｎ ｔ ｒｎｇ ｐｒ ｇ ａ ｍｅ ｆ ｒ ｃ ｔｌ ：ｔ ｍ ｐ ｃ ｆｆ ｌｅ ｂ ｒｕ ｉｏ ｉ ｏ ｒ ｍ ａ ｔｅ ｈｅ ｉ ａ ｔ ｏ ａｓ — ｏ
ａｕｏｏｔ ｔ）Ｍｉｒｂｏｏ ｙ ］ ９ ８１４３ ６ — ３ ｃｔｒｓａａ． ｃｏ ｉｌｇ ［ ， ９ ，４ ： ７ ７ ｒ Ｊ１ ２
［２ ｍｍｅｚａ Ａ， ｅＷ ｉＪ， ｊｓ ａＴ ｔａ Ｔｈ ｔｈＢ ｕ ｅｌ １ ］Ｅ ｒａｌ ｄ ｔＪ Ｄｉ ｔ ，ｅ １ ｋｒ ． ｅＤｕｃ ｒｃｌ ａ
关键词 ：细胞培养 ；新生牛血清 ；大肠杆菌 噬菌体 ；检测
新生牛血清原理
新生牛血清原理
新生牛血清是指从出生不超过一周的小牛体内提取的血清。
与成年牛血清相比，新生牛血清含有更多的生长因子、抗体和其他免疫分子，因此在生命科学研究中被广泛使用。
新生牛血清的原理是通过收集小牛出生后不久的血液，待血液凝固后离心分离出血清。
由于小牛的免疫系统仍在发育阶段，新生牛血清中含有更多的免疫分子，可以用于细胞培养、细胞增殖、病毒培养、抗体生产等多种应用。
新生牛血清的使用需要严格遵守生物安全规范，并确保来自健康的牛只。
同时，在使用过程中需要注意新生牛血清的保存和运输条件，以确保其免疫活性和生长因子等活性成分的完整性。
- 1 -。
新生牛血清 药典标准
新生牛血清药典标准新生牛血清是一种重要的生物制品原料，广泛应用于医药、保健品、生物技术等领域。
为了保证新生牛血清的质量和安全性，制定了一系列的药典标准，以规范其生产和使用。
本文将对新生牛血清的药典标准进行介绍，希望能够对相关行业人士有所帮助。
首先，新生牛血清的药典标准主要包括对其生产过程、质量指标、储存条件等方面的规定。
在生产过程中，必须符合相关的生产规范和操作流程，确保产品的纯度和活性。
质量指标方面，主要包括对蛋白质含量、内毒素水平、微生物菌落等指标的要求，以及对可能存在的有害物质的限量标准。
此外，新生牛血清在储存和运输过程中，也有一系列的条件要求，以确保其在使用前的质量稳定性。
其次，新生牛血清的药典标准是根据国际上的相关规定和标准进行制定的，以确保其在国际贸易中的通用性。
这些标准的制定是经过了广泛的讨论和专家的审查，具有很高的权威性和科学性。
因此，符合药典标准的新生牛血清可以更好地满足国际市场的需求，提升产品的竞争力。
再者，新生牛血清的药典标准对于生产企业和使用单位都具有重要的指导意义。
对于生产企业来说，遵循药典标准可以帮助其建立健全的质量管理体系，提高产品质量，降低生产风险。
对于使用单位来说，选择符合药典标准的新生牛血清可以更好地保证实验结果的准确性和可重复性，降低实验风险，提高工作效率。
最后，新生牛血清的药典标准是一个动态的过程，随着科学技术的发展和行业的需求，会不断地进行修订和更新。
因此，生产企业和使用单位都需要密切关注最新的药典标准，及时调整生产和使用的相关流程，以确保产品的质量和安全性。
总之，新生牛血清的药典标准对于保证产品质量和安全性，提升产品竞争力，促进行业健康发展具有重要的意义。
希望本文对相关行业人士有所帮助，也希望大家能够共同遵守药典标准，共同推动新生牛血清行业的发展。
新生牛血清检测要求（药典）
附录ⅩIII D新生牛血清检测要求本品系从出生14小时内未进食的新生牛采血分离血清，经除菌过滤后制成。
牛血清生产过程中不得任意添加其他物质成分。
新生牛血清用于生产前应逐批进行以下检查，并应符合规定。
蛋白质含量应为3.5%～5.0%（附录ⅥB第一法）。
血红蛋白用氰化高铁法或其他适宜的方法测定。
应不高于0.02%。
大肠杆菌噬菌体采用噬斑法和增殖法检测。
不得有噬菌体污染。
摩尔渗透压（指标待定）无菌检查依法检查，应符合规定（附录ⅫA）。
支原体检查依法检查，应符合规定（附录ⅫB）。
细菌内毒素检查应不高于10EU/ml（附录Ⅻ E 凝胶限量试验）。
病毒检查1. 细胞培养法（1）非血吸附病毒检查将新生牛血清供试品分别接种到人源（如人二倍体细胞）、猴源（如V ero细胞）以及牛肾传代细胞三种细胞，采用的牛肾传代细胞系应证明无牛病毒的污染。
每种细胞至少接种6瓶，每瓶细胞悬液接种量不少于培养液总量的25%。
于36±1℃培养21天。
接种的每种细胞都应同时设立牛血清阴性对照和病毒阳性对照，（阴性对照用牛血清应证明无牛病毒污染）。
培养过程中可根据细胞生长情况更换细胞培养液，每次更换培养液前应观察（肉眼/显微镜）有无细胞病变出现。
培养到期后，阴性对照应无任何细胞病变出现，阳性对照应出现典型的细胞病变，试验成立。
供试品检查应不出现任何细胞病变为阴性，符合要求。
（2）血吸附病毒检查将上述接种供试品的每种细胞取2瓶进行血吸附病毒检查。
用0.2%~0.5%鸡和豚鼠红细胞混合悬液覆盖于细胞表面，置2~8℃分钟，然后置20~25℃30分钟，分别进行镜检，观察红细胞吸附情况，供试品检查结果均应为阴性。
试验同时应设立血吸附阳性对照。
2. 免疫荧光抗体检查法采用直接或间接免疫荧光抗体检查法，至少应对牛腹泻病毒，牛腺病毒、牛细小病毒、呼肠孤病毒、狂犬病病毒以及牛副流感病毒进行检查，结果均应为阴性。
支持细胞增殖检查用Sp2/0 -Ag14或适宜的非贴壁传代细胞进行。
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细胞培养法检测新生牛血清病毒
1原理
某些病毒在其敏感的宿主细胞内增殖时，可引起细胞病变，即出现细胞变圆、细胞破裂、细胞融合等现象。
细胞培养法的主要特点是：广泛的适用性、操作方法简单、成本较低并且该技术方法成熟。
主要缺点是：特异性差、敏感性较低、检测速度慢。
该方法首先使用无病毒血清对实验用Vero细胞进行培养增值，然后分别制备阴性供试品、阳性供试品以及待测试供试品。
将Vero细胞均匀分为至少3份，分别加入以上供试品。
然后再适宜的温度条件下培养，每日进行观察，最多观察21天并记录细胞病变情况。
2材料和方法
2.1材料
2.1.1病毒
牛腹泻病毒；狂犬病毒；牛腺病毒、牛细小病毒、牛副流感病毒、呼肠孤病毒。
2.1.2细胞
Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)：购自中国生物制品检定所
2.1.3试剂
无病毒污染的新生牛血清：阴性对照品使用；
MEM培养基：细胞基础培养基；
胰蛋白酶：消化细胞。
2.1.4仪器设备
①专门的病毒实验室:生物安全柜(CBK一D201)操作，符合国家生物安全要求；
②洁净工作台；
③倒置显微镜；
④冰箱；
⑤离心机；
⑥离心管、注射器、吸管。
2.1.5阳性病毒
将BVDV等，六种病毒在Vero细胞上连续传代至病毒滴度为5.0lgCCID50/mL以上时进行合并，分为若干批，零下70℃冻存，作为阳性病毒对照液。
2.2方法
2.2.1非血吸附病毒检查是指利用传统的细胞培养或利用其他的对不具有动物血细胞吸附性质的病毒进行检测方法的统称。
2.2.2细胞制备
以细胞密度为2~3×105/mL的Vero细胞，接种到适宜的细胞培养瓶后置于37℃培养箱培养，每天镜下观察细胞的分裂增殖情况，并记录形成良好单层的时间(镜下观察细胞生长成片率达90%以上为良好单层)。
注意将制备的细胞及时进行编号和标注，以免造成混淆。
2.2.3供试品检测
取良好单层细胞培养瓶，弃掉Vero细胞旧营养液，在方瓶中分别加入胰蛋白酶消化液0.8mL，待可见细胞面呈松散状态，弃掉胰蛋白酶消化液，方瓶中分
别加入适量生长液将所有细胞都从方瓶壁上吹打下来，再轻轻吹打几次，使细胞尽量分散成单个状态。
每瓶细胞按一定比例分种到已经加入9mL生长液细胞培养瓶内，并轻轻地吹打几次，使细胞分散均匀，接种6瓶。
每瓶细胞悬液接种3mL供试品，置36士1℃培养21天。
在培养过程中根据细胞生长情况更换细胞培养液，每次更换培养液前观察有无细胞病变出现。
2.2.4阴性对照品制备
用无病毒污染的小牛血清替代供试品，同法操作，作为阴性对照。
2.2.5阳性对照品制备
将按照2.1.5方法将制备好的除牛副流感病毒外的各类病毒稀释液体，将病毒液稀释至100一240CCID50/mL，然后污染经过56℃灭活处理的新生牛血清，用含有病毒污染的小牛血清替代供试品，同法操作，作为阳性对照。
2.3结果
培养到期后，阴性对照应无任何细胞病变出现，阳性对照应出现典型的细胞病变。
供试品检查不出现细胞病变为阴性，则判定合格。
供试品检查出现细胞病变，则判定不合格。
附注：
阴性及阳性的对照病毒实验在该实验中起到极其关键的作用，是判定最终实验结果是否可信的最重要依据。
实验的过程中对阳性病毒的制备应特别注意生物安全方面的保护，病毒的鉴别及活力的测定是在整个实验进行前需要进行的必要的准备工作，以上几种病毒的鉴别及活力实验现在在文献及各相关标准中均未详细收载仅根据病毒惠赠企业索取病毒在细胞培养实验中的典型病变图来确认病毒的种类，但是该方法的准确性和可重复性较差。
如部分血清型的牛腺病毒可以耐受56℃的温度，另外新生牛血清的部分有利于细胞培养的成分如各种酶类等在56℃的条件下极易变性，从而影响细胞的正常培养生长，因此阴性血清的选取可以选择经过36士1℃的条件下培养21天对细胞无任何影响的新生牛血清作为基础培养血清和阴性对照血清。
对供试品的实验制备应小心其被其他微生物或杂质二次污染，必须严格按照规定进行新生牛血清的抽样和检验，在具体的研究实验中必须注意一些这样细节而易被忽略的操作，操作虽然简单易行，但是对整个研究实验而言是极其重要的，根据本人的实际操作经验在供试品的实验操作中，多余的操作及较大的动作等对供试品原始条件均有一定的影响。
另外供试品的冻融次数对实验结果的影响也较大，在实际的操作中由于新生牛血清反复冻融次数过多不但对细胞生长带来一定的影响而且对病毒的检出也有着很大的影响，一般情况下供试品冻融的次数应少于10次，否则就会对供试品实验的判定以及新生牛血清日后的使用带来较大的不便和麻烦，会对其他新生牛血清的使用者带来不必要的麻烦，造成较大的浪费和损失。