新生牛血清病毒检测细胞培养法

细胞培养法检测新生牛血清病毒

1原理

某些病毒在其敏感的宿主细胞内增殖时，可引起细胞病变，即出现细胞变圆、细胞破裂、细胞融合等现象。细胞培养法的主要特点是：广泛的适用性、操作方法简单、成本较低并且该技术方法成熟。主要缺点是：特异性差、敏感性较低、检测速度慢。该方法首先使用无病毒血清对实验用Vero细胞进行培养增值，然后分别制备阴性供试品、阳性供试品以及待测试供试品。将Vero细胞均匀分为至少3份，分别加入以上供试品。然后再适宜的温度条件下培养，每日进行观察，最多观察21天并记录细胞病变情况。

2材料和方法

2.1材料

2.1.1病毒

牛腹泻病毒；狂犬病毒；牛腺病毒、牛细小病毒、牛副流感病毒、呼肠孤病毒。

2.1.2细胞

Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)：购自中国生物制品检定所

2.1.3试剂

无病毒污染的新生牛血清：阴性对照品使用；

MEM培养基：细胞基础培养基；

胰蛋白酶：消化细胞。

2.1.4仪器设备

①专门的病毒实验室:生物安全柜(CBK一D201)操作，符合国家生物安全要求；

②洁净工作台；

③倒置显微镜；

④冰箱；

⑤离心机；

⑥离心管、注射器、吸管。

2.1.5阳性病毒

将BVDV等，六种病毒在Vero细胞上连续传代至病毒滴度为5.0lgCCID50/mL以上时进行合并，分为若干批，零下70℃冻存，作为阳性病毒对照液。

2.2方法

2.2.1非血吸附病毒检查是指利用传统的细胞培养或利用其他的对不具有动物血细胞吸附性质的病毒进行检测方法的统称。

2.2.2细胞制备

以细胞密度为2~3×105/mL的Vero细胞，接种到适宜的细胞培养瓶后置于37℃培养箱培养，每天镜下观察细胞的分裂增殖情况，并记录形成良好单层的时间(镜下观察细胞生长成片率达90%以上为良好单层)。注意将制备的细胞及时进行编号和标注，以免造成混淆。

2.2.3供试品检测

取良好单层细胞培养瓶，弃掉Vero细胞旧营养液，在方瓶中分别加入胰蛋白酶消化液0.8mL，待可见细胞面呈松散状态，弃掉胰蛋白酶消化液，方瓶中分

别加入适量生长液将所有细胞都从方瓶壁上吹打下来，再轻轻吹打几次，使细胞尽量分散成单个状态。每瓶细胞按一定比例分种到已经加入9mL生长液细胞培养瓶内，并轻轻地吹打几次，使细胞分散均匀，接种6瓶。

每瓶细胞悬液接种3mL供试品，置36士1℃培养21天。在培养过程中根据细胞生长情况更换细胞培养液，每次更换培养液前观察有无细胞病变出现。2.2.4阴性对照品制备

用无病毒污染的小牛血清替代供试品，同法操作，作为阴性对照。

2.2.5阳性对照品制备

将按照2.1.5方法将制备好的除牛副流感病毒外的各类病毒稀释液体，将病毒液稀释至100一240CCID50/mL，然后污染经过56℃灭活处理的新生牛血清，用含有病毒污染的小牛血清替代供试品，同法操作，作为阳性对照。

2.3结果

培养到期后，阴性对照应无任何细胞病变出现，阳性对照应出现典型的细胞病变。供试品检查不出现细胞病变为阴性，则判定合格。供试品检查出现细胞病变，则判定不合格。

附注：

阴性及阳性的对照病毒实验在该实验中起到极其关键的作用，是判定最终实验结果是否可信的最重要依据。实验的过程中对阳性病毒的制备应特别注意生物安全方面的保护，病毒的鉴别及活力的测定是在整个实验进行前需要进行的必要的准备工作，以上几种病毒的鉴别及活力实验现在在文献及各相关标准中均未详细收载仅根据病毒惠赠企业索取病毒在细胞培养实验中的典型病变图来确认病毒的种类，但是该方法的准确性和可重复性较差。

如部分血清型的牛腺病毒可以耐受56℃的温度，另外新生牛血清的部分有利于细胞培养的成分如各种酶类等在56℃的条件下极易变性，从而影响细胞的正常培养生长，因此阴性血清的选取可以选择经过36士1℃的条件下培养21天对细胞无任何影响的新生牛血清作为基础培养血清和阴性对照血清。对供试品的实验制备应小心其被其他微生物或杂质二次污染，必须严格按照规定进行新生牛血清的抽样和检验，在具体的研究实验中必须注意一些这样细节而易被忽略的操作，操作虽然简单易行，但是对整个研究实验而言是极其重要的，根据本人的实际操作经验在供试品的实验操作中，多余的操作及较大的动作等对供试品原始条件均有一定的影响。

另外供试品的冻融次数对实验结果的影响也较大，在实际的操作中由于新生牛血清反复冻融次数过多不但对细胞生长带来一定的影响而且对病毒的检出也有着很大的影响，一般情况下供试品冻融的次数应少于10次，否则就会对供试品实验的判定以及新生牛血清日后的使用带来较大的不便和麻烦，会对其他新生牛血清的使用者带来不必要的麻烦，造成较大的浪费和损失。