新生牛血清病毒检测血吸附法

血吸附法检测新生牛血清病毒

1原理

有些病毒在其敏感宿主细胞中增殖，并不引起细胞病变，但在细胞表层存在病毒蛋白质，用一定百分比的红细胞悬液覆盖细胞表面，置于不同温度条件下一定时间，显微镜下观察，即可出现红细胞被吸附的现象。血吸附法的技术主要特点是:敏感性高、速度快、成本低。主要缺点是:病毒特异性检查问题尚未解决，结果判定的客观性较差，是间接检查病毒存在的方法，技术程序也还比较陈旧。该方法首先使用无病毒血清对实验用Vero细胞进行培养增值，然后分别制备阴性供试品、阳性供试品以及待测试供试品。取两瓶细胞，分别加入供试品。然后在适宜的条件下处理，然后观察实验结果。

2材料和方法

2.1材料

2.1.1病毒

牛副流感病毒。

2.1.2细胞

Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)：购自中国生物制品检定所；

2.1.3试剂

无病毒污染的新生牛血清：阴性对照品使用；

MEM培养基：细胞基础培养基；

0.85%生理盐水：洗脱血细胞；

胰蛋白酶：消化细胞；

鸡血；

豚鼠血。

2.1.4仪器设备

①专门的病毒实验室：生物安全柜(CBK一DZOI)操作，符合国家生物安全要求；

②洁净工作台；

③倒置显微镜；

④冰箱；

⑤离心机；

⑥离心瓶、注射器、吸管。

2.1.5阳性病毒

将牛副流感病毒在Vero细胞上连续传代至病毒滴度为5.0lgCCID50/ml以上时进行合并，分为若干批，零下70℃冻存，作为阳性病毒对照液。

2.2方法

2.2.1细胞制备

以细胞密度为2~3×105/mL的Vero细胞，接种到适宜的细胞培养瓶后置于37℃培养箱培养，每天镜下观察细胞的分裂增殖情况，并记录形成良好单层的时间(镜下观察细胞生长成片率达90%以上为良好单层)。注意将制备的细胞及时进行编号和标注，以免造成混淆。

2.2.2红细胞悬液配制

取体重300一500g豚鼠，心脏采血2一3mL放入内含3一5mL生理盐水的离心管中，盖栓、轻摇。豚鼠血加入生理盐水洗三次，800一1000转/分钟离

心10一15分钟，压积血球，备用。

取一年龄以上来享公鸡，翼下静脉采血2一3mL放入内含3一5mL生理盐水的离心管中，盖栓、轻摇。鸡血加入生理盐水洗三次，800一1000转/分钟离心10一15分钟，压积血球，备用。

按比例吸取鸡血球和豚鼠血球，用0.85%生理盐水配制成0.2一0.5%鸡豚红细胞混合悬液备用。

2.2.3供试品检测

取培养到期的接种供试品的每种细胞2瓶，观察细胞病变，细胞形态。弃培养液，用生理盐水洗三次，加入鸡红细胞和豚鼠红细胞混合悬液5一10mL/瓶，覆盖细胞表面，置2一8℃作用30分钟，然后再置作用20一25℃作用30分钟，弃掉红细胞悬液，用生理盐水反复洗三次，显微镜下观察。

2.2.4阴性对照品制备

用无病毒污染的小牛血清替代供试品，同法操作，作为阴性对照。

2.2.5阳性对照品制备

将按照2.1.5方法将制备好的牛副流感病毒稀释液体，将病毒液稀释至100一240CCID50/mL，然后污染经过56℃灭活处理的新生牛血清，用含有病毒污染的小牛血清替代供试品，同法操作，作为阳性对照。

2.3结果

阳性对照应出现血细胞吸附。供试品检查不出现血细胞吸附为阴性，判定合格。供试品检查出现血细胞吸附，判定不合格。

附注：

牛副流感病毒为典型的血吸附病毒，因此利用血吸附法对病毒的存在与否进行确认。副流感病毒中的HA可以促使动物红细胞的聚集，根据聚集情况判定病毒的存在或者判定病毒的滴度。副流感病毒有一定的致病性因此在实际的操作中应特别注意实验人员的安全防护。并且应在实验操作前应进行病毒滴度检测，最终的病毒滴度实验浓度应控制在200CCID50左右，但应注意所采取的方法也应为血吸附法，根据血细胞沉淀来判断该病毒的滴度而不是根据细胞的病变情况来确定，因为该病毒为胞内病毒，其对细胞的病变情况可能不是特别典型和明显。

阴性对照实验的选择同样需要对牛血清进行热灭活处理，副流感病毒对温度较为敏感，在常温条件下暴露时间过长也会影响细胞的正常培养，因此阴性新生牛血清的选取可以选择经过56℃灭活的新生牛血清作为基础培养血清和阴性对照血清，同样也可以选取经过培养无特异微生物的合格新生牛血清。而在热灭活也会给新生牛血清带来负面的影响，在较热条件下新生牛血清的加热会导致血清中沉淀，会严重影响血吸附实验的结果判定，应需要在实际的实验操作中加以重视。

供试品的冻融次数对牛副流感病毒的影响较大，在实际的操作中由于新生牛血清反复冻融次数过多会对病毒的生长带来一定的影响，从而对病毒的检出率也有很大的影响，一般情况下供试品冻融的次数不能多余8次，否则就会对供试品中牛副流感病毒的判定产生偏差，并且还会对其他新生牛血清的使用者带来不必要的麻烦，造成较大的浪费和损失。

由于牛副流感病毒对温度的敏感性较强，因此在供试品制备实验中应尽量避免高温条件以及其他化学试剂的污染，而且在操作过程中应尽快的完成整个实验操作，避免可能存在的病毒由于长时间暴露而使活性降低。

在实际的新生牛血清保存中是放置在零下20℃的条件下进行保存，在此条件下牛副流感病毒会处于休眠的状态，所以仍然存在在实际使用过程中污染的可能。