新生牛血清病毒检测血吸附法
新生牛血清中乙脑抗体的检测及其方法的建立
测定方法 。 具有灵敏度高 、 重复性好等优点 ， 可真实
反映牛血清 中抗体中和乙型脑炎病毒（ 简称乙脑病 毒） 的能力。对 ｌ ６个批号 的新生牛血清用该方法 进行了抗乙脑病毒抗体的测定 ， 并对其结果进行 了
分析 比较 。
Ｐ Ｕ法 ， 中国生物制品规程》ຫໍສະໝຸດ 进行。 Ｆ 按《 ¨ ６ 待检血清
控标准》 进行质控外， 还应进行乙脑抗体的检测。
关键词 ： 蚀斑减少 中和试验 ； 乙脑病毒抗体 ； 新生牛血清 中图分类号 ：３ ３ ３ Ｒ ７ ． １ 文献标 识码 ： Ａ 文章 编号 ： ０ —６ ３（０ ６ ０ ４ ４ －３ １ ５５ ７ 。２０ ） １） ３０ ０ ０
Ｐａ ｕ ｅ ｕ ｔ ｎｎ ｕｒｌ ａｉｎｔｓ（ ＲＮ ｌｑ ｅｒｄ ｃ ｏ ｅ ｔａ ｚｔ ｅｔ Ｐ Ｔ）ｉ ｄｔｃ ｏ ｆ ｎｉ ａ ａ ｅｅｅ ｃｐ ａｉｓａ ｔ ｏ ｉｓｉ ｅ ｂ ｒ ｏ ｉ ｉ ｏ ｎ ｅｅｔ ｎｏ ｔＪｐ ｎｓ ｎ ｅｈ ｌｉ ｎｉ ｄｅ ｎ ｗ ｏｎ ｂ ． ｉ ａ — ｔ ｂ ｎ
维普资讯
屋 ０ ６年第 ３ ０ ４卷第 １ 期
Ｐｏ ｃｏｉ ｍ ｕ ｏ Ｆｂ ２ ０ Ｖ １ ４Ｎ ． ｒｇｉ Ｍｉ ｂｏ Ｉ ｍ ｎｌ ｅ ． ０６． ０ ｎ ｒ ｌ ．３ ｏ １
新生牛血清中乙脑抗体的检测及其方法 的建立
王 静， 李裕惠， 栗克喜 （ 成都生物制品研 究所 ， 成都 ６ ０２ ） １０３
ｓ ｏ ｌ ｅ ｔｓｅ ｎ ｎ ｗｂ ｒ ｏ ｉｅ ｓ ｌ ｉ ． ｈ ｕ ｄ ｂ ｅ ｔ ｄ ｉ ｅ ｏ ｌ ｂ ｖｎ ｅ－ １ ｌ ｕ１
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浅论新生牛血清病毒检测
病病毒 ，感染狂犬病 病毒的动物常表现 为极度兴奋和狂躁 ， 病死率高 ， 且 由于该种 病毒可感染所 有温和动物 ， 因此对 于
疫苗生产的危害极大。（ ３ ）牛副流感病毒是通过感染 牛体 ， 引起呼吸道疾病的一 种病 毒 ， 多发于欧美等 国家。（ ４ ）牛腹
是现代牛血清病毒检测 的重要手段之一。 实验用到的不同种
１ ． ２ 新生牛血清病毒种类 新生牛血清的病毒通常为４ 种，
能够引起生物体 的不 同病变。（ １ ）牛细小病 毒 ， 常发生于我
国从 国外引进种牛的地区 ， 是一种接触性传染病 。（ ２ ）狂犬
类 的免疫荧 光抗体ห้องสมุดไป่ตู้、 牛 肾细胞 、 新生 牛血清等 主要试剂应保 存在符合 生物安全要求 的洁净柜 中， 实验操作 时 ， 在牛 肾细
近年来 ， 生物制 品在生产 以及应用方面取得 了不小 的进 展， 与社会生活 的联系也愈发紧密 。由于新生牛血清 中病毒 来源广 、 种类多 ， 因此 针对新 生牛血 清的病毒检测 十分必要 。
采血 到病 毒检测 ， 力求将污染 降到最低 ， 保证新 生牛血清 的
质量 。
２ 新生牛血清病毒检测方法
制备 ， 以牛肾细胞为例 ， 制备前须 对新生 牛血清进行 灭活处
理， 避免影响测定准确率。通过培养后阴性及阳性细胞病变
现今生产新生牛血清 的企业众多 ， 为 了统一 品质 ， 国家 出台
了相关政策和规范 ， 加大 了监管力度 ， 力求从 源头上控制牛
的产生情况 ， 检测病毒种类以及活力 ， 判断新生牛血清质量 。 采用细胞培养法需要较长 的操作时 间， 且特异性以及敏感性 较差 ， 因此检出效果有待提高。
牛血清的病毒安全检测与病毒灭活工艺
牛血清的重要性与生物药品的病毒安全性
该方法的另一突出优点是自动化，因此可以用于大量动物的 筛选。
朊病毒
Positive Control Dilution to End-Point
牛血清的重要性与生物药品的病毒安全性 牛的病原与病毒安全性关注的重点 欧盟对牛血清病毒检测的要求 病毒分类与牛的某些病毒 牛血清的病毒安全检测技术 血清的病毒清除/灭活工艺 病毒安全实验室的部分研究工作
DNA病毒－－牛腺病毒
牛腺病毒（Adenoviruses） 分类地位：腺病毒科，哺乳动物腺病毒属 形态特征：无囊膜，90nm 理化特性：对酸、碱、有机溶剂有抵抗 分2个主要亚群，10个血清型。
DNA病毒－－牛腺病毒
尚不清楚是否人兽共患，但可以转化人细胞。 能用细胞感染检测，1群感染牛胚肾细胞并迅速产生细胞 病变，2群感染牛睾丸细胞，有时需要盲传。 也可用PCR检测。
WHO和各国管理当局、行业协会等高度关注医药产品生产 使用细胞基质的安全问题，尤其是潜在病毒污染的问题。
疫苗病毒安全性的可能污染途径：活疫苗种毒的污染，制 备工艺中原、敷料的污染和其他需要考虑的问题。 其中，牛血清的质量控制与病毒安全检测最受关注。
牛血清的重要性与生物药品的病毒安全性 牛的病原与病毒安全性关注的重点 欧盟对牛血清病毒检测的要求 病毒分类与牛的某些病毒 牛血清的病毒安全检测技术 血清的病毒清除/灭活工艺 病毒安全实验室的部分研究工作
牛血清的病毒安全检测与病毒灭活工艺
牛血清的病毒安全检测与病毒灭活工 艺
值得关注的对象
潜在性感染的病毒： （1）隐性感染而不引起任何疾病的病毒； （2）某些持续性感染的病毒； （3）处于潜伏状态的病毒。 由于机体生理状态（如怀孕）、外界环境的变化，机体抵 抗力下降等因素，这类病毒可能大量增殖或引起疾病的发 生。
牛血清的病毒安全检测与病毒灭活工 艺
朊病毒
• Prusiner 1982: the plaque protein is the infectious agent (prion)
• The normal, non-infectious Protein (PrPC) is encoded by the host and is mainly expressed on lymphocytes and neurons
牛血清的病毒安全检测与病毒灭活工 艺
DNA病毒－－牛多型瘤病毒
BPyV倍受关注，它可能是一种人兽共患病，饲养人员、 兽医的体内有较高水平的抗体，而对大多数人群则缺乏 抵抗力。 可以感染灵长类细胞，包括人的细胞。 影响细胞培养的结果。 检测： 能用细胞感染检测，在猴肾细胞可以产生特异性的病变， 即胞浆、胞核空泡化。 PCR检测，使用特异性的引物扩增、杂交或测序。
牛血清的病毒安全检测与病毒灭活工 艺
朊病毒
牛血清的病毒安全检测与病毒灭活工 艺
朊病毒
PrPC
PrPSc
Refolding model
(template directed)
Seeding model (nucleated crystallization)
PrPC
最新新生牛血清病毒检测血吸附法
血吸附法检测新生牛血清病毒1原理有些病毒在其敏感宿主细胞中增殖，并不引起细胞病变，但在细胞表层存在病毒蛋白质，用一定百分比的红细胞悬液覆盖细胞表面，置于不同温度条件下一定时间，显微镜下观察，即可出现红细胞被吸附的现象。
血吸附法的技术主要特点是:敏感性高、速度快、成本低。
主要缺点是:病毒特异性检查问题尚未解决，结果判定的客观性较差，是间接检查病毒存在的方法，技术程序也还比较陈旧。
该方法首先使用无病毒血清对实验用Vero细胞进行培养增值，然后分别制备阴性供试品、阳性供试品以及待测试供试品。
取两瓶细胞，分别加入供试品。
然后在适宜的条件下处理，然后观察实验结果。
2材料和方法2.1材料2.1.1病毒牛副流感病毒。
2.1.2细胞Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)：购自中国生物制品检定所；2.1.3试剂无病毒污染的新生牛血清：阴性对照品使用；MEM培养基：细胞基础培养基；0.85%生理盐水：洗脱血细胞；胰蛋白酶：消化细胞；鸡血；豚鼠血。
2.1.4仪器设备①专门的病毒实验室：生物安全柜(CBK一DZOI)操作，符合国家生物安全要求；②洁净工作台；③倒置显微镜；④冰箱；⑤离心机；⑥离心瓶、注射器、吸管。
2.1.5阳性病毒将牛副流感病毒在Vero细胞上连续传代至病毒滴度为5.0lgCCID50/ml以上时进行合并，分为若干批，零下70℃冻存，作为阳性病毒对照液。
2.2方法2.2.1细胞制备以细胞密度为2~3×105/mL的Vero细胞，接种到适宜的细胞培养瓶后置于37℃培养箱培养，每天镜下观察细胞的分裂增殖情况，并记录形成良好单层的时间(镜下观察细胞生长成片率达90%以上为良好单层)。
注意将制备的细胞及时进行编号和标注，以免造成混淆。
2.2.2红细胞悬液配制取体重300一500g豚鼠，心脏采血2一3mL放入内含3一5mL生理盐水的离心管中，盖栓、轻摇。
豚鼠血加入生理盐水洗三次，800一1000转/分钟离心10一15分钟，压积血球，备用。
畜禽免疫抗体监测血样采集与血清分离保存技术
畜禽免疫抗体监测血样采集与血清分离保存技术畜禽血样的采取是动物免疫抗体监测和疫病监测工作中的重要内容。
在畜禽血样的采取过程中，其做好采前准备、采血方法、采集时机、血样运送、保存和处理等环节，都直接关系到免疫抗体检测结果的准确性及可靠性，笔者通过多年的实际操作，积累了一定的方法和经验，供同行参考。
1采血前的准备采血前应穿好工作服，备好保定器械，v形管、v形管架，一次性注射器(采血针)、记号笔、酒精棉球、干棉球、相关表格等。
16号针头、9号和7号头皮针若干，镊子、剪刀、酒精(75％)、药棉若干、保定棍和绳2副、一次性5ml真空管若干。
2血样的采集根据畜禽种类、所需血样或血清的数量确定采血部位、器械及采血量。
禽类采翅静脉、猪采前腔静脉或耳静脉、牛采颈静脉或耳静脉、羊采颈静脉：禽类用5ml一次性医用注射器，猪、牛、羊用10～20ml 一次性医用注射器：禽类采血量不少于2ml，猪、牛、羊不少于5ml。
2．1猪血样采集2．1．1猪的保定 (1)徒手保定法：适用于中、小猪，可根据具体情况采用正提、倒提或横卧方法保定。
保定人抓住猪的双耳向上提起，两腿夹住猪背。
也可用双手抓住猪的两后肢，向上倒提后，两腿夹住其肩胸部。
保定中猪时，保定者应背靠圈栏增加稳定性。
横卧保定由一人或二人操作。
保定者从背侧将猪后肢及前肢或耳抓住后，用力提起横卧放倒，并紧压其头部及后躯。
(2)器械保定法：适用于成年公猪、母猪或野性较强的猪。
一种为鼻绳保定，即用直径1cm、长3～4m的一根绳子，一端结成直径为20cm的活套，将其套于猪的上颌犬齿后方后，收紧环套，另一端拉紧或缠绕于栏杆上。
另一种为鼻捻棒保定，即用1m长木棒，一端栓一直径20cm的绳套，同上法套用于猪上颌犬齿后方后，捻转收紧绳套将猪保定。
2．1．2采血猪血样采集耳静脉或前腔静脉，猪的采血最好是空腹，在早上或午后进行。
采血场所有充足的光线；室温夏季最好在25～2 8℃，冬季15～20℃为宜。
活性炭对小牛血清去蛋白提取液中多肽的吸附作用
活性炭对小牛血清去蛋白提取液中多肽的吸附作用（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】目的研究活性炭对小牛血清去蛋白提取液中多肽的吸附作用。
方法将活性炭加入小牛血清去蛋白提取液中，过滤后检测蛋白含量及吸光度值,呼吸活性及氨基酸的含量。
结果与无活性炭对照比较，加入活性炭后小牛血清去蛋白提取液吸光度值、多肽含量均明显下降;呼吸活性及氨基酸含量没有明显变化。
结论活性炭对小牛血清去蛋白提取液中多肽有吸附作用。
【关键词】活性炭;小牛血清去蛋白提取液;多肽The Absorption Effect of Active Carbon on the Polypeptide in Calf Serum Abstract Protein-freeLI Xin,WANG Tie (Liaoning Ahon Pharmaceuticals Corporation Limited,Jinzhou 121000 China)Abstract：Objective To study the effects of active carbon on the polypeptide in calf serum abstract protein-free. Methods Put active carbon into calf serum abstract protein-free; and determine protein content, absorbance, amino acid content and breath nature afterfiltration.Result Compared with the group without active carbon, absorbance and protein content decreased ,while breath nature and amino acid content did not decrease.Conclusions Polypeptide was absorbed by active carbonKey words：active carbon; calf serum abstract protein-free; polypeptide活性炭是一种多孔径的炭化物，有极丰富的孔隙构造，具有良好的吸附特性，它的吸附作用藉物理及化学的吸咐力而成的,其外观色泽呈黑色。
牛血液采集及血清分离技术
科 技 转 化
牛 血 液 采 集 及 血 清 分 离 技 术
李 强
（ １ ． 甘 肃 省 张 掖 市 甘 州 区 动 物疫 病 预 防控 制 中心 ， 甘肃 张 掖 ７ ３ ４ ０ ０ ０ ； ２ ． 国家 肉牛 产 业 技 术 体 系 张 掖 综合试验站 ， 甘肃 张掖 ７ ３ ４ ０ ０ ０ ）
无 菌试 管或小 瓶 中。分 离 后 得 到 的血 清 ， 应 尽 快用 冷 藏或冷 冻方 法保存 ， 及 时送 到实 验室 进行检 验 。
４ 常 见 不 良“ 采血法” 导 致 的结 果
的 方 法进 行 血 清 分 离 。采 血 及 血 清 分 离成 功 率 １ ０ ０ 。
关 键词 ： 畜禽 ； 血液采 集技 术 ； 血 清分 离技 术 ； 体会
中 图分 类 号 ： ￥ ８ ５ １ ． ３ ４ 文 献标 识 码 ： Ｂ 文章编号 ： １ ０ ０ １ － ９ １ １ １ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ３ — ０ ０ ８ ０ — ０ ３
套， 采 血登记 表 （ 见表 １ ） 、 记录用笔、 玻 璃 铅 笔 及 冷
藏箱 、 消毒液 （ 用 于工作 人员及器 械 消毒） 等。
表 １ 采 血 登 记 表
序 号 畜 主 地 址 联 系 方 式 畜 别 畜号 或 耳 标 号 采 血 日期 实 验 室 收 到 日期 血 清 质 量
年 月 日
血 清 编 号 备 注
检 验 单 位
检验人员 ：
２ 牛 的采 血 技 术
２ ． １ 牛 血 液 采 集源自技 术 毒， 再以 ７ ５ 酒精棉球脱碘消毒； 如 在 颈 部 左 侧 采 血（ 以左侧 为例 ） ， 用 左手 的食 指 、 中指 及 无 名指 （ 或 半握 拳） 压 住采血 部位稍 下 （ 向心） 端 的颈静 脉 ， 使 静 穿戴好 工作 服 、 帽、 口罩 、 胶 脉 回流受 阻 ， 静脉 怒 张 ， 这 时用 右 手 拇 指 、 食指 及 中 指持 紧消 毒后并 干燥 的 １ ８ ＃针头 ， 用 飞针 方 式扎 入 颈 静脉 （ 如用真 空采 血 方 法 ， 因 针头 尖 锐且 较 细 ， 轻 轻 即可刺 入颈静 脉 ， 当针头 后方 见血后 ， 应迅 速将连
生物制品生产和检验用新生牛血清质量标准
生物制品生产和检验用新生牛血清质量标准用于生物制品生产的牛血清应为从出生14小时内未进食初乳的新生小牛采血分离血清，经除菌过滤制成。
主要用于细胞培养。
【性状】为淡黄色澄清稍黏稠的液体，无溶血或异物。
【无菌检验】按附录页进行检验，应无菌生长。
【支原体检验】按附录页进行检验，应无支原体生长。
【外源病毒检验】将被检血清按10%浓度加入MEM培养基中，接种48孔细胞培养板培养的VERO、BHK21、PK15、牛睾丸细胞单层，每种细胞接种8孔，同时设立牛病毒性腹泻／粘膜病病毒（BVDV）对照各2孔，37℃培养5日，观察细胞病变，细胞均不得出现细胞病变。
培养至第5日时，对每种细胞的2孔及病毒对照孔，用PBS洗涤3次，每孔加入80%丙酮0.5ml，4℃以下固定30分钟，弃丙酮后自然干燥，每孔加入BVDV荧光抗体染色0.3ml，室温染色30分钟，弃荧光抗体并用PBS洗涤3次，荧光显微镜观察，被检血清孔不得出现荧光染色。
剩余的6个细胞孔,前3孔，每孔加入0.2%豚鼠、人O型、鸡红细胞等量混合液0.3 ml，2～8℃作用30分钟，另3孔同样加入红细胞后室温作用30分钟。
倒置显微镜观察，均不得出现红细胞吸附现象。
【特异性抗体测定】生产企业应根据血清的使用对象确定测定的抗体种类，测定方法采用中和抗体测定法，如有适用的的ELISA方法，也可采用。
如用于生产口蹄疫疫苗的血清不得含有口蹄疫病毒抗体，用于生产猪瘟疫苗的血清不得含有BVDV抗体等。
【细菌内毒素测定】用凝胶法或细菌内毒素检测仪测定，按照鲎试剂或内毒素检测仪操作程序测定，每毫升血清的内毒素含量应低于10 EU。
【细胞增殖试验】取生长良好的Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，弃营养液，用无血清MEM配成每毫升30万～50万细胞悬液，计数细胞后，用无血清MEM在96孔细胞板上作1:200、1:400、1:800、1:1600稀释，每稀释度加8孔，每孔0.1ml，每孔再分别补加0.1ml含20%标准血清或20%被检血清MEM营养液，置5％CO2培养箱37℃培养至48小时，倒置显微镜下计数，取每孔克隆数均在30～50之间的稀释度的8个孔，求和计为总克隆数。
动物血清的区分比较与作用
动物血清的区分比较与作用血清主要作用是提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞起到某些保护作用。
由于血清来源于动物，且含有细胞培养中所需的各种营养（血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等），这奠定了血清是细胞培养实验中最pu遍的试剂的基础。
市面上的牛血清产品名称虽然五花八门，但根据其不同的特性，追其根本，但大致可分为以下四种。
根据牛的取血年龄可以区分：胎牛血清（Foetal Bovine Serum，简称FBS）指的是取自未出生，母牛剖腹心脏穿刺采血得来的血清。
国产胎牛血清（并无明确定义，但通常用此命名）指的是出生4-6小时，且未进行哺乳（unsuckled）进食的新生牛，有时还称作国产新生牛血清。
适用于常规细胞培养、细胞株保存和单抗研制等方面。
新生牛血清（Newborn Calf Serum，简称NBCS，或称小牛血清）指的是出生14天-3个月进行取血的牛血清。
适用于培养或对环境要求低的细胞。
成年牛血清（Adult Bovine Serum，简称ABS）指的是取血时牛龄通常超过12个月的牛血清。
适用于多种动物体外培养，包括：克隆细胞、单层细胞、悬浮细胞等。
以上取血牛龄的差异主要是受当地国家畜牧业的发展及法规限制影响，因为牛血多为畜牧业副产业，并未有专门为取血而养的牛。
几种血清的比较：提取血清体积/只牛：成年牛血清(5-8L) > 小牛血清(2L) > 国产胎牛血清(1L) > 胎牛血清(0.5L)培养细胞的效果：胎牛血清> 国产胎牛血清> 小牛血清> 成年牛血清价格：胎牛血清> 国产胎牛血清> 小牛血清> 成年牛血清这几种不同牛龄血清所含的促细胞生长因子、促贴附因子、激素及其他活性物质等组分与比例不同。
常规来说，年龄越小的牛血清，细胞培养效果越好。
实验室血清学常用检测方法
常用血清学检测方法介绍一、酶联免疫吸附试验诊断技术目前，该项技术已在兽医学上得到广泛的应用，大多数动物传染病都已经研制成ELISA检测方法。
1、酶联免疫吸附试验的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。
此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
2、ELISA的类型根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
用于动物疫病检测的ELISA主要有以下几种类型：①.双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法。
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质、微生物病原体第二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
例如猪瘟病毒检测ELISA、禽流感病毒抗原捕获ELISA，就是根据这种原理设计的。
②.双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似。
用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。
与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。
乙肝HBs的检测常采用本法。
本法关键在于酶标抗原的制备，需要根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于于间接法。
此外，该方法不受被检动物种属差异的限制。
③.间接法测抗体间接法是检测抗体常用的方法。
其原理为利用酶标记的抗体（抗免疫球蛋白抗体），检测与固相抗原结合的受检抗体（见图1）。
新生牛血清 药典标准
新生牛血清药典标准新生牛血清是一种重要的生物制品原料，广泛应用于医药、保健品、生物技术等领域。
为了保证新生牛血清的质量和安全性，制定了一系列的药典标准，以规范其生产和使用。
本文将对新生牛血清的药典标准进行介绍，希望能够对相关行业人士有所帮助。
首先，新生牛血清的药典标准主要包括对其生产过程、质量指标、储存条件等方面的规定。
在生产过程中，必须符合相关的生产规范和操作流程，确保产品的纯度和活性。
质量指标方面，主要包括对蛋白质含量、内毒素水平、微生物菌落等指标的要求，以及对可能存在的有害物质的限量标准。
此外，新生牛血清在储存和运输过程中，也有一系列的条件要求，以确保其在使用前的质量稳定性。
其次，新生牛血清的药典标准是根据国际上的相关规定和标准进行制定的，以确保其在国际贸易中的通用性。
这些标准的制定是经过了广泛的讨论和专家的审查，具有很高的权威性和科学性。
因此，符合药典标准的新生牛血清可以更好地满足国际市场的需求，提升产品的竞争力。
再者，新生牛血清的药典标准对于生产企业和使用单位都具有重要的指导意义。
对于生产企业来说，遵循药典标准可以帮助其建立健全的质量管理体系，提高产品质量，降低生产风险。
对于使用单位来说，选择符合药典标准的新生牛血清可以更好地保证实验结果的准确性和可重复性，降低实验风险，提高工作效率。
最后，新生牛血清的药典标准是一个动态的过程，随着科学技术的发展和行业的需求，会不断地进行修订和更新。
因此，生产企业和使用单位都需要密切关注最新的药典标准，及时调整生产和使用的相关流程，以确保产品的质量和安全性。
总之，新生牛血清的药典标准对于保证产品质量和安全性，提升产品竞争力，促进行业健康发展具有重要的意义。
希望本文对相关行业人士有所帮助，也希望大家能够共同遵守药典标准，共同推动新生牛血清行业的发展。
新生牛血清病毒检测血吸附法
血吸附法检测新生牛血清病毒1原理有些病毒在其敏感宿主细胞中增殖，并不引起细胞病变，但在细胞表层存在病毒蛋白质，用一定百分比的红细胞悬液覆盖细胞表面，置于不同温度条件下一定时间，显微镜下观察，即可出现红细胞被吸附的现象。
血吸附法的技术主要特点是:敏感性高、速度快、成本低。
主要缺点是:病毒特异性检查问题尚未解决，结果判定的客观性较差，是间接检查病毒存在的方法，技术程序也还比较陈旧。
该方法首先使用无病毒血清对实验用Vero细胞进行培养增值，然后分别制备阴性供试品、阳性供试品以及待测试供试品。
取两瓶细胞，分别加入供试品。
然后在适宜的条件下处理，然后观察实验结果。
2材料和方法2.1材料2.1.1病毒牛副流感病毒。
2.1.2细胞Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)：购自中国生物制品检定所；2.1.3试剂无病毒污染的新生牛血清：阴性对照品使用；MEM培养基：细胞基础培养基；0.85%生理盐水：洗脱血细胞；胰蛋白酶：消化细胞；鸡血；豚鼠血。
2.1.4仪器设备①专门的病毒实验室：生物安全柜(CBK一DZOI)操作，符合国家生物安全要求；②洁净工作台；③倒置显微镜；④冰箱；⑤离心机；⑥离心瓶、注射器、吸管。
2.1.5阳性病毒将牛副流感病毒在Vero细胞上连续传代至病毒滴度为5.0lgCCID50/ml以上时进行合并，分为若干批，零下70℃冻存，作为阳性病毒对照液。
2.2方法2.2.1细胞制备以细胞密度为2~3×105/mL的Vero细胞，接种到适宜的细胞培养瓶后置于37℃培养箱培养，每天镜下观察细胞的分裂增殖情况，并记录形成良好单层的时间(镜下观察细胞生长成片率达90%以上为良好单层)。
注意将制备的细胞及时进行编号和标注，以免造成混淆。
2.2.2红细胞悬液配制取体重300一500g豚鼠，心脏采血2一3mL放入内含3一5mL生理盐水的离心管中，盖栓、轻摇。
豚鼠血加入生理盐水洗三次，800一1000转/分钟离心10一15分钟，压积血球，备用。
新生牛血清检测要求
附录ⅩIII D新生牛血清检测要求本品系从出生14小时内未进食的新生牛采血分离血清，经除菌过滤后制成。
牛血清生产过程中不得任意添加其他物质成分。
新生牛血清用于生产前应逐批进行以下检查，并应符合规定。
蛋白质含量应为3.5%～5.0%（附录ⅥB第一法）。
血红蛋白用氰化高铁法或其他适宜的方法测定。
应不高于0.02%。
大肠杆菌噬菌体采用噬斑法和增殖法检测。
不得有噬菌体污染。
摩尔渗透压（指标待定）无菌检查依法检查，应符合规定（附录ⅫA）。
支原体检查依法检查，应符合规定（附录ⅫB）。
细菌内毒素检查应不高于10EU/ml（附录ⅫE 凝胶限量试验）。
病毒检查1. 细胞培养法（1）非血吸附病毒检查将新生牛血清供试品分别接种到人源（如人二倍体细胞）、猴源（如Vero细胞）以及牛肾传代细胞三种细胞，采用的牛肾传代细胞系应证明无牛病毒的污染。
每种细胞至少接种6瓶，每瓶细胞悬液接种量不少于培养液总量的25%。
于36±1℃培养21天。
接种的每种细胞都应同时设立牛血清阴性对照和病毒阳性对照，（阴性对照用牛血清应证明无牛病毒污染）。
培养过程中可根据细胞生长情况更换细胞培养液，每次更换培养液前应观察（肉眼/显微镜）有无细胞病变出现。
培养到期后，阴性对照应无任何细胞病变出现，阳性对照应出现典型的细胞病变，试验成立。
供试品检查应不出现任何细胞病变为阴性，符合要求。
（2）血吸附病毒检查将上述接种供试品的每种细胞取2瓶进行血吸附病毒检查。
用0.2%~0.5%鸡和豚鼠红细胞混合悬液覆盖于细胞表面，置2~8℃分钟，然后置20~25℃30分钟，分别进行镜检，观察红细胞吸附情况，供试品检查结果均应为阴性。
试验同时应设立血吸附阳性对照。
2. 免疫荧光抗体检查法采用直接或间接免疫荧光抗体检查法，至少应对牛腹泻病毒，牛腺病毒、牛细小病毒、呼肠孤病毒、狂犬病病毒以及牛副流感病毒进行检查，结果均应为阴性。
支持细胞增殖检查用Sp2/0 -Ag14或适宜的非贴壁传代细胞进行。
浅论新生牛血清病毒检测
2017年第04期近年来,生物制品在生产以及应用方面取得了不小的进展,与社会生活的联系也愈发紧密。
由于新生牛血清中病毒来源广、种类多,因此针对新生牛血清的病毒检测十分必要。
本文通过研究新生牛血清病毒检测的特点和概况,简要分析了常用的病毒检测方法,以期提高牛血清中病毒的检出率,提高我国生物制品质量以及行业水平。
1新生牛血清病毒检测概况新生牛血清指的是在一段时间未进食的牛身上经过采血以及除菌过滤后制成的血清,常用于疫苗以及单克隆抗体的制备,是影响生物制品质量的关键因素。
尽管新生牛血清由于个体差异性导致质量参差不齐,但仍是细胞培养的关键,决定着生物制药工业化的整体进程。
现今生产新生牛血清的企业众多,为了统一品质,国家出台了相关政策和规范,加大了监管力度,力求从源头上控制牛血清中的病毒,保证原材料质量。
获得新生牛血清的最佳时机应为胎牛的下一时期,即血液循环系统刚刚完成的新生期,这时牛通常为8个月大,牛血清质量较高。
除了对新生牛的选择,采血过程也十分重要。
由于采血源众多,因此需要时刻注意新生牛体内抗体等的变化,其次,采血室及采血过程应时刻保持洁净,且保证新生牛血清在采血前后无菌环境下的保存。
对采血车间设计以及操作规范,我国在相关条例中都有明确的要求,确保新生牛血清的产品质量。
新生牛血清的病毒通常为4种,能够引起生物体的不同病变。
(1)牛细小病毒,常发生于我国从国外引进种牛的地区,是一种接触性传染病。
(2)狂犬病病毒,感染狂犬病病毒的动物常表现为极度兴奋和狂躁,病死率高,且由于该种病毒可感染所有温和动物,因此对于疫苗生产的危害极大。
(3)牛副流感病毒是通过感染牛体,引起呼吸道疾病的一种病毒,多发于欧美等国家。
(4)牛腹泻病毒是目前较为严重的外源性病毒,其极高的抗体检出率以及感染持续性严重危害着动物以及婴幼儿的健康,受到全世界的广泛重视。
我国对新生牛血清病毒的检测从牛体到检测过程都有明确的要求。
包括要求新生牛牛龄,多种病毒检测类目,如牛腹泻病毒阴性,以及支原体、大肠杆菌噬菌体,各类蛋白如血红蛋白等的含量检测,此外,细胞生长曲线以及倍增时间也纳入到了牛血清质量检查范围中。
血清吸附实验报告
1. 了解血清吸附实验的基本原理和操作方法。
2. 掌握血清蛋白的分离和纯化技术。
3. 分析实验结果，评估血清蛋白的吸附效果。
二、实验原理血清吸附实验是利用吸附剂对血清蛋白的特异性吸附作用，将血清蛋白从血清中分离出来。
本实验采用活性炭作为吸附剂，活性炭具有较大的比表面积和良好的吸附性能，能够有效地吸附血清蛋白。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 人血清样本- 活性炭- 0.1mol/L pH 7.4 PBS缓冲液- 0.1mol/L pH 4.0 PBS缓冲液- 0.1mol/L pH 8.0 PBS缓冲液- 10% SDS-PAGE凝胶- 蛋白质Marker- 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、SDS等试剂2. 实验仪器：- 高速离心机- 紫外可见分光光度计- 电泳仪- 凝胶成像系统- 烧杯、试管、移液器、剪刀等实验器材1. 活性炭预处理：将活性炭用0.1mol/L pH 7.4 PBS缓冲液洗涤，去除杂质，然后用0.1mol/L pH 4.0 PBS缓冲液浸泡过夜。
2. 血清蛋白吸附：取一定量预处理后的活性炭，加入人血清样本，在室温下搅拌吸附1小时。
3. 洗脱：用0.1mol/L pH 8.0 PBS缓冲液将吸附有血清蛋白的活性炭进行洗涤，收集洗涤液，检测蛋白含量。
4. 蛋白质电泳：取一定量洗涤液，加入10% SDS-PAGE凝胶，进行SDS-PAGE电泳。
5. 结果分析：观察SDS-PAGE电泳结果，分析血清蛋白的吸附效果。
五、实验结果与分析1. 吸附效果：通过SDS-PAGE电泳结果可以看出，活性炭对血清蛋白具有较好的吸附效果，能够有效地将血清蛋白从血清中分离出来。
2. 蛋白质含量：通过紫外可见分光光度计检测洗涤液中的蛋白含量，发现活性炭对血清蛋白的吸附量较高。
3. 吸附特异性：通过改变pH值，观察活性炭对血清蛋白的吸附效果，发现活性炭对血清蛋白的吸附具有特异性，对其他蛋白质的吸附效果较差。
牛血清20150224文稿演示
加入4.5ml MEM培养液，细胞数 为多少？
思考2：
Cell增殖： 如果加入4.5ml MEM培养液计数 40万/ml。实际上是
否可以进行细胞增殖实验？ 细胞增殖条件： Sp2/0骨髓瘤细胞 ：细胞计数30万~50万/ml 其中0.5ml用于细胞计数，3ml传代，1ml进行实验。 实际操作是否符合药典相关规定？
内毒素检测原理
细胞增殖试验
Sp2/0骨髓瘤细胞 ：细胞计数30万~50万/ml 无血清MEM 96孔细胞板 1：200 1:400 1:800 1:1600 每个浓度加8孔，每孔100ul
思考1：
Cell计数： 同时复苏两管1.5ml同种、同批次、理论
上数量相同的细胞，相同条件下培养，连续 传三代。其中一个克氏瓶加入9ml MEM培养 液计数 20万/ml。另一个克氏瓶加入4.5ml EME培养液，理
蛋白质 多肽 血小板 激素
胰岛素促进细胞分裂 类胰岛素生长因子 促生长激素 促细胞增殖 氢化可的松 促细胞贴附和增殖
牛血清的功能
牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰 富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。
1.提供维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有 或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。
二．新生牛血清质量控制
性状 、无菌、支原体
淡黄色澄清稍粘稠的液体，无 溶血或异物 优质血清应为淡黄色，无溶血 ，半透明，较粘稠，无沉淀和悬 浮物的液体。 判断血清质量先从外观入手： 外观 颜色 粘稠度
无菌检验：应无菌生长 支原体检验：应无支原体生长
外源病毒
1、为什么要检测外源病毒？ 2、牛血清可能携带哪些外源病毒？ 3、检测方法？ VERO/BHK21/PK15/牛睾丸细胞单层 血清含量10% 的MEM培养基 不得出现荧光红细胞吸附 内控PCR：FMDV、BPIV-3、 BcoV、
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血吸附法检测新生牛血清病毒
1原理
有些病毒在其敏感宿主细胞中增殖，并不引起细胞病变，但在细胞表层存在病毒蛋白质，用一定百分比的红细胞悬液覆盖细胞表面，置于不同温度条件下一定时间，显微镜下观察，即可出现红细胞被吸附的现象。
血吸附法的技术主要特点是:敏感性高、速度快、成本低。
主要缺点是:病毒特异性检查问题尚未解决，结果判定的客观性较差，是间接检查病毒存在的方法，技术程序也还比较陈旧。
该方法首先使用无病毒血清对实验用Vero细胞进行培养增值，然后分别制备阴性供试品、阳性供试品以及待测试供试品。
取两瓶细胞，分别加入供试品。
然后在适宜的条件下处理，然后观察实验结果。
2材料和方法
2.1材料
2.1.1病毒
牛副流感病毒。
2.1.2细胞
Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)：购自中国生物制品检定所；
2.1.3试剂
无病毒污染的新生牛血清：阴性对照品使用；
MEM培养基：细胞基础培养基；
0.85%生理盐水：洗脱血细胞；
胰蛋白酶：消化细胞；
鸡血；
豚鼠血。
2.1.4仪器设备
①专门的病毒实验室：生物安全柜(CBK一DZOI)操作，符合国家生物安全要求；
②洁净工作台；
③倒置显微镜；
④冰箱；
⑤离心机；
⑥离心瓶、注射器、吸管。
2.1.5阳性病毒
将牛副流感病毒在Vero细胞上连续传代至病毒滴度为5.0lgCCID50/ml以上时进行合并，分为若干批，零下70℃冻存，作为阳性病毒对照液。
2.2方法
2.2.1细胞制备
以细胞密度为2~3×105/mL的Vero细胞，接种到适宜的细胞培养瓶后置于37℃培养箱培养，每天镜下观察细胞的分裂增殖情况，并记录形成良好单层的时间(镜下观察细胞生长成片率达90%以上为良好单层)。
注意将制备的细胞及时进行编号和标注，以免造成混淆。
2.2.2红细胞悬液配制
取体重300一500g豚鼠，心脏采血2一3mL放入内含3一5mL生理盐水的离心管中，盖栓、轻摇。
豚鼠血加入生理盐水洗三次，800一1000转/分钟离
心10一15分钟，压积血球，备用。
取一年龄以上来享公鸡，翼下静脉采血2一3mL放入内含3一5mL生理盐水的离心管中，盖栓、轻摇。
鸡血加入生理盐水洗三次，800一1000转/分钟离心10一15分钟，压积血球，备用。
按比例吸取鸡血球和豚鼠血球，用0.85%生理盐水配制成0.2一0.5%鸡豚红细胞混合悬液备用。
2.2.3供试品检测
取培养到期的接种供试品的每种细胞2瓶，观察细胞病变，细胞形态。
弃培养液，用生理盐水洗三次，加入鸡红细胞和豚鼠红细胞混合悬液5一10mL/瓶，覆盖细胞表面，置2一8℃作用30分钟，然后再置作用20一25℃作用30分钟，弃掉红细胞悬液，用生理盐水反复洗三次，显微镜下观察。
2.2.4阴性对照品制备
用无病毒污染的小牛血清替代供试品，同法操作，作为阴性对照。
2.2.5阳性对照品制备
将按照2.1.5方法将制备好的牛副流感病毒稀释液体，将病毒液稀释至100一240CCID50/mL，然后污染经过56℃灭活处理的新生牛血清，用含有病毒污染的小牛血清替代供试品，同法操作，作为阳性对照。
2.3结果
阳性对照应出现血细胞吸附。
供试品检查不出现血细胞吸附为阴性，判定合格。
供试品检查出现血细胞吸附，判定不合格。
附注：
牛副流感病毒为典型的血吸附病毒，因此利用血吸附法对病毒的存在与否进行确认。
副流感病毒中的HA可以促使动物红细胞的聚集，根据聚集情况判定病毒的存在或者判定病毒的滴度。
副流感病毒有一定的致病性因此在实际的操作中应特别注意实验人员的安全防护。
并且应在实验操作前应进行病毒滴度检测，最终的病毒滴度实验浓度应控制在200CCID50左右，但应注意所采取的方法也应为血吸附法，根据血细胞沉淀来判断该病毒的滴度而不是根据细胞的病变情况来确定，因为该病毒为胞内病毒，其对细胞的病变情况可能不是特别典型和明显。
阴性对照实验的选择同样需要对牛血清进行热灭活处理，副流感病毒对温度较为敏感，在常温条件下暴露时间过长也会影响细胞的正常培养，因此阴性新生牛血清的选取可以选择经过56℃灭活的新生牛血清作为基础培养血清和阴性对照血清，同样也可以选取经过培养无特异微生物的合格新生牛血清。
而在热灭活也会给新生牛血清带来负面的影响，在较热条件下新生牛血清的加热会导致血清中沉淀，会严重影响血吸附实验的结果判定，应需要在实际的实验操作中加以重视。
供试品的冻融次数对牛副流感病毒的影响较大，在实际的操作中由于新生牛血清反复冻融次数过多会对病毒的生长带来一定的影响，从而对病毒的检出率也有很大的影响，一般情况下供试品冻融的次数不能多余8次，否则就会对供试品中牛副流感病毒的判定产生偏差，并且还会对其他新生牛血清的使用者带来不必要的麻烦，造成较大的浪费和损失。
由于牛副流感病毒对温度的敏感性较强，因此在供试品制备实验中应尽量避免高温条件以及其他化学试剂的污染，而且在操作过程中应尽快的完成整个实验操作，避免可能存在的病毒由于长时间暴露而使活性降低。
在实际的新生牛血清保存中是放置在零下20℃的条件下进行保存，在此条件下牛副流感病毒会处于休眠的状态，所以仍然存在在实际使用过程中污染的可能。