1酵母产胞外酶验证试验方案
酵母菌表面展示实验的生物学处理步骤
酵母菌表面展示实验的生物学处理步骤酵母菌表面展示实验是一种常用的生物学实验方法，用于研究酵母菌表面显示的外源蛋白质或多肽。
这种表面展示技术可以用于表征蛋白质的功能和相互作用，以及开发新的药物和疫苗。
以下是酵母菌表面展示实验的生物学处理步骤：1. 酵母菌培养：选择适当的酵母菌菌株，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
在合适的培养基中培养菌株，保持其生长状态。
2. 基因构建：设计和构建表达目标蛋白质的基因，包括信号序列、结构域和适当的限制性内切酶位点等。
将目标基因插入表达载体中。
3. 转化：将表达载体导入酵母菌细胞。
盗窃菌株进行化学转化或电转化，使目标基因能够在菌株中稳定复制。
4. 选择性培养：将转化后的酵母菌接种在含有适当抗生素的培养基上，通过抗生素的选择筛选出携带目标基因的酵母菌细胞。
5. 鉴定：通过PCR、Western blot等技术对转化后的酵母菌进行鉴定，确认目标基因是否成功表达。
这些技术可以检测目标基因在酵母菌细胞中的表达量和蛋白质的大小。
6. 培养和表达：将含有目标基因的酵母菌培养在液体培养基中。
适当调节培养条件，如温度、搅拌速度和培养时间等，以促进目标蛋白质的表达。
7. 表面展示处理：通过靶标分析文库的方式，筛选出能够与目标基因编码的蛋白质相互作用的配体。
将筛选出的配体连接到目标蛋白质的C端，使其能够在酵母菌表面进行展示。
8. 细胞金属处理：将酵母菌培养至适当阶段，添加适量的离子金属（如锌、铁等），以促进目标蛋白质的稳定性和正确的折叠。
9. 酵母菌表面展示鉴定：使用适当的鉴定方法，如流式细胞术、酵母细胞表面ELISA和荧光显微镜等，定量和定性分析目标蛋白质在酵母菌表面的展示情况。
10. 应用研究：通过进一步的研究，如蛋白质功能分析、酵母菌互作网络构建和药物筛选等，探索酵母菌表面展示实验的应用前景。
总结：酵母菌表面展示实验是研究蛋白质功能和相互作用的重要工具。
酵母工艺与生产 化验室检验操作规程
目录一、原辅材料的分析(一)糖蜜及糖质原料分析1、锤度2、灰分3、总糖4、还原糖5、色度7、胶体物质（二）化工原料分析1、硫酸铵2、尿素3、磷酸氢二铵4、硫酸5、纯碱（三）土豆淀粉的分析1、水分的测定2、灰分的测定3、蛋白质的测定4、斑点的测定5、细度的测定（四）乳化剂的分析1、酸值的测定2、皂化值的测定3、羟值的测定二、生产过程中的分析（一）纯种培养种子分析1、糖度2、酸值与PH3、残余还原糖4、酵母湿重5、酵母成熟标准的确定（二）流加糖分析1、非发酵性还原物质和可发酵性糖的测定2、可发酵性氮（三）发酵液分析三、酵母成品分析1、水分分析2、灰分分析3、酸度分析4、蛋白质分析5、五氧化二磷分析6、海藻糖分析7、发酵力（高糖、低糖、无糖）分析8、粗脂肪分析四、酵母生产废水的测定1、总固形物2、酸度的测定3、化学需氧量一、原辅材料的分析（一）糖蜜及糖质原料分析一、锤度1．仪器：比重计、糖度计2．操作步骤：将200g糖蜜与等重量的蒸馏水均匀混合，调节温度至20℃，补加蒸馏水至总重正好为糖蜜重量的2倍，测定温度。
将测定值（Bg或°Bx）乘以因子2即得未稀释糖蜜的密度。
糖蜜检测中视检测糖蜜的浓度，若浓度高，则还可稀释，如100g糖蜜加水至400g，这样测量值应乘以4。
由于密度和温度相关，所以表示密度应在标准温度下，即在20℃情况下，高于或低于此温度，均要加一个修正值。
二、灰分1．仪器：分析天平（0.1mg）、坩埚（30mL）、马弗炉（800℃）、本生灯、干燥器等2．试剂：浓硫酸（AR）3．操作步骤：（1）先把干净的坩埚放在800℃高弗炉中保温15min，取出冷至 200℃左右后放在干燥器中冷却至室温。
（2）对冷却的坩埚称重，精确至0.1mg，然后称取3.0g的糖蜜。
（3）在糖蜜中加入0.5mL浓硫酸，水平振荡仪上振荡混合，使硫酸和糖蜜充分混合。
（4）用本生灯把糖蜜烧成灰烬，注意调节本生灯火焰温度，防止杯中糖蜜起泡。
酵母菌表面展示实验操作步骤简介
酵母菌表面展示实验操作步骤简介酵母菌表面展示实验是一种常用的实验方法，用于研究酵母菌表面展示的蛋白质。
这些蛋白质可以通过遗传工程技术，将目标蛋白质与酵母菌表面蛋白质基因进行融合，从而使目标蛋白质在酵母菌细胞表面展示，并且能够通过特定的检测方法进行定量和定性的分析。
以下是酵母菌表面展示实验的操作步骤简介：1. 培养酵母菌菌株：选择适当的酵母菌菌株，如常用的酵母菌株Saccharomyces cerevisiae。
使用含有适当营养物质和抗生素的培养基培养酵母菌菌株，确保菌株的生长和健康状态。
2. 载体构建：将目标蛋白质基因与酵母菌表面蛋白质基因进行融合，构建一个含有目标蛋白质基因的表达载体。
此步骤可以通过基因重组技术、PCR扩增、限制性内切酶酶切等方法完成。
3. 转化酵母菌：将构建好的表达载体转化至酵母菌中，使酵母菌细胞内含有目标蛋白质基因。
转化可以使用化学方法、电穿孔法、电极法等。
4. 选择性培养：将转化后的酵母菌接种至含有适当选择性抗生素的培养基中，这可以帮助筛选出含有目标蛋白质的酵母菌细胞。
5. 鉴定表达：通过Western blot、免疫荧光染色、流式细胞仪等方法检测酵母菌表面是否成功展示目标蛋白质。
这些方法可以帮助确定目标蛋白质是否成功表达以及表达的量和稳定性。
6. 表面展示检测：使用特定的探针或抗体，对酵母菌表面的目标蛋白质进行检测和定量。
这可以帮助研究者了解目标蛋白质在酵母菌细胞表面的展示情况，并评估展示效果的高低。
7. 功能研究：利用目标蛋白质在酵母菌表面展示的特性，进行后续的功能研究。
这可以通过适当的实验方法和技术，如酵母两杂交、酵母表面亲和实验、酵母表面分子相互作用等，来研究目标蛋白质与其他分子之间的相互作用和功能。
8. 数据分析和解释：将实验获得的数据进行统计分析和解释。
根据实验结果，得出相关结论，并进行后续实验设计和研究方向的确定。
总结：酵母菌表面展示实验是一种重要的实验方法，可用于研究酵母菌表面展示的蛋白质。
酵母实验操作方案(2)
酵母实验操作方案（2)附录一培养基LB：Tryptone 10g 1%Yeast Extract 5g 0.5%NaCl 5g 0.5%【Agar】 15g 1.5%（固体培养基另加）dH2O稀释至1L，高压灭菌YPD：Yeast Extract 10g 1%Peptone 20g 2%【Arga】 20g 2％（固体培养基另加）dH2O 900ml 高压灭菌，冷却至60度，加10×Dextrose 100mlYPD－G418：250ml YPD加10×Dextrose后加适量G418，注意轻摇混匀，不要产生气泡，同时留空白对照板。
终浓度（mg/ml） 1.0 2.0 3.0 4.0G418储液体积（ml） 2.5 5.0 7.5 10.0MD：YNB 3.4g 0.34%【Sorbitol】 182.2g 1M【Agar】 15-20g 1.5%-2%dH2O 800ml高压灭菌，冷却至60度，加10×(NH4)2SO4 100ml 1%500×biotin 2ml 4×10－5％10×Dextr ose 100ml 1％MGY：YNB 3.4g 0.34%dH2O 800ml高压灭菌，冷却至60度，加10×(NH4)2SO4 100ml 1%10×Glycerol 100ml 1%500×biotin 2ml 4×10－5％BMMY：Yeast Extract 10g 1%Peptone 20g 2%YNB 3.4g 0.34%K2HPO4 3.013gKH2PO4 11.813g (PH6.0 缓冲液)dH2O 900ml高压灭菌，冷却至60度，加10×(NH4)2SO4 100ml 1%每次使用之前，分装后加2/1000体积500×biotin 2ml 4×10－5％连接产物的质粒转化1）－700C取出Top10感受态细胞，50ul/管，取出后迅速分装城10ul或2 0ul/管；2）冰浴30min；3）420C，30秒（精确计时），置于冰水1－2min；4）加等体积370C预热的SOC培养基；5）370C，225rpm，培养45min；6）100ul分别涂板，370C培养；。
酵母菌表面展示实验步骤与注意事项
酵母菌表面展示实验步骤与注意事项酵母菌表面展示实验是一种常用的生物学实验技术，通过将外源蛋白在酵母菌表面展示出来，可以用于研究蛋白质结构和功能，以及开发生物技术应用等领域。
本文将介绍酵母菌表面展示实验的步骤和注意事项。
一、实验步骤：1.菌种培养：首先，需要选择合适的酵母菌菌株进行实验。
常见的菌株有Saccharomyces cerevisiae等。
通过前期的菌种预培养和传代培养，确保菌株的纯度和生长状态。
2.构建表面展示载体：将目标蛋白基因与表面展示载体连接，并将构建好的载体导入酵母菌中。
其中，表面展示载体通常包括信号肽序列、连接序列和表面展示蛋白的表达和定位序列等。
3.表达融合蛋白：在含有表面展示载体的培养基中培养酵母细胞，促使表面展示载体进行表达。
根据不同的实验要求，可以选择不同的培养温度和培养时间。
4.检测表面展示：通过荧光显微镜观察酵母细胞表面展示的融合蛋白，并利用流式细胞术等方法进行定量分析。
根据实验需要，可以选择不同的检测方法，如免疫荧光染色、酶联免疫吸附实验等。
5.功能鉴定：通过酵母菌表面展示蛋白的功能鉴定，来进一步研究目标蛋白的功能和相互作用。
常见的功能鉴定方法包括酵母两杂交实验、亲和纯化、结构分析等。
二、注意事项：1.菌种选择：在实验前，需要根据实验的目的选择合适的酵母菌菌株。
不同的菌株对表面展示载体的表达和定位能力有所差异，需根据实验要求进行选择。
2.载体设计：合理设计表面展示载体的组成和序列，确保目标蛋白的正确表达和定位。
选择适当的载体启动子、信号肽序列和连接序列等，有助于提高表面展示效率和稳定性。
3.培养条件：酵母菌培养需要注意适宜的培养温度、培养基成分和培养时间等因素。
不同的菌株和表面展示载体可能对培养条件有不同的要求，需根据实验材料的要求进行优化。
4.检测方法选择：根据实验需求，选择适合的检测方法进行表面展示效果的检测和分析。
不同的方法有各自的优劣势，需结合实验要求进行选择。
产胞外脂肪酶菌株的筛选及底物测定
产胞外脂肪酶菌株的筛选及底物测定张 鹏1) 孟庆云2) 赵柳青*(1)北京化工大学化学工程学院,北京,100029;2)北京化工大学应用数理系,北京,100029)摘 要:文中采用简便快速的平板检测法,通过观察培养基上生长的菌落直径和其水解圈直径的大小,进行初筛。
再用液体培养,采用滴定法测定酶活性,进行复筛筛选出10株优良菌株。
活性最高为4.45×10-8mo l/s,其中D 6菌株以苏籽油、亚麻油和月见草油为底物,酶活性分别达到14.29×10-8mol/s,10.90×10-8mol/s 和11.35×10-8mol/s 。
关键词:胞外脂肪酶;菌种筛选;脂肪酶分类号:Q 556.1前 言脂肪酶(Lipase ,EC 3.1.1.3,甘油酯水解酶)是一种特殊的水解酶,其催化的反应是:甘油三酸酯+水 甘油二酸酯+游离脂肪酸 甘油酸酯+游离脂肪酸 甘油+游离脂肪酸。
脂肪酶只能在异相系统,即在油-水界面上作用,对水溶性底物无作用,这一点在有机合成中合成手性中间体方面具有很多的优越性。
脂肪酶的应用极其广泛。
例如作为乳化剂的单甘酯以往采用工业法生产,纯度低,成本昂贵,而利用青霉菌产生的“脂酶G ”生产的单甘酯纯度高,成本低[1]。
通常用化学催化剂金属钠或烷基醇钠来加快酰基在甘油酯分子间的迁移,但并无位置特异性,如用1,-3,-专一性脂肪酶催化时,酰基迁移限制在1,-3,-位上,可以生成化学法不能生产的特殊的甘油三酸酯混合物。
另外脂肪酶在皮革、纺织、医药及洗涤剂等行业也有着广泛的应用。
脂肪酶的研究始于胰脂酶,但由于其来源有限,故微生物脂肪酶的研究越来越受到重视。
要进行此类研究首先就要进行产脂肪酶菌株筛选,筛选的方法因应用对象、微生物种类、酶的特性而有所变化,但应着眼于准确、迅速、选择性强,并且易于自动化。
文中从长年与油脂接触的土壤中采样,先用平皿培养,并用Rhodamine B 显色,根据水解圈的情况进行初筛,用液体培养,滴定法测酶活性进行复筛,再利用苏籽油、亚麻油、鱼油和月见草油作为底物对筛选出来的菌株进行酶活性测定。
酵母活化测试实验报告
一、实验目的1. 了解酵母活化原理及其重要性。
2. 掌握酵母活化操作步骤。
3. 测试不同活化条件下酵母的活性。
二、实验原理酵母活化是指将休眠状态的酵母细胞恢复到正常生理活动状态的过程。
活化过程中，酵母细胞吸收水分、营养物质，使细胞膜通透性增加，细胞内酶活性提高，从而恢复其代谢和生长能力。
三、实验材料1. 耐高糖酵母粉（干酵母）2. 0.1%氯化钠溶液3. 1%葡萄糖溶液4. 1%蔗糖溶液5. 1%麦芽糖溶液6. 1%乳糖溶液7. 0.1%磷酸氢二钠溶液8. 0.1%磷酸二氢钠溶液9. 移液器10. 实验试管11. 恒温水浴锅12. 秒表13. 计数器四、实验步骤1. 准备活化溶液：将氯化钠溶液、葡萄糖溶液、蔗糖溶液、麦芽糖溶液、乳糖溶液、磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液分别置于实验试管中。
2. 称取1g干酵母粉，加入每个活化溶液中，充分搅拌均匀。
3. 将活化溶液放入恒温水浴锅中，调节温度至30℃，恒温培养30分钟。
4. 将活化后的酵母溶液取出，观察酵母细胞形态及活力。
5. 将活化后的酵母溶液稀释至适当浓度，涂布于平板培养基上，置于恒温培养箱中培养。
6. 观察并记录不同活化条件下酵母菌的菌落数。
五、实验结果与分析1. 酵母细胞形态及活力观察：在30℃恒温条件下，活化后的酵母细胞呈圆形，细胞壁完整，细胞内含物丰富，活力较高。
2. 酵母菌菌落数统计：在相同条件下，不同活化溶液中酵母菌的菌落数如下：- 氯化钠溶液：200个- 葡萄糖溶液：300个- 蔗糖溶液：250个- 麦芽糖溶液：350个- 乳糖溶液：220个结果表明，在30℃恒温条件下，葡萄糖溶液对酵母活化效果最好，其次是麦芽糖溶液和蔗糖溶液。
六、实验结论1. 酵母活化是恢复酵母细胞生理活动的重要过程，对发酵生产具有重要意义。
2. 在30℃恒温条件下，葡萄糖溶液对酵母活化效果最佳，其次是麦芽糖溶液和蔗糖溶液。
3. 本实验为酵母活化提供了参考依据，有助于提高发酵生产效率。
酵母样真菌体外抗菌活性检测报告
酵母样真菌体外抗菌活性检测报告发表时间：2010-06-02T08:32:45.140Z 来源：《中外健康文摘》2010年第4期供稿作者：陶萍[导读] 随着抗生素和细胞毒药物的广泛使用，导致真菌尤其是酵母菌的感染日益增多陶萍（湖北省荆州市第二人民医院湖北荆州 434020）【中图分类号】R978.5 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2010)04-0006-01【摘要】本文旨在了解临床常见真菌对常用抗真菌药物的敏感性，为临床使用抗真菌药提供依据；对试剂盒的质量与适用性进行评价。
【关键词】酵母样真菌药物敏感性试验随着抗生素和细胞毒药物的广泛使用，导致真菌尤其是酵母菌的感染日益增多，在免疫功能缺损者和AIDS患者中，真菌感染是最常见的并发症之一。
本文以法国生物梅里埃公司生产的ATB Fungus体外抗酵母菌药物敏感性试剂盒对临床分离的深部真菌予以试验研究，结果如下：1 材料和方法1.1实验菌株为近年来从临床送检的痰咽拭子（45株）、生殖道分泌物（31株）、血（2株）等样本中分离的菌株，其中白色念珠菌55株，热带念珠菌15株，光滑球拟酵母10株，克柔氏念珠菌2株，近平滑念珠菌1株，高里氏念珠菌5株，未定型3株。
1.2 ATB Fungus试剂盒成分该试剂盒具有32个孔的塑料条，含6种抗真菌剂，即5—氟胞嘧啶（5—FC）、两性霉素B（AmB）、制霉菌素（NYS）、咪康唑（MIZ）、益康唑（ECO）和酮康唑（KET）。
药物共占22孔，塑料条的前、中、后共有10孔为不含药的生长对照孔。
1.3标准参照株白色念珠菌ATCC90028为中科院皮肤病研究所馈赠。
1.4培养基 ATB Fungus试剂盒带有ATBF半液体培养基，实际上就是酵母氮源基础加天冬酰胺和葡萄糖培养基。
1.5缓冲液称取含3个结晶水的磷酸氢二钾157.5g，加水至100ml溶解pH9.8～10.0的缓冲液。
1.6方法按ATB Fungus操作指南进行菌液制备及接种。
酵母菌表面展示操作步骤的基本操作流程
酵母菌表面展示操作步骤的基本操作流程酵母菌表面展示是一种常用的基因工程技术，可以用于研究蛋白质的表达与功能。
本文将介绍酵母菌表面展示的基本操作步骤，包括酵母菌培养、基因克隆、表达构建、转化酵母菌以及表面展示检测。
步骤一：酵母菌培养首先，准备酵母菌培养基配方。
常用的培养基包括YPD培养基（1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂）、SD培养基（0.67%酵母氮碱、2%葡萄糖、2%琼脂）等。
将培养基配制好后，通过自动消毒器进行高压灭菌处理。
步骤二：基因克隆选取目标基因进行扩增。
使用PCR方法将目标基因扩增出来，并将其与表达载体连接。
将载体构建好后，通过酵母菌的转化实验，将重组质粒导入酵母细胞中。
步骤三：表达构建将克隆好的基因插入酵母菌的表达载体中，构建酵母菌的表达载体。
常用的表达载体有pYES2、pPICZ、pADH、pAF等。
构建好表达载体后，用化学方法或电穿孔法将其转化到酵母细胞内。
步骤四：转化酵母菌将构建好的表达载体通过酵母细胞的转化实验导入酵母细胞内。
常用的转化方法有酵母细胞法、酵母原生质体法、酵母质粒法等。
转化方法的选择取决于酵母菌的基因型和表达载体的特性。
步骤五：表面展示检测在酵母细胞表面展示目标蛋白质后，需对其进行检测。
常用的检测方法有荧光检测、免疫检测、酶标记检测等。
通过这些检测方法，可以确定目标蛋白质是否成功地表面展示在酵母细胞上。
总结：酵母菌表面展示技术是一种常用的基因工程技术，广泛应用于蛋白质的表达与功能研究。
本文介绍了酵母菌表面展示的基本操作流程，包括酵母菌培养、基因克隆、表达构建、转化酵母菌以及表面展示检测。
这些步骤的完成需要精确的操作和耐心的实验过程，但通过熟练的技术和正确的实验方法，可以成功地实现目标蛋白质在酵母细胞表面的展示，并进一步用于功能研究以及其他相关研究领域。
酵母样真菌胞外酶法快速鉴定可信度的评价
・
・１９・ ７
论著 ・
酵 母样 真 菌胞 外 酶 法 快 速鉴 定， ， 青 。李 ， 斌 张 惠 中 ，
７０ ３ ） １０ ８ （ 第四军医大学唐都 医院 ：． １ 临床 实验 检验科 ，． ２ 小儿科 ， 陕西 西安
ｍｕｉｅ ｂｏ ｈ ｍｉｔｙ Ｒ ｅ ｕｌｓ： ｅ ｉｅ ｔ ａｉｎ ｒｓ ｌ ｆｙ ａｔ—ｌ ｅ ｆｎ ｕ ０ｔｒｄ ｉ ａ ０ ｍｕ ｄ ｘｍｓ ｄｕ ｂ ｐｄ Ｙｅ ｓ Ｉ ｈ ｄ ｔｎ ｉｃ ｅ ｓｒ ． ｓ ｔ Ｔｈ ｄ ｎｉ ｔ ｅ ｕｔ ｏ ｅ ｓ ｃ ０ ｓ ｉ ｕ ｇ ｓ ｆｓｅｅ ｎ Ｓ ｈ ｕ ｄ ｋ ｅｔ ｅ ｍｅ ｉｍ ｙ Ｒａ ｉ ａ ｔ Ｄ ａ
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基， 对其它培养基鉴定结果 的可信度低 。 关键词 酵母样真菌 ； 培养基 ； 外酶 ； 胞 快速鉴 定板 Ｒ４ ６ ５ ４ ． 文献标 识码 Ａ 文章编号 １０ ０ ８ （ ０ ９ ０ ０ ７ ０ ０ ４— １８ ２ ０ ） ２— １９— ３ 中图分类号
啤酒酵母S-1产胞外多糖发酵条件的研究
期
酒 酵母 ｓ －１菌 株 产 胞 外 多 糖 的 发 酵 条 件 ， 包 括 碳 源 的 利 用 、 碳 源 的 浓 度 、培 养 基 起 始 ｐ Ｈ、 发 酵 温 度 、发 酵 时 间及 菌 体 生 物 生 长 量 与产 糖 关 系 等 方
７ ２ 型 光 栅 分 光 光 度 计 、 ＨＨ． １５ ０ 恒 温 培 ２ Ｂ１ ． ０
养 箱 、 ７ －２型 电 热 干 燥 箱 、 ＹＸＱ 、 Ｓ ０１ Ｇ４６． ０型 手 ２８
提 式 煤 电 两 用 高 蒸 汽 消 毒 器 、 Ｈａｅ Ｃ－１ Ｏ Ｂ 冰 ｉｒ Ｂ － Ｉ
酵 母 浸 出 汁 、蛋 白胨 、牛 肉 膏 、蔗 糖 、甘 露 醇 、
苯 酚 、 葡 萄 糖 、 三 氯 甲 烷 、 正 丁 醇 、 Ｄ一果 糖 、 Ｄ一 木 糖 、 棉 － 糖 、 甘 油 、 麦 芽 糖 、硫 酸 钾 、硫 酸 铵 、 Ｔ － 乳 糖 、磷 酸二 氢钾 。
１２． ． ． １２ 试剂
Ｅ ｐｒ ｘ ｅ ｉ ｎ ａ ｐ ｔ ｍｅ ｔ ｌ Ｒｅ ｏｒ ｓ＆ Ｔｈ ｏ ｅ ｉａ ｓ ａ ｃ ｅ ｅ ｒｔ ｌ ｃ Ｒｅ ｅ ｒ ｈ ｓ
一啤 删
／
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中 图 分 类 号 ：Ｔ ２ １１ Ｓ６ ．１
文 献 标 识 码 ：Ａ ｄ ｉ ０３ ６／ｉ ｎ１０ － ８ ２ １．１ ０ ｏ：１ ． ９ ．ｓ． ７ ７７ ． ０１． ８ ９ ｊｓ ０ １ ０ ０
于 ｌＯ 容 瓶 中 ， 并 摇 匀 ，备 用 ；
【 收稿 日期】 ２ １— ０ １ ００ １—９ 【 作者简介】 王小万 ，女 ，毕业于辽宁 师范大学生命科学学 院，大连理工大学在读硕士研究生 ，现 阶段研究方 向为蛋 白质与酶工程。
纯化水细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证方案及报告
纯化水细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证方案及报告文件编号：**VP*****-*文件类别：验证***********公司验证方案批准验证小组人员名单目录1、引言 (5)2、验证参与部门及责任 (5)3、验证方法 (5)文件要求 (6)菌种 (6)菌液制备 (7)验证方法 (7)验证结果 (8)4、结果判断 (10)5、验证结论及评价 (11)6、验证报告批准书 (12)1.引言1.1概述微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证和控制菌检查方法的验证。
进行上述验证前，应首先对验证过程中使用的仪器、仪表及微生物限度检查的环境进行验证。
微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。
除另有规定外，细菌培养温度为30-35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23-28℃；控制菌培养温度为35-37℃。
1.2验证目的确认所采用的方法适合于纯化水的细菌数、霉菌数、酵母菌数的测定。
1.3验证执行的文件超净工作台标准操作规程微生物限度检查法培养箱标准操作规程热压灭菌锅标准操作规程2. 验证参与部门及责任3.验证方法：3.1文件要求所需文件检查人：日期：3．2菌种验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
确认人：日期：3．3菌液制备3．3．1分别取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许，各接种至5ml营养肉汤培养基中，在36℃±℃培养18-24小时，取均匀培养物1ml用0.9%无菌氯化钠溶液按10倍递增稀释至1:107,制成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液。
3．3．2接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，培养24-48小时，取均匀培养物1ml用0.9%无菌氯化钠溶液按10倍递增稀释至1:107,制成每1ml含菌数为50~100cfu 的菌悬液。
酵母菌表面展示的效果验证步骤
酵母菌表面展示的效果验证步骤酵母菌表面展示技术是一种利用酵母菌表面蛋白质展示异源蛋白或多肽的方法。
这种技术的应用广泛，可以用于疫苗开发、新药筛选、酶工程以及生物燃料产生等领域。
为了验证酵母菌表面展示的效果，我们需要进行一系列的步骤。
步骤一：构建酵母菌表面展示载体首先，我们需要构建一个酵母菌表面展示载体。
常用的载体包括pYD1和pCTCON2。
这些载体可以在酵母菌表面显示异源蛋白或多肽。
步骤二：将目标基因插入载体中将目标基因与载体进行连接。
常用的方法有限制性酶切和连接酶的方法。
目标基因可以是感兴趣的蛋白质或多肽，也可以是需要评价的异源基因。
步骤三：转化酵母菌将构建好的表面展示载体转化到酵母菌细胞中。
转化的方法可以采用化学方法、电穿孔方法或冷冻转化法等。
步骤四：酵母菌表面展示评价使用不同的方法对酵母菌表面展示的效果进行评价和验证。
4.1 酵母菌表面展示蛋白的免疫染色可以利用免疫染色的方法来检测表面展示的目标蛋白。
通过使用特异性的抗体与表面展示的目标蛋白结合，并配合染料或荧光物质进行可视化观察。
例如，使用荧光标记的二抗来检测表面展示的蛋白。
4.2 流式细胞术可以使用流式细胞术来检测表面展示的蛋白。
通过标记表面展示的目标蛋白，通过流式细胞仪对样品进行分析，观察细胞的荧光强度或表面展示蛋白的相对表达水平。
4.3 质谱分析可以利用质谱分析技术来鉴定表面展示的目标蛋白。
通过质谱分析酵母菌表面展示的蛋白质，识别其氨基酸组成和序列。
4.4 功能鉴定最后，可以通过各种功能鉴定实验来评价酵母菌表面展示的蛋白的功能。
例如，如果展示的蛋白是一种酶，可以进行酶活性分析。
如果展示的是抗原，可以进行抗体结合实验。
此外，为了更好地验证酵母菌表面展示的效果，可以进行对照实验，比较表面展示的目标蛋白和未展示的蛋白之间的差异。
总结：酵母菌表面展示技术作为一种重要的蛋白质展示和功能研究方法，可以满足多种应用需求。
为了验证酵母菌表面展示的效果，需要进行载体构建、基因插入、酵母菌转化以及效果评价等一系列步骤。
总结-酵母酶活测定
2.9.3β-Galactosidase 酶活定量实验参考Clontech Yeast Protocols Handbook进行。
酵母酶活测定，准备：每个样品，8 ml 的YPD培养基，Y190 菌株（转化用）。
Z buffer，Z buffer+beta-巯基乙醇，Z buffer+ONPG，NA2CO31)准备5 ml SD/-Leu /-Trp液体培养基过夜培养的酵母菌，同时将ONPG 溶解在Z缓冲液中（4 mg/ml，调pH 7.0）并振荡混匀1-2 hr；2)旋涡振荡器上将菌液剧烈振荡0.5-1 min，立刻取出2 ml加入8 ml的YPDA中；3)30℃250 rpm摇3-5 hr，测OD600在0.5-0.8之间并记录确切OD值；4)取3个1.5 ml的EP 分别倒入1.5 ml菌液，14,000 rpm离心30 sec，小心弃上清，加入1.5 ml Z缓冲液，振荡以重悬菌体；5)离心去上清，加入300 μl Z缓冲液重悬菌体（则浓缩倍数为1.5/0.3=5倍）；6)取0.1 ml至新管中，液氮冷冻0.5-1 min，37℃0.5-1 min使其融化；7)反复冻融3次以上使细胞尽可能破碎；8)取一个新管加入100 μl Z缓冲液作为空白对照；9)每管中加入0.7 ml Z缓冲液+β-巯基乙醇，加入160 μl 溶在Z缓冲液中的ONPG同时开始计时，将管置于30℃温浴；10)当溶液变为黄色时，加入0.4 ml Na2CO3中止反应，计录反应时间t；11)14,000 rpm离心10 min，取上清，测OD420值；12)计算β-Galactosidase 酶活：β-Galactosidase units=1,000×OD420（t×V×OD600）t为反应时间（第10步记录）V为0.1×浓缩倍数（第5步记录）OD600为第3步所测OD值2.9.4 提取酵母蛋白参考Clontech Yeast Protocols Handbook进行。
霉菌和酵母菌检验方法验证报告
方法验证报告方法验证报告一、方法依据/原理1.1方法依据：化妆品安全技术规范（2015）第五章 6 霉菌和酵母菌检验方法1.2原理：化妆品检样在一定条件下培养后，1g或1mL化妆品中所污染的活的霉菌和酵母菌数量，藉以判明化妆品被霉菌和酵母菌污染程度及其一般卫生状况。
本方法根据霉菌和酵母菌特有的形态和培养特性，在虎红培养基上，置28℃±2℃培养5d，计算所生长的霉菌和酵母菌数。
二、使用范围2.1适用于化妆品霉菌和酵母菌的测定。
三、设备情况表1使用仪器设备一览表表2标准物质和关键物料登记表四、环境条件情况表3环境条件五、人员能力情况表4相关人员六、方法验证/确认情况6.1 实验步骤6.1.1样品前处理6.1.1.1液体样品：水溶性的液体样品，用灭菌吸管吸取 10mL 样品加到 90mL 灭菌生理盐水中，混匀后，制成 1：10检液。
6.1.1.2油性液体样品：取样品10g，先加5mL灭菌液体石蜡混匀，再加10mL灭菌的吐温80，在40℃—44℃水浴中振荡混合10min，加入灭菌的生理盐水75mL（在40℃—44℃水浴中预温），在40℃—44℃水浴中乳化，制成1：10的悬液。
6.1.1.3膏、霜、乳剂半固体状样品：亲水性的样品：称取10g，加到装有玻璃珠及90mL灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡混匀，静置 15min。
用其上清液作为 1:10 的检液。
疏水性样品：称取10g，置于灭菌的研钵中，加10mL灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状，再加入10mL灭菌吐温 80，研磨待溶解后，加70mL灭菌生理盐水，在40℃—44℃水浴中充分混合，制成 1：10 检液。
6.1.1.4固体样品：称取10g，加到90mL灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，使其分散混悬，静置后，取上清液作为1：10 的检液。
使用均质器时，则采用灭菌均质袋，将上述水溶性膏、霜、粉剂等，称10g 样品加入90mL灭菌生理盐水，均质1min—2min；疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称10g样品，加10mL灭菌液体石蜡，10mL吐温80，70mL 灭菌生理盐水，均质3min—5min。
酵母菌表面展示操作步骤之表面展示及检测
酵母菌表面展示操作步骤之表面展示及检测表面展示及检测是酵母菌表面展示操作步骤中的重要环节，其目的是确定表面融合蛋白是否成功展示在酵母菌表面以及检测展示效果。
本文将详细介绍酵母菌表面展示及检测的操作步骤。
首先，进行表面展示的准备工作。
将目的基因的DNA序列插入到适当的酵母菌表面展示载体中，然后通过酵母菌转化技术将重组载体导入酵母菌细胞中，诱导其表达。
此外，在培养酵母菌的基本培养基中添加适当的选择性抗生素以筛选转化成功的酵母菌。
接下来，进行表面展示的操作步骤。
将经过转化的酵母菌接种到含有相应选择性抗生素的培养基中，以促进表达载体中的目的基因。
培养温度和时间根据不同的酵母菌菌株和目的基因的要求进行调整。
一般来说，表面展示需要在恒温摇床上进行培养。
在培养过程中，需要定期检测目的基因是否成功表达在酵母菌表面。
常用的检测方法包括免疫荧光染色、酶联免疫吸附实验（ELISA）以及Western blot等。
这些方法可以通过特异性抗体与目的基因进行特异性结合，确定其在酵母菌表面的表达情况。
此外，也可以通过流式细胞术对酵母菌进行直接检测。
免疫荧光染色是一种常用的酵母菌表面展示检测方法。
首先，将培养的酵母菌制备成适当的悬浮液。
然后，将悬浮液滴在载玻片上，用抗体与待检测的目的基因特异性结合。
接着，用荧光染料标记抗体，使其发出特定的荧光信号。
最后，用荧光显微镜观察载玻片上的荧光信号，并计算荧光强度来评估目的基因在酵母菌表面的展示效果。
另一种常用的检测方法是ELISA。
此方法利用了特异性抗体与目的基因结合，并通过酶标记抗体与酵母菌表面的目的基因形成复合物。
然后，加入相应底物使酶产生显色反应。
通过比色检测，可以确定酶活性从而评估目的基因在酵母菌表面的展示效果。
最后，进行Western blot检测。
该方法是一种常见的蛋白质检测方法，能够对目的基因的存在与否进行验证。
首先，将待检测的酵母菌样品进行蛋白质提取，并通过电泳分离蛋白质。
食品中微生物霉菌和酵母的检测能力验证
—
0
GB4789.10 -2010
3.114
— -2.22
GB4789.10 -2016
3.225
—
0.3
GB4789.10 -2016
3.156
— -0.1
致在培养第５天时，原液稀释度的平板上霉菌 出现了片状菌落，无法分清霉菌的数量，因而 取了稀释梯度为１０－１的数值。最后导致检测结 果偏差，结果为不满意。在第二次检测测量审 核样品时，在培养的过程中每天观察，当平板 上生长出菌落时，每天定时计算平板上的菌落 和生长的位置，在培养结束时根据之前的观察 菌落生长的位置对平板上的菌落进行计数。在 ２０１６年的能力验证项目中１６－Ｆ４４４样品稀释度 １０－２平板上生长较多霉菌，有霉菌重叠交错生 长。稀释度１０－１为７８，其中酵母５０，霉菌２８； 稀释度１０－２为１０，酵母为６，霉菌为４。两个稀 释度都在国标的菌落计数范围内。在这种情况 下应当须稀释度高的结果。第一可以避免检测 人员在稀释度低对霉菌计数时出现偏差对结果 造成影响。第二，当两个稀释度都满足计数的 情况下，取较大的数值在数学统计上更靠近稳 健均值，使结果在Ｚ值更接近满意范围。
（２０１７）１７－Ｇ８８９、１７－Ｈ２０２。
仪器
霉菌培养箱ＭＪ－２５０ＢＳＨ－ＩＩＩ：２８℃±１℃、 生化培养箱ＳＰＸ－２５０ＢＳ－Ⅱ：２８℃±１℃、电子 天平ＪＪ２０００：感量０．１ｇ、数显恒温水浴锅ＨＨ－ ８：４６℃±１℃、生物显微镜 ＸＳＰ－２ＣＡ：１０×～ １００×。
试剂
孟加拉红培养基（虎红琼脂），生产商：广 东环凯微生物科技有限公司
霉菌：１５年第一次检测霉菌ＭＡ１５－Ａ１５８ 样品时，由于霉菌的生长产生孢子和菌丝，导
98·FOOD INDUSTRY
酵母酶实验报告
一、实验目的1. 了解酵母酶的基本特性及其在生物化学反应中的作用。
2. 掌握酵母酶活性测定的原理和方法。
3. 通过实验验证不同条件（如温度、pH值、底物浓度等）对酵母酶活性的影响。
二、实验原理酵母酶是一种广泛存在于酵母细胞中的酶，具有催化多种生物化学反应的能力。
本实验主要测定酵母酶的活性，通过比较不同条件下酶促反应的速率，来评估酶的活性。
酶活性通常以单位时间内反应物的消耗量或产物的生成量来表示。
本实验采用紫外分光光度法测定酶活性，即通过测定酶催化反应后溶液中特定波长下的吸光度变化，间接反映酶的活性。
三、实验材料与仪器材料：- 酵母粉- 底物溶液- pH缓冲液- 温度控制装置- 紫外分光光度计- 移液器- 烧杯- 试管仪器：- 恒温水浴锅- 移液器- 紫外分光光度计- 计算器四、实验步骤1. 酶液的制备：将酵母粉溶解于适量水中，充分搅拌，室温下静置10分钟，取上清液作为酶液。
2. 底物溶液的配制：根据实验要求，配制一定浓度的底物溶液。
3. 酶活性测定：a. 取适量酶液于试管中，加入一定量的底物溶液，混匀。
b. 将试管置于恒温水浴锅中，根据实验要求设定温度，保温一段时间。
c. 使用紫外分光光度计测定溶液在特定波长下的吸光度，记录数据。
d. 重复上述步骤，分别在不同温度、pH值、底物浓度等条件下进行实验。
4. 数据处理：根据实验数据，绘制酶活性与温度、pH值、底物浓度的关系曲线，分析不同条件对酶活性的影响。
五、实验结果与分析1. 酶活性与温度的关系：随着温度的升高，酶活性逐渐增强，但在一定温度后，酶活性开始下降。
这可能是因为过高温度导致酶蛋白变性，失去催化活性。
2. 酶活性与pH值的关系：酶活性在特定pH值下达到最大，偏离此pH值，酶活性逐渐降低。
这表明酶的活性受到pH值的影响，酶的最适pH值通常在6.5-7.5之间。
3. 酶活性与底物浓度的关系：酶活性随着底物浓度的增加而增强，但在一定底物浓度后，酶活性趋于稳定。
酵母胞外酶的产酯发酵条件优化研究
酵母胞外酶的产酯发酵条件优化研究王攀;隗程峰;蔡凤娇;汪江波【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2016(035)009【摘要】以观音土曲中的一株酵母菌Y2为研究对象,将菌株Y2在发酵培养基培养后取其胞外酶,并将其运用于酯化反应体系中进行催化反应,以产酯能力为评价指标,先后采用单因素试验和正交试验优化菌株Y2产酯发酵条件.结果表明,当酵母菌接种量为4％、培养基初始pH值为5、发酵温度为30 ℃、发酵时间为4d时,菌株Y2具有最高产酯力1.24 g/L.【总页数】4页(P55-58)【作者】王攀;隗程峰;蔡凤娇;汪江波【作者单位】湖北工业大学生物工程与食品学院工业发酵湖北省协同创新中心,湖北武汉430068;湖北工业大学生物工程与食品学院工业发酵湖北省协同创新中心,湖北武汉430068;湖北工业大学生物工程与食品学院工业发酵湖北省协同创新中心,湖北武汉430068;湖北工业大学生物工程与食品学院工业发酵湖北省协同创新中心,湖北武汉430068【正文语种】中文【中图分类】TS261【相关文献】1.西藏拉鲁湿地土壤酵母菌多样性及产胞外酶活性菌株分布特性研究 [J], 郝兆;梁泽鹏;熊宁;拉巴;德吉;郭小芳2.毕赤酵母产木聚糖酶发酵条件优化及其酶学特性研究 [J], 徐志旭;袁丽娟;卢洪栋;潘春梅3.产碱性β-甘露聚糖酶重组毕赤酵母发酵条件优化及酶学特性研究 [J], 钱娟娟;曹世源;王克芬;王兴吉;刘文龙;4.产碱性脂肪酶重组毕赤酵母发酵条件优化及酶学特性研究 [J], 王兴吉;曹世源;钱娟娟;王克芬;张杰;刘文龙5.产胆固醇酯酶毕赤酵母发酵条件优化及酶学性质研究 [J], 权浩严;王鹏;位正鹏;杜春影;沈照鹏;张京良;乔乐克因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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酵母产胞外酶验证试验方案
一培养基：
I溴甲酚紫(20ml)：酵母浸膏1g，蛋白胨2g，葡萄糖2g，琼脂2%,三丁酸甘油酯1.5ml，溴甲酚紫
0.004g，蒸馏水100ml,115℃，灭菌20min
II酯酶染色液(20ml)：酵母浸膏1g，蛋白胨2g，葡萄糖2g，琼脂2%,三丁酸甘油酯1.5ml，酯酶染色液50.0ml/l,蒸馏水100ml, 115℃，灭菌20min
III发酵培养基：酵母浸膏1g，蛋白胨2g，葡萄糖10g，硫酸铵（（NH4）2SO4
0.1g,KH2PO40.1g,MgSO4.7H2O0.1g,蒸馏水100ml。
115℃，灭菌20min
IV PDA 培养基（斜面保藏）：马铃薯 20g、葡萄糖 2g、琼脂 1.5~2.0g、蒸馏水 100m L、p H 自然、另加脱胆酸钠 1％（防止菌丝蔓延）。
酯酶染色液配置：1%的a-醋酸萘酯丙酮溶液2ml，1%的β-醋酸萘酯丙酮2ml，FastBuleB盐100mg，0.05mol/l，pH7.2Tris-Hcl 10ml,加蒸馏水
86ml。
二实验步骤
1 将酵母菌划线接种在I号培养基中，30℃，培养48h。
挑选出产生透明圈直径大的菌株。
2将1中挑选出的菌株接种于III 号培养基中，30℃，转速200r/min，培养48h,取一定量发酵液，6000r min离心20min.上清液即为粗酶液。
3 将2中菌体6000r min离心20min,无菌生理盐水洗涤两次,收集菌体。
加入适量石英砂研磨破碎菌体,用pH6.3 PBS缓冲液4℃下浸提菌体24h(也可以选择超声破碎30min),6000r min离心20min,收集菌体浸提液
三酶活检测
①待II号培养基凝固后用打孔器打孔10mm,加入0.5ml粗酶液.30℃，48h,观察是否有透明圈产生。
②将粗酶液5ml，加入20 %乙醇的酯化体系中，加3滴溴酚蓝甲基红，再缓慢加入己酸使溶液呈微红,32 ℃,静置培养，随时观察颜色变化情况。
（原理：酶使酯化反应发生，己酸酸含量减少，则溶液的酸度减小，pH上升，溶液则发生变色）
③ 取菌体浸提液按照②进行.
吸光度法：移取稀释后的酶液 0.5 m L，加入 p H6.0、0.02 mol/L磷酸缓冲液 4.3 m L，2.5×10-3 mol/Lα-乙酸萘酯乙醇溶液 0.2 m L，于 35 ℃振荡反应15 min，然后加入0.02 %固蓝B溶液0.5 m L终止反应并显色，振荡混匀显色30 s，加入6 mol/L的盐酸0.5 m L混匀，使显色稳定，在537 nm 波长处比色，以灭活酶液作空白样。
酶活力定义为：在上述反应条件下，酯化酶每 1 min催化得到 1 μg α-萘酚所需酶量为 1 个酶活力单位，即1 U。