脐血造血干细胞分离方法的实验研究
人脐血CD34^+造血干细胞的分离和体外扩增培养问题
脐带血 ， 指的是胎儿娩 出、 脐带结扎并离断后 ， 残 留在 脐 带 内以及胎盘 近胎 儿 侧血管 内的血液 ， 其 中含有 大量 干 细 １ 材 料 与 方 法 胞， 包括造 血干细胞和间充质干细胞等。干细胞具有较强 的 １ ． １ 材料 自我复制能力 。胚胎 干细胞在 一定 的环境 条件下 可 以分 化 １ ． １ ． １ Ｕ Ｃ Ｂ来源 ： 人脐带血 由相 关医院妇 产科 提供 。 为多能干细胞 。造血 干细胞是 多能干细胞的一种 ， 是骨髓 中 １ ． １ ． ２ 仪器 和药品 ： 使用的主要仪器包括细胞 培养箱 ， 超净 的干细胞 ， 它具有 自我更 新 的能 力 ， 也能 够分化成 为各种 血 工作 台； 细胞培养 板 ， 流式 细 胞仪 ； 显 微镜 ， 照相 机 ； 电子 天 细胞前体 细胞并 最终分化 为各种血 细胞 ， 如 红细胞 、 白细 胞 和血小板 。脐带 血可以重 建骨髓造血和人体免疫 ， 多 用来治 平， 离 心机 ； 低 温冰箱等 。 使用 的药品主要包括 细胞 因子 Ｓ Ｃ Ｆ 、 Ｉ Ｌ一３ 、 Ｉ Ｌ一６ 、 Ｇ— 疗骨髓 衰竭 以及严重的血液疾病 ， 在一些遗传病 和严重 的免 Ｃ Ｓ Ｆ 、 Ｅ Ｐ Ｏ； 青霉素 、 链霉素 ； Ｎ ａ Ｃ １ 、Ｋ Ｃ Ｉ ； 甲醇 、 乙醇 ； Ｎ ａ ２ Ｈ Ｐ Ｉ Ｍ、 疫缺陷疾病 中也 被广泛应用 ， 并且获得了一定的成功。有研 Ｋ Ｈ ２ Ｐ ０ ４； Ｆ ｉ ｃ ｏ ｌ ｌ 淋巴细胞分离 液 ； 胎牛血清 ； Ｄ ＭＥ Ｍ 培养液。 究表明脐带血中含有大量的干细胞 ， 无论是对外 界刺激的反 １ ． ２ 方法： 采用胎 盘娩 出后采血法采集脐带血 ， 要求 孕妇无 应还是增值能力都 比骨髓 干细胞 强。在 体外生 长培养 中也 产科 ， 内科合并症 以及其他血液疾病。采血过程 由助产士帮 显示出 由于骨髓 干细胞 的特点 ， 比骨髓干 细胞生 长的更好 ， 助 完成 。在 无菌条件下抽取脐带血 ， 注入无 菌采血袋后置 于 即更适合做体外扩增 培养… 。脐带血不仅含 有丰 富的干细 ４℃保存 。２ ４ ｈ内分离 制备 ＭＮ Ｃ悬液 后用 Ｉ ｓ ｏ ｌ ｅ ｘ ５ ０免疫磁 胞 ， 其分泌生长 因子的能力 也很强 。此外 ， 其端 粒酶 活性也 珠分 离系统收集 Ｃ Ｄ ３ ４ 造血 干细胞 ， 用 流式 细胞 仪 检测 收 远远高于骨髓和外周血干细胞 ， 这些特点导致 了脐带干细胞 集的 Ｃ Ｄ ３ ４ 纯度 后行体外扩增 培养 。通过 血液涂 片进行形 扩增会有更强的分裂存活能力 。 态学观察。根据细胞计数调整细胞悬 液量 ， 加入胎牛血清 和 造血生长 因子分 为刺 激增殖 的刺激因子 和维持 细胞存 Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ溶液 。在 ２ ４孔培养板上做 ５组不同细胞因子组合 的 活 的存活因子 。根据各种生长 因子的不同功 能 ， 合理搭配 可 Ｃ Ｆ 、 Ｉ Ｌ一３ 、 Ｉ Ｌ一６ 、 Ｇ— 培养孔 ， 以不加细胞 因子 的培 养孔作 为生长对 照 ， 每组重 复 以起 到 协 同作 用 。 本 研 究 结 果 表 明 Ｓ 三次 ， 共培养 ６周 。每周计数单个核细胞数和集落形成单 位 Ｃ Ｓ Ｆ 、 Ｅ Ｐ Ｏ ５种细胞 因子联合 应用诱 导 Ｃ Ｄ ３ ４ 造 血干 细胞 体 且Ｃ Ｄ ３ ４ 造 血干细胞 体外 培养第 １ ３ （ Ｃ Ｆ Ｕ ） 。细胞因子分组为 ： （ １ ） Ｓ Ｃ Ｆ＋Ｉ Ｌ一 ３＋Ｉ Ｌ一６ ； （ ２ ） Ｓ Ｃ Ｆ 外扩增培养效果 最好 ， 脐 带 血 造 血 干 细 胞 的 研 究 有 不 少 成 ＋Ｉ Ｌ一３＋Ｇ—Ｃ Ｓ Ｆ ； （ ３ ） Ｓ Ｃ Ｆ＋Ｉ Ｌ一６＋Ｇ —Ｃ Ｓ Ｆ ； （ ４ ） Ｓ Ｃ Ｆ＋Ｉ Ｌ ｄ时 达 到 高 峰 。 目前 ， ３＋Ｉ Ｌ一 ６＋Ｇ—Ｃ Ｓ Ｆ ； （ ５ ） Ｓ Ｃ Ｆ＋Ｉ Ｌ一 ３＋Ｉ Ｌ一６＋Ｇ —Ｃ Ｓ Ｆ＋ 果， 但至今成功移植的例子却很有限。一方 面是 因为 干细胞 Ｅ Ｐ Ｏ。其 中浓度分 别为 ： Ｓ Ｃ Ｆ １ ０ ０ ｎ ｇ ／ ｍ Ｌ 、 Ｉ Ｌ一３ １ ０ ｉ ｒ ｇ ／ ｍ Ｌ 、 Ｉ Ｌ 的数量较少 ； 另一方面则是 由于脐带干细胞 移植入成人 骨髓 ６ ５ ０ ｎ ｇ ／ ｍＬ、 Ｇ —Ｃ Ｓ Ｆ ８ ０ ｎ ｇ ／ ｍＬ、 ＥＰ Ｏ ２ Ｕ。 的成功率较 低 Ｊ 。所 以 ， 如何提高脐带血造血干细胞 的移植 １ ． ３ 数 据分析 ： 用Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ １ ３ ． ０软件对 数据进行 统计学分析 ， 成功率 ， 如何在体外扩增和培养脐带血造血干细胞就成为 了 也是其进一步 发挥 于临床医学应用所要面对的 对数据进行 卡方 检 验。剂 量 资料采 用 平均 数标 准 差表示 。 研究的热点 ， Ｐ＜ ０ ． ０ ５表 明差异具有统计 学意义。 重费挑战。 参 考 文 献
脐带血造血干细胞的临床研究进展综述
脐带血造血干细胞 的临床研究进展综述
乔
（ １ ． 内蒙古 医科 大 学研 究生 学院 ， 内蒙古 呼和浩 特
杰 ，郭 妍 妍
呼和 浩特 ０ １ ０ ０ ５ ０ ）
０ １ ０ ０ ５ ９ ；２ ． 内蒙古 医科 大 学附属 医 院儿科 ，内蒙 古
摘
要：本文从脐带血造血干细胞 的生物学特征出发，对脐血造血干细胞移植技术及其临床应用方法和价值进行 了分析，现将本次医学研究结果
—
脊髓逐步再生。截至 目前 ，脐血造血干细胞移植技术在大脑和脊位损 伤 、肌萎缩性 （ 脊髓） 侧索硬化 、阿尔茨海默病 、脑梗塞和慢性进行性 舞蹈病等多种疾病中均得到了广泛应用，且治疗效果较为理想 ［ ３ ］ 。 第二， 自身代谢缺陷性疾病的临床 治疗 。现阶段 ，白细 胞黏着缺 乏症、骨硬化病 （ 骨质石化病）、Ｌ ｅ ｓ ｃ ｈ— Ｎ ｙ ｈ ａ ｎ疾病、Ｌ ａ ｎ ｇ ｅ ｒ ｈ ａ ｎ细 胞组织细胞增生症、Ｋ ｒ ａ ｂ ｂ ｅ疾病 （婴儿遗传性脑 白质萎缩） 、遗传性 神经元蜡样脂褐质沉着症、Ｈ ｕ ｎ ｔ ｅ ｒ 综合征、Ｈ ｕ ｎ ｌ ｅ ｒ 综合征 、Ｇ ｕ ｎ ｔ ｅ ｒ 疾病、Ｇ ａ ｕ ｃ ｈ ｅ ｒ 疾病 、家族性噬红细胞性淋 巴组织细胞增生症、先天 性角化不 良、巴尔 一 淋巴球综合症 、淀粉样变性和脑白质 肾上腺营 养不 良症等 自身代谢缺陷性疾病均首选脐血造 血干细胞移植技术治疗 ［ ４ ］ 。 第三，免疫缺陷性疾病 的临床治疗。现阶段，Ｗ ｉ ｓ ｋ ｏ ｔ ｔ— Ａ ｌ ｄ ｒ ｉ ｃ ｈ 症候、ｘ 一 性连锁性淋巴组织增生疾病 （ Ｋ Ｌ Ｐ ） 、严重性联合免疫缺陷 疾病 （ Ｓ Ｃ Ｉ Ｄ ｓ ） 、慢性肉芽肿疾病 （ Ｃ Ｇ Ｄ ） 和腺嘌呤去氨酵素缺乏 （ Ａ Ｄ Ａ ） 等 免疫缺陷方面疾病均首选脐血造血干细胞移植技术治疗 ［ ５ ］ 。 第 四，血液 系统疾病 的临床治疗 。现阶段 ，Ｋ ｏ ｓ ｔ ｍ ａ ｎ ｎ 综合征 、 Ｆ ａ ｎ ｃ ｏ ｎ ｉ 贫血 、Ｅ ｖ ａ ｎ 综合征、Ｂ ｌ ａ ｃ ｋ ｆ ａ ｎ— Ｄ ｉ ａ ｍ ｏ ｎ ｄ贫血、地中海性贫 血 、镰状细胞性贫血 、先天性血球细胞缺乏症、再生障碍性贫血、 巨 细胞缺乏性血小板减少症 （ Ａ Ｍ Ｔ ） 、淋 巴瘤和急慢性 白血病等血液系统 疾病患者也比较常用脐带血作为造血干细胞移植技术治疗 ［ ６ ］ 。
基于脐带血造血干细胞分离冻存方法探究
龙源期刊网 基于脐带血造血干细胞分离冻存方法探究作者：吴春燕来源：《健康必读（上旬刊）》2019年第10期【摘 ;要】脐带血造血干细胞具有较强的自我更新以及繁殖能力，同时能够在特定条件下进行组织分化。
正是由于脐带血造血干细胞的这种性能，其已大范围应用在恶性血液病、严重免疫缺陷症等方面的临床治疗。
采取有效的分离冻存方法从而降低造血干细胞的损失已经成为了脐带血库最为关键的技术之一。
本文主要探究脐带血造血干细胞分离冻存方法，希望能够对相关人士有所帮助。
【关键词】脐带血造血干细胞;分离冻存;脐带血库【中图分类号】R329;;;;;;【文献标识码】A; ;;;;【文章编号】1672-3783（2019）10-0025-01引言从相应参考文献中可知，造血干细胞移植，是患者先接受超大剂量放疗或化疗（通常是致死剂量的放化疗），有时联合其他免疫抑制药物，以清除体内的肿瘤细胞、异常克隆细胞，然后再回输采自自身或他人的造血干细胞，重建正常造血和免疫功能的一种治疗手段，脐带血造血干细胞更是其中的重中之重。
脐带血造血干细胞移植的前提就是具有相应的脐带血库，并且可以对造血干细胞进行有效的分离以及保存。
否则不但大大增加存储成本，同时也会影响到患者的健康。
所以对于分离冻存方法进行分析研究，这对于进一步推动脐带血造血干细胞的移植具有非常现实的意义。
1 试验材料以及方法（1）试验材料严格遵照美国脐带血库标准操作规程进行操作，所用材料为健康、足月分娩产妇的脐带血，采集之后24小时内进行处理。
所用相应试剂以及设备主要包括：DMSO、6%羟乙基淀粉生理盐水注射液、10%右旋糖酐40生理盐水注射液、胎牛血清、IMDM培养基及F12基础培养基、CD34+以及CD45抗体、甲基纤维素培养基、血细胞分析以KX-21N、生物安全柜、大容量低温冷冻离心机、程控降温仪等等。
（2）试验方法。
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定【摘要】目的分离培养脐带血间充质干细胞并检测其生物学特性。
方法在无菌条件下用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞，接种含10%胎牛血清的DMEM培养基中。
单个核细胞行贴壁培养后，进行细胞形态学观察，绘制细胞生长曲线，分析细胞周期，检测细胞表面抗原。
结果采用Percoll(1.073 g/mL)分离的脐血间充质干细胞大小较为均匀，梭形或星形的成纤维细胞样细胞。
细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期，至第9天后数量减少;流式细胞检测表明50%～70%细胞为CD29和CD45阳性。
结论体外分离培养脐血间充质干细胞生长稳定，可作为组织工程的种子细胞。
【关键词】脐血;间充质干细胞;细胞周期;免疫细胞化学Abstract: Objective Isolation and cultivation of mesenchymal stem cells (MSCs) in human umbilical cord in vitro， and determine their biological properties. Methods The mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation from human umbilical cord blood in sterile condition， and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. After the adherent mononuclear cells were obtained， the shape of cells were observed by microscope， then thecell growth curve， the cell cycle and the cell surface antigens were obtained by immunocytochemistry and flow cytometry methods. Results MSCs obtained by Percoll (1.073 g/mL) were similar in size， spindle-shaped or star-shaped fibroblasts-liked cells. Cell growth curve analysis indicated that MSCs were in the exponential stage after 5d and in the stationary stages after 9d. Flow cytometry analysis showed that the CD29 and CD44 positive cells were about 50%～70%. Conclusions The human umbilical cord derived mesenchymal stem cells were grown stably in vitro and can be used as the seed-cells in tissue engineering.Key words:human umbilical cord blood; mesenchymal stem cells; cell cycle; immunocytochemistry间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在一定条件下具有多向分化的潜能，是组织工程研究中重要的种子细胞来源。
脐血干细胞的分离方法比较
[文章编号]1002-0179(2007)02-0345-03脐血干细胞的分离方法比较Methods of Separating Stem Cells from Umbilical Cord B lood黄韬,李波3,林浩铭HUANG Tao ,LI Bo ,LI N Hao -ming(四川大学华西医院普外二科,四川成都 610041)(Department o f G eneral Surgery ,West China Hospital ,Sichuan Univer sity ,China 610041,China ) 摘要:目的:为合理选择脐血干细胞的分离方法提供参考。
方法:采用改良HES (羟乙基淀粉)沉降分离法和Ficoll 分离法分离脐血干细胞,比较两种方法分离前后的有核细胞数、分离后的C D34+细胞数、分离后的有核细胞回收率及台盼蓝拒染率。
结果:改良HES 沉降分离法和Ficoll 分离法分离前的脐血量、有核细胞浓度和细胞数差异无统计学意义(P >0105);分离后改良HES 法有核细胞数、C D34+细胞数、有核细胞回收率高于Ficoll 分离法(P <0105),而显示有核细胞活力的台盼蓝拒染率两种方法比较差异无统计学意义(P >0105)。
结论:改良HES 分离法的有核细胞回收率高,分离速度快、污染机会小、终体积小,是脐血干细胞分离较好的方法。
关键词:脐血;有核细胞;干细胞;分离[中图分类号]R457 [文献标志码A Abstract :Objective :T o choose an appropriate method of separating stem cells from umbilical cord blood 1Methods :Umbili 2cal cord blood (UC B )sam ples were collected by blood bags and were separated by using hydroxyethyl starch (HES )and Ficoll method 1Nuclear cells ,C D34+cells and trypan blue dye viability were com pared between HES and Ficoll method 1Results :There was no difference in the v olume of umbilical cord blood ,the density and the number of the nuclear cells between HES and Ficoll method before separating (P >0105)1But after separating ,the number of nuclear cells and C D34+cells ,the rate of recollec 2tion for the nuclear cells (the percentage of the number of nuclear cells of post -separation and pre -separation )by using HES separating were higher than that of using Ficoll separating (P <0105)1There was no difference in the rate of refusing trypan blue dye between HES and Ficoll separating (P >0105)1C onclusions :The quantity of human cord blood -derived stem cells collect 2ed by using im proved HES separation is high ,the operation is sim ple and convenient ,the speed of separating isquick ,the oppor 2tunity of pollution is small and final v olume is small ,which is a better method of separating stem cells from umbilical cord blood 1K ey w ords :umbilical cord blood ;nuclear cells ;S tem Cells ;separation(Received date :2006-12-21)表11分离前HES 组与Ficoll 组脐血基本情况分组n 脐血体积( x ±S ,m l )细胞浓度( x ±S ,×108/dl )有核细胞数( x ±S ,×108)HES 组588180±2118013170±018012108±2164Ficoll 组586100±18160314112±01903312136±3125333与HES 组比较:3t =01218,P =01833;33t =-01782,P =01457;333t =-01145,P =01888表21两种方法脐血分离后主要指标测定比较( x ±S)分组n 有核细胞数(×108)回收率(%)分离后CD34+(×106)台盼蓝拒染率(%)HES 组510130±212485148±31803153±01349812±1148Ficoll 组56177±0174356192±11114332112±01323339710±11583333与HES 组比较:3t =31351,P =01010;33t =51427,P =01001;333t =61811,P =01000;3333t=11238,P =01251 3通讯作者 作者简介:黄韬(1968-),男,四川省西充县人,主治医师,主要从事肝脏外科的临床研究工作,现在四川省第五人民医院普外科。
脐带血干细胞制备的检测分析
胞 仪 测 得 脐 血 干 细胞 Ｃ ４ Ｄ３ 为 （ ． ５ ． ７ （ １ ５ ±０ ６ ） ｎ一１ ） ９ 。淋 巴细 胞 亚 群 检 测 结 果 显 示 ， 血 ＣＤ３细胞 数 较 少 ， 脐 ＣＤ４
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５８ ２ ・
检 验 医 学 与 临床 ２ １ ０ ２年 ３月 第 ９卷 第 ５期 Ｉ ｂＭ ｅ ｉ， ｒｈ２ １ ， ｏ． ， ． ｄＣｌ Ｍａｃ ０ ２ Ｖ １９ Ｎｏ ５ ａ ｎ
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论 著 ・
脐 带 血 干 细 胞 制 备 的检 测 分 析
任 娜 ， 荔青 ， 朱 赵 威 ， 广 斌△（ 邱 解放 军 第二 。二 医院检 验科 ， 阳 １ ０ ０ ） 沈 １ ０ ３
ａ ｐｐｌｃ ｔｏｎ Ｍ ｅｈｏ ｓ Ｍ ａ ｅ ｎ ｌａｎ ｏ ｄ ｂｌ ｏ ａ ｐｌｓ ｆ Ｈ Ｉ ， Ｂｓ ｇ， ＣＶ ， Ｐ， ｉａｉ ． ｔ ｄ ｔ ｒ ａ ｄ ｃ ｒ ｏ ｄ ｓ ｍ ｅ ｏ Ｖ Ｈ Ａ Ｈ Ｔ ＣＭ Ｖ ， ｎｄ ｏ ｎ， ｙｃ ｌ ｓ ａ， ｅ ｏｔ ｘｉ ｍ ｏｐ ａ ｍ ｃ ｏ ｅ ｌ ｉｕｓ， ｔ ｇｅ ｅ ｅ ｄｅ ｅ ｔ ｄ， ｄ ｓｅ ｅｌ ｒ ｓ ａ ｅ ｙ ｒｆｃ ｔｏ ｉ ｎ ｖｔ ｏ ｙｔ ｍ ｇａｏｖ ｒ ｐａ ｈｏ ｎ ｗ ｒ ｔ ｃｅ ａｎ ｔ ｍ ｃ ｌｓ ｗｅ ｅｉｏｌｔ ｄ ｂ ｐｕ ｉｉａ ｉ ｎ ｋ ｔｉ ｉｒ ．Ｔｈｅ ｔ ｍ ｅｌ ｈ ｎ ｓ ｅ ｃ ｌｓ ｔ ｅ ｎ ｕｍ ｂｅ ｆｍ ｏ ｎｕｃｅ ｒｃ ｌｓ ｗ ｅ ｅ ｃ ｕｎ ｅ ｆｅ ｘｔａ ｔｏｎ． Ｄ ｙ ｍ ｉ ｏ ｔ ｍ ｅ ｌ ａ ｔ ｃ ｅ ｉ ａ ｐ ｎ ｒｏ ｎｏ ｌ ａ ｅ ｌ ｒ ｏ ｔ ｄ ａ ｔ ｒ ｅ ｒ ｃ ｉ ｎａ ｃ ｆ ｓ ｅ ｃ ｌｓ ｗ ｓ ｄｅ ｅ ｔ ｄ ｂｙ Ｔａｗ ｎ ｈｅ ｏｌ
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定概述脐带血间充质干细胞（Wharton’s jelly mesenchymal stem cells, WJ-MSCs）是一类来源于脐带的干细胞。
WJ-MSCs具有较强的增殖能力、多向分化潜能、免疫调节功能等，是目前研究领域中备受关注的干细胞类型之一。
在该文档中，我们将介绍如何从脐带血样中分离出WJ-MSCs，并进行相关的细胞培养和鉴定。
分离过程脐带血样获取首先需要从人体获得脐带血样。
脐带血样一般可以在婴儿出生后通过脐带穿刺等方式获取。
获取脐带血样需要得到母亲的同意，并通过相关机构进行规范化处理。
分离WJ-MSCs脐带血样获取后，需要将其中的WJ-MSCs进行分离。
具体分离步骤如下： 1.将脐带血样转移至离心管中； 2. 加入相同体积的PBS，并轻轻混合； 3. 通过低速离心分离脐带血样中的血细胞等成分； 4. 取下沉后的WJ组织，加入胶原酶等酶类消化物进行消化，离心分离细胞； 5. 通过细胞培养等方式扩增细胞数量。
细胞培养在分离得到WJ-MSCs之后，需要进行相关的细胞培养。
具体培养步骤如下：1. 将分离得到的WJ-MSCs转移至新的培养皿中； 2. 加入含有10% FBS的DMEM低糖培养基； 3. 定期更换培养基，并记录生长状况。
鉴定方法确定分离的细胞为WJ-MSCs的方法很多，常用的方法如下： #### 形态学鉴定通过显微镜观察细胞形态、吸附能力等，判断细胞是否符合WJ-MSCs的特征。
免疫学鉴定通过使用针对WJ-MSCs标记的分子抗体（如CD73、CD90等）对细胞进行标记，并使用流式细胞仪等方法进行检测。
活力检测通过MTT法、细胞增殖实验等，检测WJ-MSCs是否具备较强的增殖能力。
多向分化鉴定通过对WJ-MSCs进行分化培养，如脂肪细胞培养、软骨细胞培养等，检测WJ-MSCs是否显示多向分化的潜能。
结论通过脐带血样的分离，可以获得WJ-MSCs，并通过相关的培养和鉴定方法，确定其为WJ-MSCs，并进一步应用于生物医学实验中，具有潜在的临床应用前景。
一种脐带血造血干细胞的分离方法[发明专利]
![一种脐带血造血干细胞的分离方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/a403037432687e21af45b307e87101f69e31fbd1.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011426548.4(22)申请日 2020.12.09(71)申请人 湖南源品细胞生物科技有限公司地址 410000 湖南省长沙市长沙经济技术开发区东五路南段102号中南源品干细胞科技园(72)发明人 王成 杨雅评 廖雨 张浪 王丹 (74)专利代理机构 北京天盾知识产权代理有限公司 11421代理人 李琼芳 肖小龙(51)Int.Cl.C12N 5/0789(2010.01)A01N 1/02(2006.01)(54)发明名称一种脐带血造血干细胞的分离方法(57)摘要本发明属于生物技术领域，尤其是一种脐带血造血干细胞的分离方法，包括如下步骤：将羟乙基淀粉溶液加入脐血中混匀后离心得到上层液体和下层红细胞；将上层液体和下层红细胞分别离心，上层液体离心后得到上层血浆和底层细胞，底层细胞重悬；红细胞离心后得到表面白膜层，表面白膜层用上层血浆定容，然后离心得到的下层细胞沉淀去除红细胞后重悬；将上述重悬后的细胞加入冻存液，混均后在液氮罐保存。
并且采用本发明的脐带血造血干细胞的分离方法，能够有效的从全血中分离出造血干细胞，羟乙基淀粉可以尽可能地去除血浆，提高分离效率，细胞的损失率低，能够减少冻存体积，降低成本；并且最终分离后得到的造血干细胞的回收率达到了96.94%。
权利要求书1页 说明书3页CN 112522197 A 2021.03.19C N 112522197A1.一种脐带血造血干细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：将6%的羟乙基淀粉溶液加入脐血中混匀，其中羟乙基淀粉溶液与脐血的体积比为4:1；混匀后分装至离心管中，静置，然后离心得到上层液体和下层红细胞；将上层液体和下层红细胞分别离心，上层液体离心后得到上层血浆和底层细胞，底层细胞用上层血浆重悬；红细胞离心后得到表面白膜层，表面白膜层用上层血浆定容，然后离心得到的下层细胞沉淀去除红细胞后用上层血浆重悬；将步骤3）和4）中重悬后的细胞汇集在一起，加入上层血浆定容，再加入冻存液，混合均匀后一起转移至冻存袋中；使用程控降温机降温，然后转入液氮罐保存。
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脐血造血干细胞分离方法的实验研究
作者：王永娟
来源：《科学与财富》2018年第18期
摘要：脐血作为一种造血干细胞来源可替代骨髓进行造血干细胞移植，脐血移植在治疗儿童遗传性疾病和血液病方面取得了巨大的成效。
为进一步推广脐血移植，必须相应地建立起完备的脐血库。
脐血库不同于骨髓库，它必须冻存实物。
为减少冻存体积，降低成本，需要采取有效的方法分离脐血中有核细胞，从而使大规模、广泛地建立脐血库成为可能。
本文对脐血造血干细胞分离进行实验研究分析。
引言
脐带血（umbilical cord blood，UCB）是产后留存在胎盘和脐带中的血液，以往被作为医学废物而丢弃。
近十几年的研究发现，人脐带中存在大量间充质干细胞，间充质干细胞（mesenchymal sterncells，MSCs）是成体干细胞的一种，具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能，可以重建人体造血和免疫系统的造血干/祖细胞，可用于造血干细胞移植，治疗多种疾病。
一、试验方法
1.1脐带血造血干细胞分离
利用离心沉降法和自然沉降法分离脐带血有核细胞，计算有核细胞回收率和红细胞回收率，比较两种分离方法的分离效果。
离心沉降法：将6%的羟乙基淀粉注射液和脐带血按照1∶5的比例混合，慢速摇匀
10min，以50g、10℃离心7min，收集上层富白细胞血浆，再以400g、10℃离心15min，去除血浆。
自然沉降法：将6%的羟乙基淀粉注射液和脐带血按照1：5的比例混合，慢速摇匀
10min，悬挂让其内细胞自然沉降1h后，收集上层富白细胞血浆，同样以400g、10℃离心
15min，去除血浆。
1.2脐带血造血干细胞冻存
将分离后的脐带血分别与4种不同的冷冻保护剂混合，脐带血与冷冻保护剂的体积比为4∶1，混合时应将冷冻保护剂缓慢注入脐带血中，边注入边晃动。
用程控降温仪按以下程序降温，4℃保持10min，以-1℃/min的速率降温至-40℃，再以-10℃/min的速率降温至-80℃，完
成后将脐带血混合物放入液氮罐中储存。
4种冷冻保护剂分别为：DMSO和0.9%氯化钠溶液1∶1混合液，DMSO和6%右旋糖酐1∶1混合液，DMSO和6%羟乙基淀粉1∶1混合液，DMSO、胎牛血清和F12培养基9∶4∶5混合液。
冷冻保护剂新鲜配制并于4℃提前预冷。
1.3冻存后复苏
脐带血冻存3个月后，将冻存的脐带血在37℃水浴锅中复苏，测细胞存活率，用流式细胞仪进行造血干细胞表面标志等分析，并进行祖细胞集落培养，从而比较4种冷冻保护剂的冻存效果的差异性。
1.4存活率检测
取100μL脐带血样品，加入900μL氯化铵溶血素，4℃避光反应5min，200g离心5min，弃上清加入细胞重悬液900μL重悬，再取50μL混合液加入台盼蓝2X溶液50μL，静置3min 后计数。
每个样品至少数300个细胞，计算有核细胞存活率。
1.5流式细胞仪检测
计数CD34+细胞是检验造血干细胞活性的公认方法之一。
取50μL脐带血样品，加入小鼠抗人CD34-PE、CD45-FITC抗体各10μL，室温避光孵育20min，然后加入300μL溶血素避光反应15min，最后加入300μL鞘液避光静置3min，待流式细胞仪检测。
1.6祖细胞集落培养
集落形成分析是一种检验造血干祖细胞活性公认的敏感方法。
取100μL脐带血样品，加入900μL氯化铵溶血素，4℃避光反应5min，200g离心5min，弃上清后加入1mLIMDM洗涤2次，加入200μLIMDM重悬，取适量细胞加入甲基纤维素培养基中，培养基中细胞终浓度
1×105cells/mL，混匀培养基后平分为2份加入到24孔培养板中，于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养12d后分别对CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E进行计数统计。
1.7冻存时间对脐带血造血干细胞的影响
选择上述研究中最佳冷冻保护剂，采用相同的试剂和方法，比较同一份脐带血样本冻存前、冻存3个月、6个月和一年的存活率、有核细胞数、CD34+造血干细胞数、祖细胞集落数。
1.8统计方法
采用SPSS19.0软件进行数据分析，测定结果均按平均值±标准差表示，统计学处理采用区组设计的方差分析，显著性水平为P
二、试验结果
2.1有核细胞分离效果
离心沉降法有核细胞回收率为83.60%±9.44%，自然沉降法有核细胞回收率为
86.40%±8.49%，二者之间差异无显著性意义（P>0.05），但离心沉降法所需时间更短，操作简便，更适合脐带血库。
2.2复苏后有核细胞回收率和存活率
4种冻存液冻存的细胞复苏后有核细胞回收率和存活率结果见表1。
结果表明：第4种冷冻保护剂冻存的细胞复苏后有核细胞回收率与前3种的差异有极显著意义（P0.05）；4种冷冻保护剂复苏细胞存活率的差异有极显著意义（P
2.3复苏后流式分析和祖细胞培养
4种冷冻保护剂冻存的细胞复苏流式分析和祖细胞培养结果见表2。
4种冷冻保护剂冷冻的细胞复苏CD34+回收率和祖细胞回收率的差异均有极显著意义（P
三、结果与讨论
分离脐带血造血干细胞方法常采用分选法、羟乙基淀粉沉淀法和密度梯度离心法。
由于目的不同，各类方法有其自身特点。
分选法使用磁珠或流式细胞配合相应单克隆抗体分离得到较纯的细胞群体，但细胞回收率较低，且成本昂贵，适合对细胞纯度要求较高的研究；密度梯度离心法多采用Percoll、Ficoll 分离液分离细胞，得到单个核细胞群，但纯度不高；羟乙基淀粉沉淀法，分离的细胞量大、成分较多但红细胞含量高，适合脐带血库等用于大量分离储存干细胞。
本研究对脐带血库常用的羟乙基淀粉自然沉降法和离心沉降法的有核细胞回收率进行了比较，结果显示两种方法差异无统计学意义，离心沉降法效率更高。
参考文献：
[1]刘献志，刘紫辉，杨波.脐血造血干细胞分离方法的实验研究[J].医药论坛杂志，2007（05）：52-54.。