Ⅱ 微生物发酵产酶
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微生物发酵产酶
放线菌产酶举例
链霉菌：葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、碱 性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。
3、霉菌（molds）
霉菌:是一类丝状真菌。构成霉菌菌（个）体的基本单位称为 菌丝（hyphae），呈长管状，可不断自前端生长并分支。在 固体基质上生长时，部分菌丝深入基质吸收养料，称为基质 菌丝或营养菌丝；向空中伸展的称气生菌丝，可进一步发育 为繁殖菌丝，产生孢子。大量菌丝交织成绒毛状、絮状或网 状等，称为菌丝体（mycelium）。菌丝体常呈白色、褐色、 灰色，或呈鲜艳的颜色，有的可产生色素使基质着色（如赤 霉菌等）。霉菌繁殖迅速，常造成食品、用具大量霉腐变质， 但许多有益种类已被广泛应用，是人类实践活动中最早利用 和认识的一类微生物。
酶生物合成与生长关联式比较 同步合成型 中间合成型 延续合成型 滞后合成型
酶合成起 始时间
酶合成停 止时间 产酶与生 长相关特 点 生长与酶 合成偶联 度 酶mRNA稳 定性
生长开始
平衡期 同起同停
对数期 平衡期 晚起同停
生长开始 平衡期后 同起晚停
平衡期
衰亡期 晚起晚停
紧密偶联 不稳定
偶联 不稳定
选择与改造
选择：在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵 周期，最理想的合成模式是延续合成型。
改造非理想模式：在细胞选育上下功夫，并适当调节工艺 条件：
（1）同步合成型： 适当降低发酵温度，尽量提高酶所对应的mRNA的稳定性。 （2）中期合成型： 要从解除阻遏和提高mRNA的稳定性两方面进行努力。 （3）滞后合成型 在发酵过程中要尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使 酶的合成提早开始。
色氨酸过量时会阻遏催化色氨酸合成的相关酶
× E A→→ →→ →B
02第二章 微生物发酵产酶
目的：保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接种于新鲜 的斜面培养基上，在一定的条件下培养，以恢复细胞的生命
活动能力。 方法：在试管斜面上培养1～3代。
食品与生物工程学院
Henan University of Science and Technology
（2）扩大培养
目的：活化后的菌种经过一级至数级的扩大培养，以获
里氏木霉、黑曲霉 木霉、曲霉、根霉 枯草芽胞杆菌，黑曲霉 产气克雷伯氏菌，芽孢杆菌 乳酸酵母，米曲霉，黑曲霉，米根霉 曲霉、欧文氏菌
水洗布生产，饲料添加剂，消化植物细胞壁 饲料添加剂，消化植物细胞壁，低聚木糖生产 啤酒酿造，饲料添加剂 淀粉加工 乳品工业（处理牛乳和乳清） 水果加工，果汁、果酒澄清，麻类纤维脱胶
转化酶 凝乳酶 脂肪酶
啤酒酵母、假丝酵母 米赫毛霉、大肠杆菌和真菌生产的重组酶 曲霉、根霉、酵母等
制造转化糖 制造乳酪 加酶洗涤剂，油脂加工，生物化工
葡萄糖氧化酶
葡萄糖异构酶 青霉素酰化酶
青霉、曲霉
凝结芽胞杆菌，白色链霉菌 细菌、霉菌、放线菌
食品去氧、除葡萄糖，测定葡萄糖
生产果葡糖浆 制造6-氨基青霉烷酸
培养过程的实时监测。
食品与生物工程学院
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二、培养基的配制
培养基是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物 质的混合物。
培养基的营养成分一般包括碳源、氮源，无机盐、生长因 子等。
食品与生物工程学院
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活动能力。 方法：在试管斜面上培养1～3代。
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（2）扩大培养
目的：活化后的菌种经过一级至数级的扩大培养，以获
里氏木霉、黑曲霉 木霉、曲霉、根霉 枯草芽胞杆菌，黑曲霉 产气克雷伯氏菌，芽孢杆菌 乳酸酵母，米曲霉，黑曲霉，米根霉 曲霉、欧文氏菌
水洗布生产，饲料添加剂，消化植物细胞壁 饲料添加剂，消化植物细胞壁，低聚木糖生产 啤酒酿造，饲料添加剂 淀粉加工 乳品工业（处理牛乳和乳清） 水果加工，果汁、果酒澄清，麻类纤维脱胶
转化酶 凝乳酶 脂肪酶
啤酒酵母、假丝酵母 米赫毛霉、大肠杆菌和真菌生产的重组酶 曲霉、根霉、酵母等
制造转化糖 制造乳酪 加酶洗涤剂，油脂加工，生物化工
葡萄糖氧化酶
葡萄糖异构酶 青霉素酰化酶
青霉、曲霉
凝结芽胞杆菌，白色链霉菌 细菌、霉菌、放线菌
食品去氧、除葡萄糖，测定葡萄糖
生产果葡糖浆 制造6-氨基青霉烷酸
培养过程的实时监测。
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二、培养基的配制
培养基是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物 质的混合物。
培养基的营养成分一般包括碳源、氮源，无机盐、生长因 子等。
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第二章 微生物发酵产酶
基因操纵子调节系统示意图
操纵子
控制区
调节基因 启动基因 操纵基因
信息区
结构基因 DNA
转录
RNA聚合酶 翻译
（ -） （+） 转录
mRNA 翻译
阻遏蛋白
蛋白质
诱导剂
(二) 酶合成调节的类型
1.诱导 (induction)
组成酶：细胞固有的酶类。
诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似 物而临时合成的一类酶。
固定化酶的优点
多次使用 可以连续反应 优点 纯化简单 提高产物质量 应用范围广
固定化原生质体的优点
☻属于胞内产物的胞内酶等分泌到胞外
☻稳定性较好，可以连续或重复使用较长时间
第一节 酶生物合成的基本理论
提取分离法 酶的生产方法 生物合成法
微生物细胞发酵产酶 植物细胞发酵产酶
化学合成法
动物细胞发酵产酶
启动子（promotor) 终止子(terminator)
3 5 ´ ´ DNA
编码链 (coding strand) 有意义链(sense strand)
5´ 3´
反意义链:指导转录作用的一条DNA链 有意义链:无转录功能的一条DNA链.
5’ 3’
有意义链
TC GAG TAC AG C T CATG C GAGUAC 5’ 3’
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
A、乳糖操纵子的结构
调节 基因 R
启 动 操纵 子 基因
P O LacZ
乳糖结构基因
LacY Laca
mRNA
基
阻遏蛋白 （有活性）
因
关
闭
B、乳糖酶的诱导
调节 基因
R mRNA
启 动 操纵 子 基因 P O
第二章 微生物发酵产酶
第二章 微生物发酵产酶
本章内容
酶的发酵生产的概念——→ 酶的发酵生产的概念——→优良菌种的筛 选——→发酵的基本类型——→发酵工艺 ——→发酵的基本类型——→ 过程及条件控制 *酶的生物合成模式
在酶制剂发展的早期，酶多是从动植物原 料中提取的。但是由于它们的生长周期长， 酶在动植物组织中的含量低，又受地理、 气候和季节等因素的影响，来源受到限制， 不适于大规模的工业生产，因此除了部分 用于医疗、疾病诊断及食品工业的酶外， 目前基本都是以微生物作为生产酶的酶源， 产酶微生物的发酵技术在酶生产中是极为 重要的。
培养基pH不仅影响微生物的生长和产酶，而且对 酶的分泌也有作用。有些细胞可以同时产生多种 酶，通过控制培养基的pH值，往往可以改变各种 酶之间的产量比例。 所以在细胞培养和发酵过程中，必须对培养基的 pH值进行适当的控制和调节。pH值的调节可以通 过改变培养基的组分或其比例来实现。必要时可 使用缓冲溶液，或流加适宜的酸、碱溶液，以调 节控制培养基中pH值的变化。
六、提高酶产量的措施 1、添加诱导物 对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加诱导物 能使酶的产量显著增加。一般可分为三类： ①酶的作用底物，例如乳糖诱导-半乳糖苷酶的生成， 酶的作用底物，例如乳糖诱导 青霉素是青霉素酚化酶的诱导物。 ②酶的反应产物，例如纤维素二糖可诱导纤维素酶的 酶的反应产物，例如纤维素二糖可诱导纤维素酶的 产生。 ③酶的底物类似物，例如异丙基--D-硫代半乳糖苷 酶的底物类似物，例如异丙基（IPTG）对-半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百 IPTG）对 倍。其中使用最广泛的诱导物是不参与代谢的底物 类似物。
四、温度的调节控制 细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有 所不同，而且往往低于最适生长温度，这是由于 在较低的温度条件下，可提高酶的稳定性，延长 细胞产酶时间。 有些酶的发酵生产，要在不同阶段控制不同 的温度条件。在生长繁殖阶段控制在细胞生长最 适温度范围内，以利于细胞生长繁殖，而在产酶 阶段，则需控制在产酶的最适温度。
本章内容
酶的发酵生产的概念——→ 酶的发酵生产的概念——→优良菌种的筛 选——→发酵的基本类型——→发酵工艺 ——→发酵的基本类型——→ 过程及条件控制 *酶的生物合成模式
在酶制剂发展的早期，酶多是从动植物原 料中提取的。但是由于它们的生长周期长， 酶在动植物组织中的含量低，又受地理、 气候和季节等因素的影响，来源受到限制， 不适于大规模的工业生产，因此除了部分 用于医疗、疾病诊断及食品工业的酶外， 目前基本都是以微生物作为生产酶的酶源， 产酶微生物的发酵技术在酶生产中是极为 重要的。
培养基pH不仅影响微生物的生长和产酶，而且对 酶的分泌也有作用。有些细胞可以同时产生多种 酶，通过控制培养基的pH值，往往可以改变各种 酶之间的产量比例。 所以在细胞培养和发酵过程中，必须对培养基的 pH值进行适当的控制和调节。pH值的调节可以通 过改变培养基的组分或其比例来实现。必要时可 使用缓冲溶液，或流加适宜的酸、碱溶液，以调 节控制培养基中pH值的变化。
六、提高酶产量的措施 1、添加诱导物 对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加诱导物 能使酶的产量显著增加。一般可分为三类： ①酶的作用底物，例如乳糖诱导-半乳糖苷酶的生成， 酶的作用底物，例如乳糖诱导 青霉素是青霉素酚化酶的诱导物。 ②酶的反应产物，例如纤维素二糖可诱导纤维素酶的 酶的反应产物，例如纤维素二糖可诱导纤维素酶的 产生。 ③酶的底物类似物，例如异丙基--D-硫代半乳糖苷 酶的底物类似物，例如异丙基（IPTG）对-半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百 IPTG）对 倍。其中使用最广泛的诱导物是不参与代谢的底物 类似物。
四、温度的调节控制 细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有 所不同，而且往往低于最适生长温度，这是由于 在较低的温度条件下，可提高酶的稳定性，延长 细胞产酶时间。 有些酶的发酵生产，要在不同阶段控制不同 的温度条件。在生长繁殖阶段控制在细胞生长最 适温度范围内，以利于细胞生长繁殖，而在产酶 阶段，则需控制在产酶的最适温度。
第三章微生物发酵产酶描述
实验室的常用培养基：
细菌：牛肉膏/蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）； 放线菌：高氏1号合成培养基培养； 酵母菌：麦芽汁培养基； 霉菌：查氏合成培养基；
例如枯草芽孢杆菌： 一般培养：肉汤培养基或LB培养基； 自然转化：基础培养基； 观察芽孢：生孢子培养基； 产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；
4、酵母
（1）啤酒酵母（Saccharomyces cereviaiae）
细胞圆形、卵形、椭圆形或腊肠型。菌 落为白色，有光泽、平滑，边缘整齐。 营养细胞可直接变为子囊。 主要用于啤酒、酒类生产，还可产生丙 酮酸脱氢酶、醇脱氢酶等生产。
（2）假丝酵母（Candida）
细胞圆形、卵形或长形。无性繁殖为多 边牙殖，形成假菌丝，可生成孢子。菌 落为乳白色或奶油色。 可生产脂肪酶、尿酸酶、转化酶、醇脱 氢酶等。
3、提高产酶的措施- Translation
1、培养基
1）各种生物对营养的需求
动物 （异养） 碳源 氮源 能源 生长因子 无机元素 水分
糖类、脂肪 蛋白质及其降解物 与碳源同 维生素 无机盐 水
微生物
异养 糖、醇、有机酸等 蛋白质及其降解 物、有机氮化物、 无机氮化物、氮 与碳源同 有些需要维生素等 生长因子 无机盐 水 自养 二氧化碳、碳酸盐等 无机氮化物、氮 氧化无机物或利用日 光能 不需要 无机盐 水
三、产酶微生物的筛选与选育
1、产酶微生物的筛选
2、产酶微生物优良菌种的选育
诱变育种 原生质体融合 基因工程育种
第二节酶的发酵工艺条件及控制 一、微生物产酶方法
1、固体发酵法 2、液体发酵法
1、 固体发酵
最新2微生物发酵产酶
17
ATP
AMP
cAMP
葡萄糖效应模型
只要外界存在葡萄糖， 细胞会优先并迅速分解葡 萄糖产生大量ATP；
• AMP的浓度ATP产生因 此降低，使体内cAMP转化 为AMP，进而降低cAMP 浓度；
• 同时腺苷酸环化酶的活 性受到抑制。
最终结果：cAMP浓度 不足，无法形成CAPcAMP复合物，转录关闭。
在相关酶的生产中可以考虑加入酶的诱导物， 从而提高酶产量。
12
原核生物的调节理论
1. 酶合成的诱导作用 2. 分解代谢物的阻遏作用 3. 反馈抑制作用
13
2. 分解代谢物的阻遏作用
指一些物质经过分解代谢产生的物质会阻遏 某些酶生物合成的现象；
当培养基中含有多种能源物质（比如同时存 在葡萄糖和乳糖）时，微生物首先利用易于分解 利用的能源物质（葡萄糖），而这种首先被利用 的物质的分解可以阻碍微生物对另外一种能源物 质的利用。
子
诱导和分解代谢物阻遏调节，目的是为了不没有必 要的蛋白，避免浪费，提高自身环境适应力。
3. 反馈抑制作用
20
3. 反馈抑制作用
酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物 使酶的生物合成受到阻遏的现象。
色氨酸反馈阻遏 ----（阻遏型操纵子、衰减子）----
色氨酸作为色氨酸合成代谢的代谢终产物会反 过来抑制色氨酸合成代谢中的一系列酶！
葡萄糖效应（二次生长现象）
14
实验现象：
二次生长现象
• 细菌在只有葡萄糖的培养基中生长的时候， 可以利用葡萄糖。
• 细菌在以乳糖为单一碳源的培养基中生长的 时候，可以利用乳糖。
• 细菌在葡萄糖和乳糖培养基中生长的时候， 只利用葡萄糖，而不利用乳糖！
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ATP
AMP
cAMP
葡萄糖效应模型
只要外界存在葡萄糖， 细胞会优先并迅速分解葡 萄糖产生大量ATP；
• AMP的浓度ATP产生因 此降低，使体内cAMP转化 为AMP，进而降低cAMP 浓度；
• 同时腺苷酸环化酶的活 性受到抑制。
最终结果：cAMP浓度 不足，无法形成CAPcAMP复合物，转录关闭。
在相关酶的生产中可以考虑加入酶的诱导物， 从而提高酶产量。
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原核生物的调节理论
1. 酶合成的诱导作用 2. 分解代谢物的阻遏作用 3. 反馈抑制作用
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2. 分解代谢物的阻遏作用
指一些物质经过分解代谢产生的物质会阻遏 某些酶生物合成的现象；
当培养基中含有多种能源物质（比如同时存 在葡萄糖和乳糖）时，微生物首先利用易于分解 利用的能源物质（葡萄糖），而这种首先被利用 的物质的分解可以阻碍微生物对另外一种能源物 质的利用。
子
诱导和分解代谢物阻遏调节，目的是为了不没有必 要的蛋白，避免浪费，提高自身环境适应力。
3. 反馈抑制作用
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3. 反馈抑制作用
酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物 使酶的生物合成受到阻遏的现象。
色氨酸反馈阻遏 ----（阻遏型操纵子、衰减子）----
色氨酸作为色氨酸合成代谢的代谢终产物会反 过来抑制色氨酸合成代谢中的一系列酶！
葡萄糖效应（二次生长现象）
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实验现象：
二次生长现象
• 细菌在只有葡萄糖的培养基中生长的时候， 可以利用葡萄糖。
• 细菌在以乳糖为单一碳源的培养基中生长的 时候，可以利用乳糖。
• 细菌在葡萄糖和乳糖培养基中生长的时候， 只利用葡萄糖，而不利用乳糖！
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微生物发酵产酶
Back
抗体酶 （abzyme）
是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。
抗体酶制备的理论依据： 1948年， Pauling提出的过渡态理论； 1975年，Kohler和 Milstein发明的单克隆抗体制备技术； 1986年，Lerner和Schultz 分别获得具有催化活性的抗体酶。此 后，不少抗体酶被制备出来。
本章小结
1. 不是所有的微生物都能用于发酵产酶；
2. 微生物生长有4个时期，微生物培养产酶有4种方式，可根据 蛋白质生物合成理论、操纵子理论调节控制；
3. 影响微生物生长的环境因素有：培养基的组成、pH、温度、 溶解氧，精心调节，效益增加；
4. 固定化微生物发酵产酶是在传统方式上的一种新尝试，优点 很多。
一、酶生物合成的模式 二、细胞生长动力学 三、产酶动力学
酶生物合成的模式
细胞生长过程（4个阶段）： 调整期、生长期、平衡期、衰退期。
酶生物合成模式（4种）： P60图2－9 ➢ 同步合成型 ➢ 延续合成型 ➢ 中期合成型 ➢ 滞后合成型 结论：最理想的合成模式是延续合成型。
第五节 固定化微生物细胞发酵产酶 第六节 固定化微生物原生质体发酵产酶
P53
调节pH值的必要性: 培养基的pH值与细胞的生长、繁殖以及 发酵产酶关系密切。
pH值变化的原因：
细胞的生长和代谢产物的积累；
细胞特性；
培养基的组成成分；
P54
发酵工艺条件。
调节pH值常用的的方法：
改变培养基的组分或其比例； 使用缓冲液； 通过流加适宜的酸、碱溶液到培养 基中。
Back
产生一种阻遏 决定酶的合成
蛋白，由多个 是否开始，有
亚基组成。 两个位点：一
抗体酶 （abzyme）
是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。
抗体酶制备的理论依据： 1948年， Pauling提出的过渡态理论； 1975年，Kohler和 Milstein发明的单克隆抗体制备技术； 1986年，Lerner和Schultz 分别获得具有催化活性的抗体酶。此 后，不少抗体酶被制备出来。
本章小结
1. 不是所有的微生物都能用于发酵产酶；
2. 微生物生长有4个时期，微生物培养产酶有4种方式，可根据 蛋白质生物合成理论、操纵子理论调节控制；
3. 影响微生物生长的环境因素有：培养基的组成、pH、温度、 溶解氧，精心调节，效益增加；
4. 固定化微生物发酵产酶是在传统方式上的一种新尝试，优点 很多。
一、酶生物合成的模式 二、细胞生长动力学 三、产酶动力学
酶生物合成的模式
细胞生长过程（4个阶段）： 调整期、生长期、平衡期、衰退期。
酶生物合成模式（4种）： P60图2－9 ➢ 同步合成型 ➢ 延续合成型 ➢ 中期合成型 ➢ 滞后合成型 结论：最理想的合成模式是延续合成型。
第五节 固定化微生物细胞发酵产酶 第六节 固定化微生物原生质体发酵产酶
P53
调节pH值的必要性: 培养基的pH值与细胞的生长、繁殖以及 发酵产酶关系密切。
pH值变化的原因：
细胞的生长和代谢产物的积累；
细胞特性；
培养基的组成成分；
P54
发酵工艺条件。
调节pH值常用的的方法：
改变培养基的组分或其比例； 使用缓冲液； 通过流加适宜的酸、碱溶液到培养 基中。
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产生一种阻遏 决定酶的合成
蛋白，由多个 是否开始，有
亚基组成。 两个位点：一
微生物的发酵与产酶过程
微生物的发酵与产酶过程微生物的发酵与产酶过程是一种重要的生物技术，在食品工业、药品制造以及环境保护等领域扮演着重要角色。
微生物发酵通过利用微生物的代谢作用，将有机废弃物转变为有用的化合物，产酶则是指微生物在发酵过程中产生并分泌的特定酶类。
本文将从微生物发酵和产酶的定义、发酵与产酶的应用以及发酵与产酶的前景等方面来探讨微生物的发酵与产酶过程。
一、微生物发酵和产酶的定义微生物发酵是指在合适的条件下，利用微生物的代谢活动，通过控制发酵过程，获得所需产物的一种生物技术。
微生物发酵一般分为液态发酵和固态发酵两种形式。
液态发酵常用于大规模工业生产，而固态发酵则更适用于小规模生产和特定产品的制备。
产酶是微生物在发酵过程中分泌的特定酶类，这些酶能够催化特定底物的转化反应。
产酶的种类很多，包括脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶等。
这些酶在医药、食品、化工等行业中具有重要的应用价值。
二、发酵与产酶的应用1. 食品工业中的应用微生物发酵在食品工业中被广泛应用。
例如，嗜酸乳杆菌可以发酵牛奶，制成酸奶。
酸奶中的乳酸菌有助于改善肠道菌群，增强人体免疫能力。
此外，假丝酵母菌的发酵可以产生酵母、面包、啤酒等食品。
2. 药品制造中的应用微生物发酵在药品制造中也起到重要的作用。
通过微生物发酵，可以产生多种药用物质，如抗生素、肽类药物等。
其中，青霉素是一种广泛应用的抗生素，通过青霉菌的发酵生产得到。
3. 环境保护中的应用微生物发酵还可以应用于环境保护领域。
例如，利用微生物发酵处理有机废弃物，可以将废物转化为有机肥料或生物柴油。
这种方法不仅能减少废弃物对环境的污染，还能获得可再利用的资源。
三、发酵与产酶的前景微生物的发酵与产酶技术在许多领域都显示出广阔的应用前景。
随着科学技术的不断发展，微生物的发酵与产酶技术也在不断创新和改进。
以下是展望微生物发酵与产酶技术的几个发展方向。
1. 高效产酶菌株的筛选与改造在微生物发酵过程中，寻找和改造高产酶菌株是提高产酶效率的关键。
2微生物发酵产酶
(2) 醋酸杆菌（Acetobacter）
菌体从椭圆至杆状，单个、 成对或成链，革兰氏阴性， 运动（周毛）或不运动，不 生芽孢。好气。含糖、乙醇 和酵母膏的培养基上生长良 好。
应用：有机酸(食醋等）葡萄 糖异构酶(高果糖浆 )山梨糖 (维C中间体）。
(3)枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
分类：多数属于子囊菌亚门，少数 属于半知菌亚门。
分布：广泛分布于土壤、空气和谷 物上，可引起食物、谷物和果蔬的 霉腐变质，有的可产生致癌性的黄 曲霉毒素。
代表种：黑曲霉Asp. Niger、黄曲霉 Asp.flavus
应用：是制酱、酿酒、制醋的主要 菌种。是生产酶制剂（蛋白酶淀粉 酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸 （如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业 上用作生产糖化饲料的菌种。
(7) 啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)
应用： 啤酒、酒类生产； 生产转化酶、 丙酮酸脱羧酶、 醇脱氢酶等。
不同类型工业酶的比例
蛋白酶：59% 淀粉酶：5% 果胶酶：3% 脂肪酶：3%
糖化酶：13% 葡萄糖异构酶：6% 纤维素酶：1% 医药与分析研究用酶：10%
游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基：糖蜜2%，豆饼粉2%，磷酸氢二钠 0。1%，硫酸镁0。05% (pH 7.2)。
桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%, 硫酸镁 0.05%, 氯化钙0.04%, 磷酸氢二钠0.05%, 磷酸二氢钾0.05% (自然pH)。
黑曲霉AS3.396果胶酶发酵培养基: 麸皮5%, 果胶0.3%, 硫酸铵2%, 磷酸二 氢钾0.25%, 硫酸镁0.05%, 硝酸钠0.02%, 硫酸亚铁0.001% (自然pH)。
《酶工程》课件-微生物发酵产酶
05
微生物发酵产酶存在问题与挑战
产量问题
微生物发酵产酶产量低
由于微生物发酵过程中受到多种因素 的影响，如营养物质的供应、发酵条 件、微生物菌种等，导致酶的产量较 低。
发酵周期长
微生物发酵产酶通常需要较长的发酵 周期，这增加了生产成本和时间成本。
稳定性问题
酶稳定性差
许多酶在发酵过程中容易受到温度、pH值、金属离子等因素的影响，导致酶的稳定性降低。
04
微生物发酵产酶应用实例
工业应用
洗涤剂制造
微生物发酵产生的酶可用于制造 洗涤剂，如蛋白酶用于去除蛋白 质污渍，淀粉酶用于去除淀粉污
渍。
纺织工业
利用微生物发酵产生的酶处理纺织 品，可以改善其质地、手感和外观， 如纤维素酶用于棉织物的生物抛光。
造纸工业
通过微生物发酵产酶技术，可以改 进造纸工艺，提高纸张质量和降低 环境污染，如木聚糖酶用于纸浆漂 白。
过程优化与控制
通过人工智能技术，对微生物发酵产酶过程进行建模和优化，提高 目标酶的产量和质量。
个性化定制酶
结合人工智能和基因工程技术，实现个性化定制酶的合成，满足不 同领域的需求。
THANKS
感谢观看
《酶工程》课件-微生物发酵 产酶
• 微生物发酵产酶概述 • 微生物发酵产酶原理与过程 • 微生物发酵产酶技术与方法
• 微生物发酵产酶应用实例 • 微生物发酵产酶存在问题与挑战 • 未来发展趋势与展望
01
微生物发酵产酶概述
酶工程简介
酶工程定义
酶工程是生物工程的重要组成部分，是利用酶或者微生物细胞、动植物细胞、 细胞器等具有的生物催化功能，借助工程手段来生产有用物质、设计改造酶或 者生产细胞、器官乃至整个生物体的一门科学技术。
酶工程_02-微生物发酵产酶
阻遏物（repressor）
一般是酶催化反应的产物或
B. 有阻遏物 … R P O S1 S2 …
代谢途径的末端产物
阻遏物 +
阻遏物
阻遏蛋白 O基因
Enzyme Engineering
酶生物合成的模式（重点）
微生物细胞生长曲线（四阶段）
延迟期（调整期） 生长期（对数生长期） 平衡期 衰退期
酶是蛋白质 ——
微生物发酵产酶
如何获得蛋白？—— 蛋白生物合成
从基因到蛋白质：遗传信息的传递 ——
复制
中心法则
Active Enzyme
DNA
转录 逆转录
RNA
翻译 ？
Protein
折叠
要生物合成一个酶，首先应知道这个酶对应的基因 生成的多肽链必须经过正确的加工修饰，并正确折叠，
才能生成有活性的酶
微生物发酵产酶
Cell amount
酶的生物合成模式（四类）
—— 根据酶产生与细胞生长的关系
同步合成型 延续合成型 中期合成型 滞后合成型
0
A
B Time
C
D
Enzyme Engineering
酶生物合成的模式
酶生物合成的四种模式
酶生物合成的调节
微生物发酵产酶
—— 转录水平
调节模式 1：分解代谢物阻遏作用
某些物质（容易利用的碳源）经过分解代谢产生的物质阻遏了某
些诱导酶生物合成的现象
连锁效应
实质 —— 解决 ——
cAMP 通过启动基因调控酶的合成 添加 cAMP，控制易用碳源的用量
Enzyme Engineering
操纵子 ——
一般是酶催化反应的产物或
B. 有阻遏物 … R P O S1 S2 …
代谢途径的末端产物
阻遏物 +
阻遏物
阻遏蛋白 O基因
Enzyme Engineering
酶生物合成的模式（重点）
微生物细胞生长曲线（四阶段）
延迟期（调整期） 生长期（对数生长期） 平衡期 衰退期
酶是蛋白质 ——
微生物发酵产酶
如何获得蛋白？—— 蛋白生物合成
从基因到蛋白质：遗传信息的传递 ——
复制
中心法则
Active Enzyme
DNA
转录 逆转录
RNA
翻译 ？
Protein
折叠
要生物合成一个酶，首先应知道这个酶对应的基因 生成的多肽链必须经过正确的加工修饰，并正确折叠，
才能生成有活性的酶
微生物发酵产酶
Cell amount
酶的生物合成模式（四类）
—— 根据酶产生与细胞生长的关系
同步合成型 延续合成型 中期合成型 滞后合成型
0
A
B Time
C
D
Enzyme Engineering
酶生物合成的模式
酶生物合成的四种模式
酶生物合成的调节
微生物发酵产酶
—— 转录水平
调节模式 1：分解代谢物阻遏作用
某些物质（容易利用的碳源）经过分解代谢产生的物质阻遏了某
些诱导酶生物合成的现象
连锁效应
实质 —— 解决 ——
cAMP 通过启动基因调控酶的合成 添加 cAMP，控制易用碳源的用量
Enzyme Engineering
操纵子 ——
微生物发酵产酶
个性：酶作为生物催化剂的特点是催化效率更高，具有高度的专一性，容易失活，活力1.共性：用量少而催化效率高；仅能改变化学反应的速度，不改变化学反应的平衡点，酶本身在化学反应前后也不改变；可降低化学反应的活化能。
酶的生产方法提取分离法生物合成法化学合成法。
提取分离法采用各种提取、分离、纯化技术从动物、植物的组织、器官、细胞或微生物细胞中将酶提取出来，再进行分离纯化的技术过程。
◆酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。
主要的提取方法有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。
◆酶的分离纯化是采用各种生化分离技术，诸如：离心分离、过滤与膜分离、萃取分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、以及浓缩、结晶、干燥等，使酶与各种杂质分离，达到所需的纯度，以满足使用的要求。
生物合成法◆据所使用的细胞种类不同，生物合成法可以分为微生物发酵产酶，植物细胞培养产酶和动物细胞培养产酶。
自从1949年细菌α-淀粉酶发酵成功以来，生物合成法就成为酶的主要生产方法。
◆生物合成法产酶首先要经过筛选、诱变、细胞融合、基因重组等方法获得优良的产酶细胞，然后在人工控制条件的生物反应器中进行细胞培养，通过细胞内物质的新陈代谢作用，生成各种代谢产物，再经过分离纯化得到人们所需的酶。
化学合成法采用合成仪进行酶的化学合成,成本高,难以工业化生产。
用途：酶的人工模拟和化学修饰，对认识和阐明生物体的行为和规律，具有重要的理论意义和发展前景。
◆模拟酶是在分子水平上模拟酶活性中心的结构特征和催化作用机制，设计并合成的仿酶体系。
◆大分子仿酶体系有分子印迹酶模型和胶束酶模型等。
Chapter 2The production of Enzyme by Fermentation of Microorganism 微生物发酵产酶酶的生产方法提取分离法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化学合成(chemicalsynthesis)SOD -bloodPapain-Papaya Chymotrypsin-Pancrea ……organ/tissue/cell Amylase from BacillusProtease from BacillusPhosphatase from BacillusGlucoamylase from Aspergillus……Plant cell cultureAnimal cell cultureFew example酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工操作，利用微生物的生命活动，获得所需的酶的技术过程。
酶工程第二章微生物发酵产酶
细胞 浓度 mg/ml
酶 浓度 U/ml
细胞 浓度 mg/ml
酶 浓度 U/ml
以半乳糖醛酸为诱导物
以含有葡萄糖的果胶为诱导物
2、延续合成型
特点： 延续合成型的酶其生物合成可以受诱导物的诱
导，一般不受分解代谢物阻遏。 mRNA相当稳定。
3、滞后合成型
此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成 并大量积累。又称为非生长偶联型。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。
合成速率影响不大。如：DNA聚合酶、RNA聚 合酶、糖酵解途径的各种酶等。 适应型酶(adaptive enzyme)（调节型酶 regulated enzyme）： 在细胞中的含量变化很大，合成速率明显受到 环境因素的影响。如大肠杆菌分解乳糖的酶。 调节对象：适应型酶（调节型酶）
二、酶生物合成的调节
多种微生物混合发酵，保证有益微生物正常生长 繁殖和发酵代谢；
固态甑桶蒸馏提取成品酒。大曲酒酿造分为清渣 法和续渣法两种。
液体深层发酵
培养基：液体，在生物反应器中 优点： 适用范围广 机械化程度较高，技术管理较严格，酶的产率
较高，质量较稳定，产品回收率较高。 是目前发酵生产的主要方式。
制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等
(2) 醋酸杆菌（Acetobacter）
理想的酶合成模式
对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程\细胞工程等 先进技术,选育得到优良的菌株, 并通过工艺条件的优化 控制, 使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型。
对于同步合成型的酶，要尽量提高其对应的mRNA的稳定性，
为此适当降低发酵温度是可取的措施；
对于滞后合成型的酶，要设法降低培养基中阻遏物的浓度，
酶工程第二章微生物发酵产酶
5.可以利用以基因工程为主的近代分子生物学技术，选 育菌种、增加酶产率和开发新酶种。
第二第页二页，，课课件件共共有有14124页2页
第一节 酶的生产菌种
目前投入工业发 酵生产的酶约有50-60 种。
它们的生产菌种十分 广泛，包括细菌、放线 菌、酵母菌、霉菌。
第三第页三页，，课课件件共共有有14124页2页
三是菌种不易变异退化，产酶性能稳定，不易感染噬菌体； 四是产生的酶容易分离纯化，最好选用产生胞外酶的菌
种，有利于酶的分离，回收率高。
此外，在食品和医药工业上还应考虑安全性问题。
第四第页四，页，课课件件共共有有1421页42页
1977年，联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织 （ WHO） 的 食 品 添 加 剂 专 家 联 合 委 员 会 （ JEFA） 就 有关酶的生产应用安全问题提出了如下意见：
应用：
大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖；
大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌；
工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和
制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等。
第十一第十页一，页，课课件件共共有1有42页142页
大肠杆菌可以用于生产 多种酶。
大肠杆菌产生的酶一般都 属于胞内酶，需要经过细 胞破碎才能分离得到。
产酶菌种的筛选方法
产酶菌种的筛选方法与发酵工程中微生物的筛选 方法一样,主要包括以下几个步骤:
含菌样品的采集、菌种分离、产酶性能测定及复筛等。
对于胞外酶的产酶菌株,经常采用分离定性和半定 量测定产酶性能相结合的方法,使之在培养皿分离时 就能大致了解菌株的产酶性能，具体操作如下：
将酶的底物和培养基混合倒入培养皿中制成平板， 然后涂布含菌的样品，如果长出的菌落周围底物发 生变化,即证明它产酶。
第二第页二页，，课课件件共共有有14124页2页
第一节 酶的生产菌种
目前投入工业发 酵生产的酶约有50-60 种。
它们的生产菌种十分 广泛，包括细菌、放线 菌、酵母菌、霉菌。
第三第页三页，，课课件件共共有有14124页2页
三是菌种不易变异退化，产酶性能稳定，不易感染噬菌体； 四是产生的酶容易分离纯化，最好选用产生胞外酶的菌
种，有利于酶的分离，回收率高。
此外，在食品和医药工业上还应考虑安全性问题。
第四第页四，页，课课件件共共有有1421页42页
1977年，联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织 （ WHO） 的 食 品 添 加 剂 专 家 联 合 委 员 会 （ JEFA） 就 有关酶的生产应用安全问题提出了如下意见：
应用：
大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖；
大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌；
工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和
制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等。
第十一第十页一，页，课课件件共共有1有42页142页
大肠杆菌可以用于生产 多种酶。
大肠杆菌产生的酶一般都 属于胞内酶，需要经过细 胞破碎才能分离得到。
产酶菌种的筛选方法
产酶菌种的筛选方法与发酵工程中微生物的筛选 方法一样,主要包括以下几个步骤:
含菌样品的采集、菌种分离、产酶性能测定及复筛等。
对于胞外酶的产酶菌株,经常采用分离定性和半定 量测定产酶性能相结合的方法,使之在培养皿分离时 就能大致了解菌株的产酶性能，具体操作如下：
将酶的底物和培养基混合倒入培养皿中制成平板， 然后涂布含菌的样品，如果长出的菌落周围底物发 生变化,即证明它产酶。
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物生长模式：调整期、对数期、平衡期、衰亡期 • 产酶模式：1.同步合成型：调整期始产酶，平衡期始停产
2.中期合成型：对数期始产酶，平衡期始停产 3.滞后合成型：平衡期始产酶，衰退期始停产 4.延续合成型：调整期始产酶，衰退期始停产
※提高产酶能力的方法（变为延续合成型）
Ⅱ 微生物发酵产酶
一 生产工艺流程 收集筛选菌种 1.收集筛选菌种: 菌种保藏 2.菌种保藏： 3.细胞活化： 细胞活化 4.根据菌种选培养基扩大培养: 5.发酵管理:发酵
扩大培养
发酵管理：条件与控制
※工艺流程：收集筛选菌种→菌种保藏→细胞活化→扩 大培养→发酵管理
※收集、筛选菌种
1.用钱购买菌种 2.收集土样筛选菌种 ⑴收集土样 ⑵初筛：单菌落培养，用透明圈法选出产 目的酶的微生物（使用鉴定培养基） ⑶复筛：单菌落培养，选出符合优良菌种 要求的菌落（使用选择培养基）
3.气泡：⑴产生：搅拌发酵液增大溶氧量 ⑵危害：①阻碍CO2排出，使PH减 小，使发酵液变酸，影 响微生物生长、产酶 ②气泡过多会使菌液漫 出，造成菌种污染 ⑶消除方法：机械消泡、化学试剂 消泡、表面活性剂消 泡 4.湿度 ⑴开始：低 ⑵后来：高
5.提高酶产量的方法 ①加诱导物 微生物生长与产酶模式 ②减阻遏物 ③转基因（获得产酶能力强的微生物去产酶） ④加表面活性剂 ⑤加产酶促进剂
1.非调整期始产酶（中期、滞后）：有营养物阻遏效应，减少营
养阻遏物浓度
2.平衡期始停产（同步、中期）：mRNA不稳水解，降温使mRNA稳
※ 产酶微生物
1.菌种要求：繁殖力强(繁殖周期短) 产酶稳定，产酶能力强 安全(不用病菌) 利于发酵管理(易于发酵) 2.常用产酶微生物：略 ※单菌落培养法：稀释涂平板，长单菌落，易 于分离 ※透明圈法：例如:明胶作培养基可鉴别出产蛋白酶 的菌落(明胶是蛋白质,蛋白酶可分解明胶) CaCO3作培养基可鉴别出产酸菌落(产生 的酸可分解CaCO3,形成透明圈)
单菌落培养 透明圈法 优良菌种要求与常用菌种
※菌种保藏 菌种保藏方法： (1)斜面培养法 (2) (3) (4) (5) (6)
※细胞活化 保藏的菌种通常以芽孢形式存在（保藏时 营养缺乏），需放入营养充足的营养环境中 活化：芽孢→营养细胞
※扩大培养
1.定义：根据菌种特点配制培养基，使菌种 大量繁殖用于发酵 2.方法：种子罐培养；实验室培养 （工业生产） （实验室） 3.目的：使菌种大量繁殖，用于发酵 ※培养基配制：碳源、氮源、生长因子、无 机盐、水 ※C／N：碳源：糖→加碳源加C/N→酸性→利于菌种 保存（作保存培养基） 氮源：有机、无机→加氮源减C/N→碱性→ 利于酶制剂生产（产酶需N元素）
※发酵管理
1.温度、PH：最适生长温度、PH与最适产酶温度、PH不同,要实时监控、 调节温度、PH 温度：0-10oC;PH:酶活力范围内， 防酶变性 ※调PH方法：CaCO3（备用碱） 磷酸缓冲液：维持PH稳定 调C/N：只工业上适用，C/N↑→酸， C/N↓→碱 2.增大溶氧量：(1)搅拌，使大气泡变为很多小气 泡 (2)加大通入氧气量
2.中期合成型：对数期始产酶，平衡期始停产 3.滞后合成型：平衡期始产酶，衰退期始停产 4.延续合成型：调整期始产酶，衰退期始停产
※提高产酶能力的方法（变为延续合成型）
Ⅱ 微生物发酵产酶
一 生产工艺流程 收集筛选菌种 1.收集筛选菌种: 菌种保藏 2.菌种保藏： 3.细胞活化： 细胞活化 4.根据菌种选培养基扩大培养: 5.发酵管理:发酵
扩大培养
发酵管理：条件与控制
※工艺流程：收集筛选菌种→菌种保藏→细胞活化→扩 大培养→发酵管理
※收集、筛选菌种
1.用钱购买菌种 2.收集土样筛选菌种 ⑴收集土样 ⑵初筛：单菌落培养，用透明圈法选出产 目的酶的微生物（使用鉴定培养基） ⑶复筛：单菌落培养，选出符合优良菌种 要求的菌落（使用选择培养基）
3.气泡：⑴产生：搅拌发酵液增大溶氧量 ⑵危害：①阻碍CO2排出，使PH减 小，使发酵液变酸，影 响微生物生长、产酶 ②气泡过多会使菌液漫 出，造成菌种污染 ⑶消除方法：机械消泡、化学试剂 消泡、表面活性剂消 泡 4.湿度 ⑴开始：低 ⑵后来：高
5.提高酶产量的方法 ①加诱导物 微生物生长与产酶模式 ②减阻遏物 ③转基因（获得产酶能力强的微生物去产酶） ④加表面活性剂 ⑤加产酶促进剂
1.非调整期始产酶（中期、滞后）：有营养物阻遏效应，减少营
养阻遏物浓度
2.平衡期始停产（同步、中期）：mRNA不稳水解，降温使mRNA稳
※ 产酶微生物
1.菌种要求：繁殖力强(繁殖周期短) 产酶稳定，产酶能力强 安全(不用病菌) 利于发酵管理(易于发酵) 2.常用产酶微生物：略 ※单菌落培养法：稀释涂平板，长单菌落，易 于分离 ※透明圈法：例如:明胶作培养基可鉴别出产蛋白酶 的菌落(明胶是蛋白质,蛋白酶可分解明胶) CaCO3作培养基可鉴别出产酸菌落(产生 的酸可分解CaCO3,形成透明圈)
单菌落培养 透明圈法 优良菌种要求与常用菌种
※菌种保藏 菌种保藏方法： (1)斜面培养法 (2) (3) (4) (5) (6)
※细胞活化 保藏的菌种通常以芽孢形式存在（保藏时 营养缺乏），需放入营养充足的营养环境中 活化：芽孢→营养细胞
※扩大培养
1.定义：根据菌种特点配制培养基，使菌种 大量繁殖用于发酵 2.方法：种子罐培养；实验室培养 （工业生产） （实验室） 3.目的：使菌种大量繁殖，用于发酵 ※培养基配制：碳源、氮源、生长因子、无 机盐、水 ※C／N：碳源：糖→加碳源加C/N→酸性→利于菌种 保存（作保存培养基） 氮源：有机、无机→加氮源减C/N→碱性→ 利于酶制剂生产（产酶需N元素）
※发酵管理
1.温度、PH：最适生长温度、PH与最适产酶温度、PH不同,要实时监控、 调节温度、PH 温度：0-10oC;PH:酶活力范围内， 防酶变性 ※调PH方法：CaCO3（备用碱） 磷酸缓冲液：维持PH稳定 调C/N：只工业上适用，C/N↑→酸， C/N↓→碱 2.增大溶氧量：(1)搅拌，使大气泡变为很多小气 泡 (2)加大通入氧气量