微生物限度检查方法及其验证报告(修改)
《中国药典》微生物限度检查法及其方法学验证
微生 物 限 度 检 查 法 是 检 查 非 规 定 灭 菌 制 剂 及 其 原 、 料 受 微 生 物 污染 程 度 的 方 法 ， 查 项 目包 括 细 菌 辅 检 数 、 菌 数 、 母 菌数 及 控 制菌 检查 。与 《 国药 典 》 霉 酵 中
２０ ０ ０年 版 （ 下 简 称 ２ ０ 以 ０ ０版 ） 比 ，０ ５版 微 生 物 限 度 相 ２０ 检 查 法 在 以 下 几 方 面 进 行 了增 修 订 。 １ 标准的制订原则 ：
２ 标 准的分类 ：
微 生物 试 验 的 结 果 易 受 试 验 条 件 的 影 响 ， 别 是 特
药 品 中 含 有 对 微 生 物 生 长 有 抑 制 作 用 组 分 时 表 现 较 为 突 出。 因 此 ， 进 行 微 生 物 限 度 检 查 时 ， 保 证 在 检 验 在 应 条 件 下 的样 品 浓 度 不 足 以抑 制 污 染 微 生 物 的 生 长 ， 以 保 证结 果 的 准 确 性 。所 以 任何 产 品 的 微 生 物 限 度 检 查 法 均需 验 证 ， 认 所 采 用 的 方 法 适 合 于 样 品 的 微 生 物 确 限 度 检 查 ， 可 使 用 。为 此 ，０５年 版 ＜ 国药 典》 录 方 ２０ 中 附
维普资讯
２ ０ 年 ６月 ０８
《 国 药 典 》 生 物 限 度 检 查 法 及 其 方 法 学 验 证 中 做
６ ５
《 国药 典》 生 物 限度 检 查 法及 其 方 法 学 验 证 中 微
肖庆 青
（ 西 省 医药 学 校 江西 南 昌 ３００ ） 江 ３２０
中 的微 生 物 限 度 Fra bibliotek 查 法 增 加 了方 法 验 证 试 验 的要 求 。
纯化水微生物限度检查法验证方案和验证报告
*******有限公司验证文件纯化水微生物限度检查法验证案纯化水微生物限度检查法验证案起草、审核、批准：验证组织：目录1.验证目的2.验证人员职责3.参照标准4.验证项目容5.评价合格标准6.验证试验材料7.验证实施计划8.菌液制备9.供试液制备10.计数法验证11.控制菌检查法验证12.验证结论和评价纯化水微生物限度检查法验证案1. 验证目的：纯化水微生物限度试验采用薄膜过滤法检查。
确认该法适合于纯化水细菌、霉菌及酵母菌数测定，控制菌的测定。
2．验证人员职责2.1验证领导小组：2、1、1负责验证案及报告的批准2、1、2组织协调验证工作2、1、3签发验证证书。
2.2.项目验证小组长2.2.1.负责验证案的起草2.2.2.负责验证的协调工作，以保证本验证案的顺利实施。
2.2.3.负责验证报告的起草。
2.2.4.负责再验证期的确认。
2．3. 质量部2．3.1.负责验证案审核2．3.2.负责取样及对样品的检验2．3.3.负责收集验证记录，并加以分析后，协助项目验证小组长起草验证报告。
2．3.4.负责验证数据及结果的审核3. 参照标准：2010版中国药典一部附录XIII微生物限度检查法。
4. 验证项目容：细菌、霉菌及酵母菌计数法的验证，控制菌检查法验证。
5. 评价合格标准：试验组的菌回收率和稀释剂对照组的菌回收率均不得低于70%。
6. 验证试验材料：6.1. 被验证产品：品名纯化水取样点：（1）4T/h纯水系统二级反渗透装置进纯水箱口;(2) 4T/h纯水系统液体制剂二楼洁具间用水点；(3) 4T/h纯水系统三楼固体制剂纯水箱总回水口。
检验量5ml /次6.2. 仪器设备：6.2.1. YX.400A电热蒸汽压力消毒器6.2.2 YS－840净化工作台6.2.3. 101型电热干燥箱6.2.4. SPX-250B型生化培养箱6.2.5.PYX-DUS-X型隔水式电热恒温培养箱6.2.6 303A-4型电热培养箱6.2.7 天平6.3. 稀释剂：PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液；0.9%的无菌氯化钠溶液6.4. 验证用培养基6.5. 验证用菌株：7、验证设施计划8. 菌液制备8.1.大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌悬液的制备①取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜斜面培养物1白金耳接种至10ml营养肉汤培养基中，35℃培养18~24小时。
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
3.1.7器具：无菌薄膜过滤器：（孔径直径50mm）、无菌移液管（5ml）4.验证方法菌液的制备将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在30～35℃下培养18～24小时，将白色念珠菌接种至改良马丁液体培养基中，在23～28℃下培养24～48小时。
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理1.1验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
1.2原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤2.1验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
2.2验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
2.3试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施3.1试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于4.9pa。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理1.1验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
1.2原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤2.1验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
2.2验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
2.3试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施3.1试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于4.9pa。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
微生物限度方法验证报告范文
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药品微生物限度检测方法验证报告
阿莫**微生物限度检测方法验证报告摘要通过此次验证证明薄膜过滤法可用于含抑菌成分的阿莫**微生物限度菌数的检验，提高抗菌药物的检出率和回收率。
阿莫**微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检测方法，包括染菌量及控制菌的检查。
微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单相流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。
此方法能有效消除阿莫**的抑菌性，同时不会影响阿莫**中可能存在的微生物生长，采用此方法可以使阿莫**中的微生物检出，从而确保了检验结果的准确性、可靠性及检验方法的完整性。
关键词：阿莫**，验证，菌种，供试品。
前言随着人们质量意识的提高，人们对阿莫**质量检验指标中微生物限度的要求也越来越高，由于抗生素类药物的活性成分直接影响微生物在培养基中正常生长，选择正确的检测方法，提高抗菌药物的检出率是解决问题的关键，通过对阿莫**微生物限度检测方法----薄膜过滤法的验证，可以证明所采用的方法能有效消除阿莫**的抑菌性，同时不会影响阿莫**中可能存在的微生物生长，采用此方法可以使阿莫**中的微生物得以检出，确保检验结果的准确性、可靠性及检验方法的完整性。
微生物限度检查法验证方案(修订版)
审批及颁发：会审：分发：一、目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
二、范围本公司注射用水及纯化水的微生物限度检查。
三、职责验证组织及人员职责四、术语无五、内容1概述：按照中国药典2010版（第二部），采用薄膜过滤法进行微生物限度检查，验证所采用的方法和条件适合于供试品的微生物限度检查。
2验证项目3 验证时间安排3.1 2013年04月01日至 2013 年04月05日制订、审核及批准验证方案；3.2 2013年04月06日至 2013 年04月 15日实施验证3.3 2013年04月16日至 2013年04月 20日写出验证报告4 验证前提条件确认4.1 相关文件及人员培训确认4.1.1 相关文件确认结论: 检查人/日期：复核人/日期：4.1.2 验证人员确认结论: 检查人/日期：复核人/日期：4.2 验证用仪器仪表和物品有效性确认结论:检查人/日期：复核人/日期：4.3菌液制备4.3.1接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，30～35℃培养18～24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，20～25℃培养24～48h。
上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50～100CFU的菌悬液。
4.3.2接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100CFU的孢子溶液。
4.4培养基及稀释液与供试液4.4.1培养基和稀释液的名称培养基：营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基稀释液：pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌，即得。
微生物限度检验方法验证报告
微生物限度检查检验方法验证报告
方案编制年月日方案审核年月日方案批准年月日
上海美宝生命科技有限公司
7
7.1试验样品
确认人：日期：
7.2 产品试验组微生物生长情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：7.3 供试品对照组微生物生长检查情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：
7.4 稀释剂对照组微生物生长检查情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：7.5 菌液组微生物生长检查情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：
7.6稀释剂对照组菌回收率计算
检验人：日期：复核人：日期：7.7 试验组菌回收率计算
检验人：日期：复核人：日期：
7.8 结果说明
经过验证，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率分别为： %、 %、 %、 %、 %。
稀释剂回收率为： %、 %、 %、 %、 %。
7.9 结论
以上验证结果证明，本品（适合/不适合）采用上述方法进行微生物限度检查。
附录。
中国药典微生物限度检查方法验证方案
中国药典微生物限度检查方法验证方案一、引言药品的质量与安全性是保障患者用药安全的重要方面。
微生物限度检查是药品质量控制的重要环节，用于评价药品中微生物的污染情况。
为确保检测结果的准确性和可靠性，本文旨在制定中国药典微生物限度检查方法验证方案。
二、背景微生物限度检查方法验证是指确定某一方法在特定条件下的适用性，方法验证的结果直接影响到药品生产和品质控制。
为了保证方法验证的可靠性，必须按照一定的规范和要求进行操作。
三、验证目的验证中国药典中所规定的微生物限度检查方法在实际应用中的准确性和可靠性，以确保药品的微生物限度符合国家及相关法规的要求。
四、验证程序1. 确定验证方法：根据中国药典中规定的微生物限度检查方法，选择合适的验证样品和验证条件。
2. 准备验证样品：从实际生产过程中随机选取药品样品，确保样品的代表性。
3. 执行验证实验：按照中国药典中的方法操作，对验证样品进行微生物限度检查。
4. 数据分析和评估：根据验证实验的结果，进行数据分析和评估，评估方法的准确性和可靠性。
5. 结果判定：根据数据评估结果，对微生物限度检查方法进行判定，判断方法是否适用于实际生产中的微生物限度检查。
6. 验证报告编制：根据验证实验的结果和结论，编制验证报告。
五、验证内容本次验证主要包括如下内容：1. 对选择的验证样品进行微生物限度检查。
2. 对验证样品进行菌落计数。
3. 对验证样品进行培养方法的验证。
4. 对不同微生物种类的检查方法进行验证。
5. 对不同微生物菌株的适应性进行验证。
六、风险评估在验证过程中，存在一定的风险因素，需进行风险评估，确保验证结果的可靠性和准确性。
风险评估主要包括验证样品来源的可靠性、实验操作的准确性、验证条件的合理性等。
七、验证结果与讨论根据验证实验的结果和数据分析，可以得出下列结论：1. 所验证的微生物限度检查方法在实际应用中的准确性和可靠性较高。
2. 所验证的微生物限度检查方法适用于不同药品制剂类型的微生物限度检查。
微生物限度方法学验证完整版
微生物限度方法学验证 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】微生物限度检查方法学验证一、检验方法依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。
二、菌种、培养基及稀释液表2培养基表3对照用培养基表4试剂稀释液：（1）缓冲液取L磷酸二氢钾溶液250ml,加L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。
（2）%无菌氯化钠溶液取氯化钠，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。
（3）％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液取聚山梨酯80 ，用％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。
（4）靛基质试液取对二甲氨基苯甲醛，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。
三、菌液的制备1细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。
上述培养物用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数50～100cfu的孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。
2控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。
用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu 的菌悬液。
微生物限度检查方法及其验证报告记录(修改)
微生物限度检查方法及其验证报告记录(修改)————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：文件编号：73021微生物限度检查方法及其验证报告目录1 样品相关信息1.1 基本信息2 主要仪器设备和试验耗材信息2.1 主要使用的仪器设备2.2 试验用培养基2.3 试验用试剂2.4 试验用菌种3 试验环境3.1 无菌室3.2 洁净工作台3.3 生物安全柜4 试验方案4.1 验证试验目的4.2 微生物限度检查方法草案5 方法验证试验5.1 菌液制备5.2 计数培养基适用性检查5.3 控制菌检查用培养基使用性检查5.4 供试液制备5.5 方法验证5.5.1 菌落计数方法验证试验5.5.2 控制菌检查方法的验证5.6 方法验证结论6 供试品微生物限度检查结果1 样品相关信息1.1 基本信息（三批）品名多烯酸乙酯软胶囊或蛹油α-亚麻酸乙酯胶丸规格0.25g/粒，30粒/瓶或0.3g/粒，30粒/瓶批号2 主要仪器设备和试验耗材信息2.1 主要使用的仪器设备仪器名称型号编号培养箱HH·BⅡ·360ZL-025 MJX-150ZL-042 SPX-150B ZL-046 JJ-5 ZL-026电子天平JY1001 ZL-013超净工作台JH-DCB ZL-028生物安全柜BSC-1100ⅡA2ZL-0292.2 试验用培养基2.2.1 对照培养基培养基名称批号生产厂家胰酪大豆胨琼脂培养基中国食品药品检定研究院胰酪大豆胨液体培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基麦康凯液体培养基麦康凯琼脂培养基RV沙门增菌液体培养基2.2.2 试验用培养基培养基名称配制批号胰酪大豆胨琼脂培养基胰酪大豆胨液体培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基麦康凯液体培养基麦康凯琼脂培养基RV沙门增菌液体培养基2.3 试验用试剂试剂名称配制批号含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液含0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液0.9%氯化钠1%红四氮唑2.4 试验用菌种菌种名称菌种编号工作用菌种批号及代数信息大肠埃希菌CMCC（B）44 102 E3-02枯草芽孢杆菌CMCC（B）63 501 E3-02金黄色葡糖球菌CMCC（B）26 003 E3-02乙型副伤寒沙门菌CMCC（B）50094 E3-02 白色念珠菌CMCC（F）98 001 E3-02黑曲霉CMCC（F）98 003 E3-023 试验环境《中国药典》2015版规定，微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
微生物限度检查办法验证方法
微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。
?验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.范围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。
3.规范性引用文件：?根据《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ?J?微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。
4.验证实施：4.4.1?试验前的准备:?4.4.1.1?试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30?min，在3天内使用。
?4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15?min，在3周内使用。
?4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15?min，在3周内使用。
中国药典2019年版无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证内容简介
菌名
分类
芽孢
对氧需求
铜绿假单胞菌 革兰氏阴性杆菌
无芽孢 需氧
枯草芽孢杆菌 革兰氏阳性杆菌
有芽孢 需氧
金黄色葡萄球菌 革兰氏阳性球菌
无芽孢 需氧
大肠埃希菌
革兰氏阴性短杆菌 无芽孢 需氧
生孢梭菌
梭菌
有芽孢 厌氧
2019年8月
17
菌种的要求： 传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的 冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保 藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
2019年8月
19
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜 面培养基上，23~28℃培养5～7天，加入3～ 5ml0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然 后，吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉 花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无 菌试管内，用0.9％无菌氧化钠溶液制成每 lml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。
2019年8月
15
无菌检查验证用菌株：
金黄色葡萄萄球菌 (Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26 003]
铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10 104] **拟修订为大肠埃希菌
枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) [CMCC(B) 63 501]
2019年8月
35
举例说明上市抽验样品无菌检查方法学验证检验量（液 体制剂）
≤1ml
每个菌10支,共60支（全取样）
1＜V＜5 共30（取样量为半量）
5≤V＜20 建议30（取样量为2ml，建议全部过滤）
20≤V＜50 建议30（取样量为5ml，建议全部过滤）
新版GMP微生物限度检查法验证报告
*******微生物限度检查法验证报告文件编号：VMP-VV-502REP-00起草人：审核人：批准人：批准日期：年月日通过验证以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定；确认所采用的方法适合于该药品的控制菌的检查，根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。
若符合，按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。
2.验证目的及范围确认所采用的细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法适合该品种药品的微生物限度检查，以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
本次验证为试验组和对照组的菌回收率试验；控制菌检验方法的灵敏性、检出率及专属性试验。
3.验证风险评估对于本次验证的执行进行了如下的风险分析：4.验证前准备4.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。
培训人员记录见附件1。
4.2将所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没4.3仪器与器具：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台、无菌培养皿、无菌移液管。
5.验证内容5.1测试环境条件要求所有检查在环境洁净度C级下的局部A级洁净度的单向流空气区域内隔离系统内进行，其全过程严格遵守无菌操作，能防止微生物污染。
5.2试验样品*******批号：；规格：）5.3验证用菌种及培养基：5.3.1来源：食品药品检验所5.3.2菌落计数用菌种注：编号由菌种首字母-传代代数-配制日期组成。
5.3.3培养基及其制备方法：取市售的脱水培养基，分别按照规定方法进行配制后灌装于洁净的三角烧瓶中，然后加塞灭菌，在实验前加温熔化备用。
5.4细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证：按照中国药典2010年版微生物限度检查法中的平皿法进行细菌、霉菌及酵母菌计数的方法学验证试验及菌落计数。
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案目录1. 目的 (3)2. 适用范围 (3)3. 参考标准 (3)4. 接受标准 (3)5. 人员职责 (3)6. 抽样计划 (4)7. 设备、试剂和菌种信息 (4)8. 方法适用性试验 (5)9. 文件控制 (6)10. 不合格情况处理 (6)11. 再验证周期 (6)12. 附件清单 (6)1.目的根据中国药典2020版微生物限度检查法的要求，对产品的微生物限度检查法进行验证，以确定所采用的方法适合于本产品的微生物限度检查，即确认本品在该检查量及该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不计。
保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
2.适用范围适用于本司产品的微生物限度检查。
3.参考标准《中华人民共和国药典》（2020版第四部1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法）《医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分：产品上微生物总数的测定》《医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分：产品上微生物总数的估计》4.接受标准4.1.阴性对照组不长菌；4.2.回收率（试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值）应在0.5~2范围内；4.3.若回收率小于0.5，考虑产品有抑菌性，则重新考虑检查方法的建立。
5.人员职责5.1.成员及其职责详见表一：表一人员及职责5.2.培训要求确保参与验证的所有人员了解其职责和角色，以及验证的过程和要求。
验证开始前，负责本次验证的检验员将对参与确认执行的人员讲解验证的过程和要求，并记录在《培训记录》中。
适用时，培训考核记录作为附录包含在验证报告中。
6. 抽样计划随机抽取3个批次，每个批次随机抽取7套样品。
具体信息详见表二：表二 样品信息确认人/日期： 复核人/日期： 7. 设备、试剂和菌种信息 7.1. 设备信息详见表三表三 设备信息确认人/日期：复核人/日期： 7.2. 试剂信息详见表四表四 试剂信息确认人/日期： 复核人/日期： 7.3. 菌种信息详见表五表五 菌种信息确认人/日期：复核人/日期：7.4.菌液的制备用接种环取枯草芽孢杆菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取金黄色葡萄球菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取铜绿假单胞菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取白色念珠菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取黑曲霉的斜面培养物，向培养物中加入10mL0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，转移孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的孢子悬液。
微生物限度检查方法学验证报告模板
微生物限度检查法验证试验报告1、样品：奥氮平盐酸氟西汀胶囊（批号20140807，20140808，20140809），规格：12mg/25mg2、试液与稀释液：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：）、0.9%无菌氯化钠（批号：）、1%红四氮唑（批号：）、含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：）。
3、主要的设备及器具：净化工作台（型号）、培养箱（型号）、电子天平（型号）、恒温摇床（型号）、生物安全柜（型号）、无菌培养皿、菌落计数器、接种环、、酒精棉球、酒精灯、刻度吸管（1ml，10ml）、锥形瓶、试管及试管塞、吸耳球、显微镜等。
4、验证试验用菌种：大肠埃希菌CMCC(B)44 102、枯草芽孢杆菌CMCC(B)63 501、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26 003、白色念珠菌CMCC(F)98 001、黑曲菌CMCC(F)98 003，均由中国药品生物制品鉴定所提供。
5、对照培养基：4-甲基伞形酮葡萄苷酸（MUG）培养基（批号），胆盐乳糖发酵培养基（批号），胆盐乳糖培养基（批号）；玫瑰红钠琼脂（批号）；营养琼脂（批号），营养肉汤培养基（批号），均由中国食品药品检定研究院提供。
6、试验用培养基：营养琼脂培养基（批号）；玫瑰红钠琼脂培养基（批号）；营养肉汤培养基（批号）；改良马丁培养基（批号），胆盐乳糖培养基（批号）；4-甲基伞形酮葡萄苷酸(MUG)培养基（批号），由******公司提供（配制）。
7、试验方案按《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ微生物限度检查法规定，本品微生物限度标准应为：1g供试品中，细菌数不得过1000cfu，霉菌和酵母菌数不得过100cfu，大肠埃希菌不得检出。
7.1 验证试验的目的对所采用的方法进行验证，确认该方法适用于本品的微生物限度检查，即确认本品在该检验量及检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除至可忽略不计，以确保检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
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文件编号：73021微生物限度检查方法及其验证报告目录1 样品相关信息1.1 基本信息2 主要仪器设备和试验耗材信息2.1 主要使用的仪器设备2.2 试验用培养基2.3 试验用试剂2.4 试验用菌种3 试验环境3.1 无菌室3.2 洁净工作台3.3 生物安全柜4 试验方案4.1 验证试验目的4.2 微生物限度检查方法草案5 方法验证试验5.1 菌液制备5.2 计数培养基适用性检查5.3 控制菌检查用培养基使用性检查5.4 供试液制备5.5 方法验证5.5.1 菌落计数方法验证试验5.5.2 控制菌检查方法的验证5.6 方法验证结论6 供试品微生物限度检查结果1 样品相关信息1.1 基本信息（三批）2 主要仪器设备和试验耗材信息2.1 主要使用的仪器设备2.2 试验用培养基2.2.1 对照培养基2.2.2 试验用培养基2.3 试验用试剂2.4 试验用菌种3 试验环境《中国药典》2015版规定，微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域进行。
本公司微生物限度室、阳性对照室、生物安全柜及超净工作台洁净度检测无特殊情况下每季度进行一次。
3.1 无菌室无菌室按《医药工业洁净厂房设计规》GB 50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对10000级洁净度要求。
3.2 超净工作台超净工作台按《医药工业洁净厂房设计规》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。
超净工作台沉降菌检测记录2015.11.153.3生物安全柜生物安全柜按《生物安全实验室建筑技术规》GB50346-2011监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。
生物安全柜沉降菌监测记录2015.11.154 试验方案按《中国药典》2015年版第四部：（通则1105）非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、（通则1106）非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法、（通则1107）非无菌药品微生物限度标准及（通则1121）抑菌效力检查法规定，本品微生物限度标准为：1g供试品中，需氧菌总数不得过1000cfu，霉菌和酵母菌总数不得过100cfu，大肠埃希菌不得检出。
4.1 验证试验目的确认所采用的方法适合于本品的微生物限度检查。
即确认本品在该检查量及该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不计。
保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
4.2 微生物限度检查方案对三批产品进行3次独立的平行试验。
取本品10g，加含1%聚山梨酯80 的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分散均匀，制成1：10的供试液。
取1：10的供试液1ml，加含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至9ml，即为1：100的供试液。
微生物计数法，取1：10的供试液1ml，注入平皿中，依法检查（中国药典2015年版四部通则1105）；控制菌检查法，取1：10的供试液10ml，置胰酪大豆胨液体培养基100ml中，依法检查（中国药典2015年版四部通则1106）。
5 方法验证试验对上述非无菌产品微生物限度检查方法方案进行验证。
5.1 菌液制备（1）接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、沙门菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3天。
上述培养物用H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
（2）接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养5～7天，加入3ml 0.05%聚山梨酯80的 H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，过滤菌丝吸出孢子悬液至无菌试管，用0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。
5.2 计数培养基适用性检查（实验时间：2015.11.15～11.21）取上述制备好的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液各1ml（小于100cfu），分别注入无菌平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，混匀，凝固，置30～35℃培养3～5天，计数；取上述制备好的白色念珠菌、黑曲霉菌液各1ml（小于100cfu），分别注入无菌平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，混匀，凝固，置20～25℃培养5～7天，计数；同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
试验结果如表1：5.3 控制菌检查用培养基适用性检查（实验时间：2015.11.15～11.21）5.3.1 控制菌（大肠埃希菌）检查用培养基适用性检查麦康凯液体培养基促生长能力和抑制能力检查：接种不大于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基中，在42～44℃培养24～48小时，结果见表2。
接种不少于100cfu的金黄色葡萄球菌于麦康凯液体培养基中，在42～44℃培养24～48小时，结果见表2。
麦康凯琼脂培养基促生长能力和指示特性检查：接种不大于100cfu的大肠埃希菌与被检培养基和对照培养基中，在30～35℃培养18～72小时，结果见表2。
表2 控制菌检查用培养基适用性检查结果5.4 供试液制备（实验时间：2015.11.15～11.21）取本品10g，加含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分散均匀，制成1：10的供试液。
取1：10的供试液1ml，加含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml，即为1：100的供试液。
5.5 方法验证（实验时间：2015.11.15～11.21）5.5.1 菌落计数方法验证试验（1）菌液组：分别取菌液1ml，采用平皿计数法，测定上述备好的菌液中每毫升的活菌数，测定结果见表3。
（2）供试品对照组：取1：10的供试液1ml，注入平皿中，测定供试品本底的需氧菌总数，测定结果见表4。
取1：10的供试液1ml，注入平皿中，测定供试液品本底的霉菌和酵母菌总数，测定结果见表4.（3）试验组：取1：10的供试液1ml和上述控制菌菌液1ml（小于100cfu试验菌）分别注入同一平皿中，测定结果见表5，回收率见表6。
另取1：10的供试液的供试液1ml和上述真菌菌液1ml（不大于100cfu试验菌），分别注入同一平皿中，测定结果见表5，回收率见表6。
（4）稀释剂对照组：取1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml分别注入平皿中，测定结果见表7。
上述已注入供试液的平皿（其中试验组在注入供试液和控制菌菌液后应立即倾注培养基），需氧菌总数，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，待凝固后，置30～35℃培养3～5天逐日观察结果，霉菌和酵母菌总数，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，待凝固后，置20～25℃培养5～7天逐日观察结果。
表7稀释液对照组经上述实验验证，采用上述方法方案进行本品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数可使用回收率达到要求。
5.5.2 控制菌检查方法的验证（实验时间：2015.11.15~11.21）5.5.2.1 菌液制备接种大肠埃希菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中，33℃培养24小时。
用0.9%无菌氯化钠溶液9ml制成每1ml含菌数为10cfu~100cfu菌悬液。
5.5.5.2大肠埃希菌检查方法的验证（1）供试品组：取1：10的供试液10ml，加至胰酪大豆胨液体培养基100ml 中，置33℃培养24小时。
（2）阴性对照组：取稀释液10ml，加至胰酪大豆胨液体培养基100ml中，置33℃培养24小时。
（3）取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，置43℃培养24小时，观察结果，见表7。
表8 大肠埃希菌检查结果表8结果显示，表明本品在该条件下对大肠埃希菌无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计。
说明采用该法进行本品的大肠埃希菌检查可行。
5.6 方法验证结论上述验证试验结果证明，非无菌产品微生物限度检查方法方案可行。
依据验证结果，制定非无菌产品微生物限度检查方法如下：微生物限度取本品10g，加含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，使供试品分散均匀，制成1：10的供试液。
必要时，取1：10的供试液1ml，置含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至9ml 中，即为1：100的供试液。
需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，分别取1：10的供试液1ml，注皿，微生物计数法，取1：10的供试液1ml，注入平皿中，依法检查（中国药典2015年版四部通则1105）；控制菌检查法，取1：10的供试液10ml，置胰酪大豆胨液体培养基100ml中，依法检查（中国药典2015年版四部通则1106）。
1g供试品中，需氧菌总数不得过100cfu，霉菌和酵母菌总数不得过10cfu；不得检出大肠埃希菌。
6 供试品微生物限度检查结果按照上述确定的非无菌产品微生物限度检查方法检验三批供试品，结果符合规定，结果见下表。