DNA分子复制--高中内容 PP讲义T课件
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分子生物学：DNA复制
(CsCl gradient centrifuge)
N15
DNA
N14
Semi-Conservation Replication
Source:M. Meselson and F. W. Stahl, Sciences 44:675, 1958.
半半保保留留复复制制-小结
DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为 模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代 细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则 完全重新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。 这种复制方式称为半保留复制。
RNA引物的形成
DNA链合成及延长
复制的终止
• RNApol (RNA polymerase)
[Rif S ]
完成对先导链引物的合成
实现DNA复制的转录激活起始
起
• dnaG (primase) [Rif R]
始
完成对后随链引物的合成
较先导链的启动落后一个Okazaki片断
• 完成10±NtRNA引物合成后.
遗传物质的基本属性：基因的自我复制 基因的突变 控制性状的表达
DNA复制
亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下， 分别以每 条 单链DNA分子为模板，聚合与 自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,合 成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代 DNA分子的过程。 主 要 包 括 引 发 、 延 伸 、 终止三个阶段。
复制发动温度敏感突变型（慢停突变） 42℃不能发动DNA复制、但可完成DNA延伸
37 ℃, 5 ci / mM H3-T , 6min
37 ℃, 52 ci / mM H3-T , 6min
第三章 DNA的复制
（1）端粒和端粒酶的发现
1978 年 ， Blackburn 发现四膜虫大核中 rDNA 小分 子 末 端 的 端 粒 结 构 为 370520bp 的 (GGGGTT)n 重复片段。
加尾实验 1984
加尾实验 1985
四膜虫抽提液
酵母 末端重复序列
端 粒 酶 的 鉴 定
1985
端粒酶的分离纯化
TA
母代DNA 子代DNA
半保留复制的意义
按半保留复制方式，亲代DNA所含的信 息以极高的准确度传递给子代DNA分子,子 代保留了亲代的全部遗传信息 ，体现了遗 传的保守性。
遗传的保守性，是物种稳定性的分子基 础，但不是绝对的。
3.1.2 复制叉和复制体
复制叉：发生复制的 位点，或者称为生 长点。
后随链：背向复制叉，一段亲本DNA链先暴露 出来才能以相反方向合成DNA小片段，然后 这些小片段DNA连接形成完整的后随链。
冈崎的实验—脉冲标记实验
lig-突变体
冈崎的实验—脉冲追踪实验
3.1.5复制的起点、方向
复制起点（origin of replication，ori）
原核生物复制起始位点区特点
Dolly 1996-2003
端粒酶和永生
3.3 DNA复制的终止
ColE I
3.4 DNA复制的调控
质 粒 的 复 制 调 控
真核生物的DNA复制的调控
GLN1 GLN2 GLN3
cyclin
p34
MPF
cdc6,cdc8, cdc9,cdc21
3.2.2 多复制子复制的非一致性
每个复制子发动复制的先后时序有很大区别： 同一染色体上不同复制子之间 不同类型细胞之间
复制子的多少与DNA复制的速度有关 基因组的复制完成与细胞、组织及发育状态有 关。
DNA的复制
3.5. DNA复制的酶及蛋白质
DNA复制时蛋白质的协同作用
进 化 中 形 成 了 灵 活 的 多 酶 复 合 体
Top I, Top II
复 制 体
解旋酶
单链结合蛋白 (SSB)
螺旋去稳定蛋白 (HDP) DnaB 蛋白 引发体 DnaC 蛋白 引发酶（dnaG） Ungase DNA 聚合酶 III DNA 聚合酶 I DNA连接酶
2. 真核生物DNA复制的起始
S40 DNA复制起始
T抗原（具有解旋
酶活性）与ori结合
后，促进DNA解链。
复制引物由宿主细
胞DNA聚合酶α合
成。
酵母 DNA复制起 始
复制起点识别复合
自主复制序列
物具有ATPase活性， 该复合物识别并结 合自主复制序列， 与细胞分裂周期蛋 白6结合，激活其 ATPase活性，促进 DNA复制进行。
成磷酸二酯键，消耗ATP）
DNA聚合酶 I、II、III比较（原核生物）
I II PolB 2-5 dNt/秒 III PolC 250-1000 dNt/秒
有 有 无
· 16-20 dNt/秒
• 3‘→5‘ 外切核酸酶活性
(校对功能)
• PolA
• 5‘→3‘聚合酶活性 有 (dNMP)n + dNTP →(dNMP)n+1 + ppi
G2 3-4h
哺乳动物细胞
G1
12h
22-25h 500-5000 bp/min
S 6-8hs
• 复制机理的复杂性
双链DNA 构型的变化 单链 DNA 能量的供求 超螺旋 线状，开环状 复制体
多种酶类的互作
复制的准确性 （修复，校正） 研究材料的特殊性 （温度敏感型，突变抑制体系） DNA复制速度 缺乏统一的模式 (E.coli 105 bp/min，高速解旋 112 km/h ?) (双链 DNA, 单链 DNA, 线型 DNA….)
第三章 DNA复制
D-环型
滚环型
单林娜 制作
27
第三节 DNA复制的酶学
(Enzymology of DNA Replication)
一、复制中解链与DNA分子的拓扑学变化
与DNA几何学性质相关的酶
1.拓扑异构酶 (topoisomerase)
DNA复制时松弛超螺旋，以利复制叉
的行进及DNA合成，合成后再使其恢 复成超螺旋。
2、复制方向（复制过程的顺序性） 复制叉（Replication fork）：染色体中参与复制的活 性区域，即复制正在发生的位点 复制眼（replication eye）：电子显微镜下观察正在复制的DNA， 复制的区域形如一只眼睛
复制眼：在一个长的未复制区域内DNA已经复制的区域
真核生物的多复制子 多个复制眼
底物－－dNTP
Poly(核苷酸)n－3’-OH ＋ dNTP OH
→ Poly(核苷酸)n+1－3’＋ 2Pi
大肠杆菌DNA聚合酶（3种）
三种DNA聚合酶的结构和功能
DNA pol
5´3´的聚合作用，合成20个核苷酸即离
开模板
3´5´外切酶活性
5´3´外切酶活性
去除RNA引物，校正错误，修复损伤
条链并不同时进行复 制，轻链先开始复制，
稍后重链再开始复制， 当复制沿轻链开始时， 重链上产生了D环，随 环形轻链复制的进行， D环增大，重链后亦开 始复制，最后两条链 完成复制形成两条新 的DNA双螺旋。 线粒 体和叶绿体 DNA的 复制方式
（3）共价延伸方式(covalence
elongation）或滚环式复制
DNA pol Ⅲ 功能
5´3´的聚合作用（α亚基） 3´5´外切酶活性（ε亚基） 在DNA复制中主要作用
DNA的复制
解旋酶 (helicase)
作用：断裂互补碱基间的氢键，使DNA成单链
解螺旋酶 ATP
dnaA、B、C…
DnaA、B、C…
引物酶(primase)
合成RNA引物，又叫引物合成酶、引发酶。 它以单链DNA为模板，以ATP、GTP、CTP、UTP
为原料，从5→3方向合成出RNA片段，即引物。对
利福平不敏感。
原核生物DNA复制
DNA replication in Prokaryote
中心法则
复制 转录
少数病毒复制
Central Dogma
DNA
逆转录
RNA
翻译
翻译
蛋白质 （病毒）
蛋白质
第一节 复制的基本规律 第二节 原核生物DNA复制的酶学 第三节 原核生物DNA复制 拓扑学变化 第四节 原核生物的DNA生物合成
DNA聚合酶Ⅲ （复合物） 250，000 10-20 + + + 50 复制
5´-3 ´聚合酶作用
3´-5 ´核酸外切酶作用 5´-3 ´核酸外切酶作用
+
+ -
转化率 主要功能
活性（nt/min）
0 .05 不清 校读,修复 填补缺口 1000 50
100000
外切酶与内切酶作用图解
内切酶 5’ 外切酶 5´3´外切酶活性的功能
DNA复制的基本过程
一、复制的起始 (initiation) 二、DNA链的延伸 (elongation) 三、复制的终止 (termination)
一、复制的起始
起始：DNA解成复制叉，形成引发体及合成引物
复制从特定的位点开始，这一位置叫复制原点。 原核生物的DNA上一般只有一个复制原点，但在迅 速生长时期，第一轮复制尚未完成，就在起点处启 动第二轮复制；
分子生物学 DNA的复制、损伤与修复
2. 底物dNTP ：dATP，dGTP，dCTP，dTTP 3. DNA聚合酶，DNA-pol 4. 引物（primer）：RNA引物
5. 其他酶和蛋白质因子
一、复制的化学反应
N1OH +dN TP 2 DNA pol
生成磷酸二酯键 5`
N1N2-OH
5`
3`
+PPi 3`
3’——TAGAAGACCTATTGGCC——5’ 5’——ATCTTCTGGATAACCGG——3’
使其 DNA 中的碱基氮均转变为 15N 。将
大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培 养一代、二代、三代。分别提取 DNA ， 作CsCl密度梯度离心.
与复制有关的酶和因子
（以原核生物 大肠杆菌为例）
原料： dNTP，Mg++
双链DNA模板
引物（primer），常是RNA，有游离的 3’OH。
DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行 复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制 ）。
五、半不连续复制 （semidiscontinuous replication）
由于DNA聚合酶只能以5’→3’方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的
方向必须为3’→5’。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链
Ⅱ型拓扑异构酶
由两个A亚基和两个B亚基组成，即A2B2。 它能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接， 当它引入负超螺旋以消除复制叉前进带来的扭 曲张力时，需要由ATP提供能量。 两种拓扑异构酶在DNA复制、转录和重组 中均发挥重要作用。
拓扑异构酶 I 抑制剂：喜树碱类
拓扑异构酶 II 抑制剂：依托泊苷，多柔比星，阿霉
5’ 3’
5. 其他酶和蛋白质因子
一、复制的化学反应
N1OH +dN TP 2 DNA pol
生成磷酸二酯键 5`
N1N2-OH
5`
3`
+PPi 3`
3’——TAGAAGACCTATTGGCC——5’ 5’——ATCTTCTGGATAACCGG——3’
使其 DNA 中的碱基氮均转变为 15N 。将
大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培 养一代、二代、三代。分别提取 DNA ， 作CsCl密度梯度离心.
与复制有关的酶和因子
（以原核生物 大肠杆菌为例）
原料： dNTP，Mg++
双链DNA模板
引物（primer），常是RNA，有游离的 3’OH。
DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行 复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制 ）。
五、半不连续复制 （semidiscontinuous replication）
由于DNA聚合酶只能以5’→3’方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的
方向必须为3’→5’。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链
Ⅱ型拓扑异构酶
由两个A亚基和两个B亚基组成，即A2B2。 它能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接， 当它引入负超螺旋以消除复制叉前进带来的扭 曲张力时，需要由ATP提供能量。 两种拓扑异构酶在DNA复制、转录和重组 中均发挥重要作用。
拓扑异构酶 I 抑制剂：喜树碱类
拓扑异构酶 II 抑制剂：依托泊苷，多柔比星，阿霉
5’ 3’
DNA的复制
真核生物复制起点的研究是以酵母为基础的
富含AT
• “呼吸现象”
DNA复制原点处氢键迅速断裂与再生， 导致两条DNA链不断解链与聚合， 形成瞬间的单泡状结构的过程。
在富含AT的区域内尤为明显
常温（37℃）即可发生解链
• 复制起点两侧基因的转导频率高
aob ca o b d
复制起点e c a o b d f
g e ca o b d f h
大多数 rDNA 位于复制起点两侧
4a 4b 3c 3d 2e 2f 1g 1h
• 子链DNA延伸方向
DNA聚合酶只在DNA新链的3’-OH端反应； DNA新链的延伸方向为 5’ → 3’ 。
T CA
5’PPP
OH
C
+ ppp OH
聚合反应
T CA C
5’PPP
OH 3’ + ppi
复制
M13+
+
E.coli D利N福平A聚合酶不M1能3 发动
[利福平 s ]
子链DNA的复制起始无M13 复制
! E.coli
[利福平 S ] + M13
利福平
有M13 复制
E.coli [ 利福平 R ]
利福平
M13
有M13 复制
总结：
• M13 复制子的形成需要 RNA聚合酶发动合成一段 RNA 分子作为引物；
DNA复制起始控制机理知之甚少
DNA复制的特点
★ 有一定的复制起始点 ★ 半保留复制 ★ 需要引物 原核生物50-100bp，真核生物10bp ★ 双向复制 ★ 半不连续复制
3.2. 复制起点与方向
DNA复制的起点 （origin of
DNA复制概述
Replication fork
单林娜 制作
23
• 复制眼（replication eye）：电子显微镜 复制眼（ ） 下观察正在复制的DNA，复制的区域形如 一只眼睛。
单林娜 制作
24
真核生物的多复制子 多个复制眼
Electron Microscopy of replicating DNA reveals replicating bubbles.
作用下，分别以各单链 DNA分子为模板， 聚合与自身碱基可以互补配对的游离的 dNTP，合成出两条与亲代DNA分子完全相同 的子代DNA分子的过程。
单林娜 制作
4
• 复制子(Replicon，复制单位或复制 复制子(Replicon (Replicon， 元) DNA中含有一定复制起点和复制终
点的复制单位。 • A unit of the genome in which DNA contain a region from origin to terminator • 复制子的长度大小不均，1.3万—90万bp 不等。
---A------A ---T------T
Ungase
尿嘧啶-N-糖基酶 尿嘧啶 糖基酶
ung
A U
A U
denature dump fragment ~ 1200base ~ Okazaki fragment
单林娜 制作
41
以下实验 证实了这个解释 实验 • (1) 在dut- 突变体（dUTPase 缺失）中冈崎片段 比在dut+ 中为短。这是因为U 掺入机会增加； • (2) 在ung- （尿嘧啶N- 糖苷酶缺失）突变体中新 合成的DNA 约有一半由片段组成。这是因为尿嘧 啶N- 糖苷酶缺失，不会切除U 的糖苷链，也就不 会出现AP 位点，所以碱沉淀时不易断裂，从而保 持了半不连续的原貌。
高中生物必修二课件-DNA分子的复制PPT-ppt精品课件
3、下列关于DNA复制的说法，其中不正确的是（ ）
A. DNA复制过程中需要酶的催化
B. DNA复制过程中需要的能量直接由糖类提供
C. DNA 分子是边解旋复制的
D. DNA 复制过程中两条母链均可作模板
4、以DNA的一条链“－A－T－C－”为模板，经复制
后的子链是（
）
A. “－T－A－G－”
B. “－U－A－G－”
8．DNA分子的双链在复制时解旋，这时下述
哪一对碱基从氢键连接处分开（ A ）
A．G与C B．A与C C．G与A D．G与T
9．DNA复制的基本条件是（ A ）
A．模板，原料，能量和酶 B．模板，温度，能量和酶 C．模板，原料，温度和酶 D．模板，原料，温度和能量
高中生物必修二课件：3.3 DNA分子的复制PPT课件 (共28张PPT)
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• 因此，我们把以亲代DNA 为模板，合成子代DNA的过程 就叫做DNA的复制。
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A
T
T
A
T
G
刚解旋 C
G
通过碱基互补G
C
配C对脱氧核苷酸
已结在所合到以复母DA制链N上AT复制特点之A一是T:
边解旋边复制G C
GC
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A
T
A
T
P C R 技术
1、稳定性
在DNA分子双螺旋结构的内侧，通过氢键形 成的碱基对，使两条脱氧核苷酸长链稳固的并 联起来
精选版课件ppt
10
例题：甲DNA分子中，A和T占25％，G和C占 75%，乙DNA分子中，G和C占25％， A和T 占75%，哪一个稳定？
答：甲DNA分子比乙DNA分子稳定。因为A与 T之间形成两个氢键，在G和C之间形成三个氢 键，三个氢键比两个氢键稳定，所以在DNA分 子中含有较多的G－C碱基对比含有较多的A－ T碱基稳定
2、微量离心管
一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL
3、微量移液器
用于定量转移PCR配方中的液体，其上
的一次性吸液枪精头选版用课件一ppt 次更换一次
36
PCR仪
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37
微量离心管
微量移液器 精选版课件ppt
38
（二）实验操作步骤
1、准备 按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆 放在实验桌上
③两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成
碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺
嘌呤一定与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同胞
嘧啶配对
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7
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8
6、利用碱基互补配对规律的计算
规律一：DNA双链中的两条互补链的碱基相等, 任意两个互补的碱基之和相等即A=T，G=C。任 意两个不互补的碱基之和恒等，占碱基总数的 50%。即：A+G＝T+C＝A+C＝T+G＝50%， （A+G）/(T+C)＝(A+C)/(G+T)＝(T+C)/(A+G) ＝1
聚合酶
细胞内源 外源加入
反应环境
细胞内环境 精选版课件ppt 缓冲液
在DNA分子双螺旋结构的内侧，通过氢键形 成的碱基对，使两条脱氧核苷酸长链稳固的并 联起来
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10
例题：甲DNA分子中，A和T占25％，G和C占 75%，乙DNA分子中，G和C占25％， A和T 占75%，哪一个稳定？
答：甲DNA分子比乙DNA分子稳定。因为A与 T之间形成两个氢键，在G和C之间形成三个氢 键，三个氢键比两个氢键稳定，所以在DNA分 子中含有较多的G－C碱基对比含有较多的A－ T碱基稳定
2、微量离心管
一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL
3、微量移液器
用于定量转移PCR配方中的液体，其上
的一次性吸液枪精头选版用课件一ppt 次更换一次
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微量离心管
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38
（二）实验操作步骤
1、准备 按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆 放在实验桌上
③两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成
碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺
嘌呤一定与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同胞
嘧啶配对
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6、利用碱基互补配对规律的计算
规律一：DNA双链中的两条互补链的碱基相等, 任意两个互补的碱基之和相等即A=T，G=C。任 意两个不互补的碱基之和恒等，占碱基总数的 50%。即：A+G＝T+C＝A+C＝T+G＝50%， （A+G）/(T+C)＝(A+C)/(G+T)＝(T+C)/(A+G) ＝1
聚合酶
细胞内源 外源加入
反应环境
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