详细介绍抗体的生产制备
单克隆抗体制备原理
单克隆抗体制备原理单克隆抗体是能够特异性结合到特定抗原上的抗体，是当前生物科学研究和临床医学应用中最重要的实验工具之一、单克隆抗体制备技术的发展使得科学家们可以根据需要生产大量同一克隆的抗体，以便进行分析、诊断和治疗等应用。
本文将详细介绍单克隆抗体制备的原理及流程。
首先，选择合适的免疫原对免疫反应进行设计。
免疫原一般是目标抗原分子的表位或与抗原高度相关的多肽、蛋白质，也可以是具有免疫原性的化学物质。
免疫原的选择应该考虑到抗原的特异性、免疫原性和稳定性等因素。
免疫过程中，免疫原被注射到实验动物的体内，激发其免疫系统产生特异性的抗体。
一般来说，小鼠是最常用的实验动物，因为其易于操作、生活成本低且有广泛的生物学工具供应。
免疫过程需要进行多次免疫，以增强免疫效果。
为了提高抗体的稳定性和亲和性，可以对抗原进行修改，如偶联到载体蛋白上。
细胞融合是指将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
融合细胞的筛选是单克隆抗体制备中的关键步骤。
细胞融合后，细胞混悬液会被接种到含有选择性培养基的培养皿中，使只有有杂交瘤细胞才能成功生长。
这种选择性培养基一般富含鸟嘌呤和耐双胍的物质，可以选择性地促进杂交瘤细胞生长，抑制非杂交细胞的生长。
筛选后，单克隆细胞需要扩大培养。
扩大培养可以提供充足的细胞数量用于检测和应用。
这一步通常采用无血清培养基，以提高细胞的生长速度和抗体产量。
总结起来，单克隆抗体制备的原理主要包括免疫原设计、免疫、细胞融合、筛选和扩大培养。
通过精确选择免疫原和免疫过程中的优化，可以获得稳定而高亲和力的单克隆抗体。
随着生物技术的不断发展，单克隆抗体制备技术将在生物医学领域的研究和应用中发挥越来越重要的作用。
抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理－单克隆抗体的制备1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。
单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。
单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。
表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较单克隆抗体的制备方法如下。
（一）动物的选择与免疫1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备方法多克隆抗体是由多个不同的免疫细胞（多克隆）产生的抗体混合物，可以识别并结合到目标生物标志物上。
多克隆抗体在科学研究、临床诊断和治疗中具有重要的应用价值。
制备多克隆抗体需要经过一系列复杂的实验流程，下面将详细介绍多克隆抗体的制备方法。
一、抗原的选择在制备多克隆抗体时，首先需要选择一个合适的抗原。
抗原通常是目标生物标志物的蛋白质或多肽片段。
选择抗原的关键因素包括其表达水平、稳定性和纯度。
抗原的选择直接影响到最终多克隆抗体的亲和力和特异性。
二、免疫小动物免疫小动物通常是用于制备多克隆抗体的主要实验动物，例如小鼠、兔子、大鼠等。
在免疫前需要确保小动物健康，并对其进行相应的预处理，如注射驱虫药物、进行适当的接种。
还需要根据具体实验要求决定预免疫、免疫计划以及免疫方案的制定。
三、免疫过程免疫过程是制备多克隆抗体的核心环节。
首先需将抗原与适当的佐剂混合，增强免疫原性，然后用于免疫小动物。
在免疫过程中需要控制免疫剂量和免疫间隔时间，以及监测动物的免疫应答情况。
免疫后还需要定期采集血清样本，监测抗体滴度的动态变化。
四、细胞融合与筛选经过一段时间的免疫后，需要从免疫动物的脾脏或骨髓中收集免疫细胞，然后与肿瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
随后采用限稀稀释法将杂交瘤细胞进行单克隆化分，筛选出高亲和力的多克隆抗体细胞株。
五、生产与纯化经过筛选的多克隆抗体细胞株需要进行扩大培养，生产足够数量的多克隆抗体。
之后通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等手段，从细胞培养上清液中纯化出多克隆抗体。
六、性质鉴定与应用纯化后的多克隆抗体需进行性质鉴定，包括亲和力、特异性、稳定性等方面的测试。
最后经过滤菌毒处理后，多克隆抗体可应用于科学研究、临床诊断、生物药物研发等领域。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，需要科学合理地选择抗原、合理设计免疫方案、熟练掌握细胞融合和筛选技术，以及对多克隆抗体进行严格的生产和性质鉴定。
详细介绍抗体的分离纯化
6.用少量下步中所用缓冲液重悬沉淀;
7.硫酸铵可以在superdex G25中得到除去;
*通过调整硫酸铵浓度既可以沉淀目的分子,又可以沉淀
杂质。
18
一些抗体可能被直接使用固体硫酸铵所破坏,硫酸铵沉淀应该尽可能的使用液体,在重悬时尽可能避免气泡的产生。
1. 蛋白质的浓度
过高过低都（不三好，）一般影认为响2.5盐%~3析.0%的蛋白因质浓素度比较合
抗体的制备、纯化及其应用
2016.12.05
1
抗体的分离和纯化
2
12/12/2016
抗体的分离纯化
无论是将抗体用于研究还是用于检测或临床治疗，均需对抗体进行分离与纯 化。
分离：将抗体从其存在的体液或培养液中分离出来并加以初步纯化。 纯化： 提高分离出来的抗体的纯度，并将其中的杂质控制在所需的低水平。
14
12/9/2016
常用的沉淀剂
沉淀剂 硫酸铵 右旋硫糖苷
使用的典型条件
样品类型
备注
下文有叔
用于稳定的蛋白,不会变 性,上清可以直接 大于1mg/ml蛋白, 特别使免疫球蛋白 上到 HIC（疏水层析柱）,减少了脂蛋白
含量
加入0.04 ml of 10% 右旋硫糖苷和1 ml of 1 M CaCl2 /ml混匀 15 min并10 000 × g离心
一、盐析法
在物质的水溶液中添加一定浓度的中性盐，使物质的溶解度减小而沉淀析出，这一过 程称为“盐析”。
增加盐浓度能够增强蛋白间的疏水相互作用,疏水性的不同导致了一个选择性沉淀。
优点：①成本低，不需要昂贵的设备；
②操作简便，安全；
③对许多生物活性物质具有稳定作用；
④对pH、温度要求不严格。
单个b细胞抗体制备技术
单个B细胞抗体制备技术1. 引言单个B细胞抗体制备技术是一种用于研究和生产单个B细胞中特定抗体的方法。
这种技术的发展为我们深入了解免疫系统的功能以及开发更有效的免疫治疗方法提供了重要工具。
本文将介绍单个B细胞抗体制备技术的原理、步骤以及应用。
同时，还将讨论该技术在药物开发、疾病诊断和治疗等领域中的潜在应用。
2. 原理单个B细胞抗体制备技术基于单细胞测序和重组DNA技术，通过以下步骤实现：2.1 单细胞分离首先，从免疫系统中获得目标B细胞，可以通过活体或死体组织获得。
然后，使用流式细胞仪或显微操作来将单个B细胞分离出来，并将其置于96孔板或其他适当的容器中。
2.2 RNA提取和转录本测序接下来，对每个单个B细胞进行RNA提取，并使用逆转录酶合成cDNA。
随后，进行转录本测序，获取每个单个B细胞的抗体基因序列信息。
2.3 抗体基因克隆和表达根据测序结果，选择目标抗体基因进行克隆和表达。
通过引物设计和PCR扩增，将抗体基因插入适当的载体中，并转染到表达宿主细胞中。
最终得到重组抗体。
3. 步骤单个B细胞抗体制备技术的步骤如下：1.准备样品：从免疫系统中获得目标B细胞样品。
2.单细胞分离：使用流式细胞仪或显微操作将单个B细胞分离出来。
3.RNA提取：对每个单个B细胞进行RNA提取。
4.逆转录和cDNA合成：使用逆转录酶合成cDNA。
5.转录本测序：对每个单个B细胞的cDNA进行测序。
6.数据分析：对测序数据进行分析，获取抗体基因序列信息。
7.引物设计和PCR扩增：根据测序结果设计引物，并通过PCR扩增目标抗体基因。
8.克隆和表达：将目标抗体基因插入适当的载体中，并转染到表达宿主细胞中。
9.重组抗体纯化：从表达宿主细胞中提取、纯化重组抗体。
4. 应用单个B细胞抗体制备技术在以下领域有着广泛的应用：4.1 药物开发单个B细胞抗体制备技术可以帮助研究人员鉴定和筛选具有特定功能的抗体，如特异性结合靶标、中和病原体等。
生物制药技术中的抗体工程技术介绍
生物制药技术中的抗体工程技术介绍抗体工程技术在生物制药领域扮演了重要的角色，它通过改造和利用抗体的特性，为治疗疾病提供了新的途径。
在本文中，我将介绍抗体工程技术在生物制药技术中的应用和相关的进展。
抗体是由机体的免疫系统产生的一类蛋白质，可以识别和结合特定的抗原。
因其高度特异性和亲和性，抗体成为治疗疾病的理想候选药物。
然而，天然抗体存在一些局限性，比如生产成本高、不稳定性和免疫原性等。
为了克服这些问题，科学家们开发了抗体工程技术，通过改造抗体的结构和功能，提高治疗效果和降低副作用。
一种常见的抗体工程技术是单克隆抗体制备技术。
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的抗体，对特定抗原具有高度特异性。
传统的获取单克隆抗体的方法是从小鼠等动物的脾脏或骨髓中提取B细胞，再经过杂交瘤技术获得。
然而，这种方法存在一定的局限性，比如生产周期长、免疫原性问题等。
近年来，通过重组DNA技术，科学家们可以制备人源化的单克隆抗体，从而避免了相关问题，并提高了制备效率。
另一种抗体工程技术是通过改造抗体的结构来增强其稳定性和活性。
例如，人工合成的Fc区域可以提高抗体的半衰期和结合能力，从而增强了其治疗效果。
此外，通过改变抗体分子的结构，可以实现对抗体的亲和性、特异性和生物活性进行精确调控，进一步提高其治疗效果和选择性。
抗体工程技术还可以用于制备具有特定功能的抗体。
例如，单克隆抗体可以通过融合其他功能蛋白或药物分子，产生具有双重或多重功能的抗体。
这种方法被广泛应用于抗肿瘤药物的研发，通过将细胞毒性物质连接到抗体分子上，实现对肿瘤细胞的靶向杀伤。
此外，抗体工程技术在免疫诊断和分子影像等领域也发挥着重要作用。
通过使用与特定抗原结合的抗体或改造的抗体，在体外或体内实现对疾病标记物的检测和定量。
同时，可以通过标记放射性同位素或荧光物质等标记物，将抗体用于其它生物学研究和医学应用。
需要注意的是，抗体工程技术的应用仍然面临一些挑战和限制。
首先，抗体的规模化生产和纯化仍然是一个技术难题，造成了制备成本高昂。
详细介绍抗体的生产制备
A
4/18/2020
12
⑦ 其它
聚丙烯酰胺凝胶胶内蛋白 可将抗原所在的电泳条带（或蛋白点）切下,研磨后直接用以动物免疫。
NC膜结合蛋白 将含目的分子的蛋白进行SDS-PAGE电泳，转移至NC膜上，丽春红显色至清晰
显示目的条带，取目的条带置于加有PBS的1.5ml离心管中，用PBS洗至无色，继而 剪碎、研磨，用于动物免疫。
A
4/18/2020
13
方法 离心分离法 盐析法 凝胶层析法 离子交换法 亲和层析法 电泳
分离纯化方法的比较
原理
优点
缺点
应用
离心力和物质沉降 系数的差别
操作简单
分辨率低
蛋白质分离
盐析作用
操作简单，成本低，重 复性较好
分辨率低，纯化倍 数低
蛋白质的分级沉淀
分子筛的排阻作用
分辨力强，不引起蛋白 质变性
▪ 含量测定：采用常规蛋白或糖类浓度测定法，一般采用分光光度计 测量法；
▪ 相对分子量的鉴定：一般采用SDS-PAGE电泳法； ▪ 纯度鉴定：常用区带电泳法鉴定。
A
4/18/2020
15
3）半抗原
▪ 半抗原物质多数为低分子质量的物质，如：多糖、多肽、甾体激素、脂 肪胺、类脂质、核酸、某些药物及其它化学药品；
▪ 单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）:由一个识别一种抗原表位的B细 胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应 性。
A
4/18/2020
5
多克隆抗体（抗血清）的制备流程
抗原
半抗原+载体
佐剂 免疫动物（3-5次）
测效价 动物采血，分离血清
单克隆抗体技术路线
单克隆抗体技术路线引言：单克隆抗体技术是一种重要的生物医学研究方法，也是生物制药领域的重要工具。
本文将介绍单克隆抗体技术的基本原理、制备步骤以及应用领域，以帮助读者更好地了解和应用这一技术。
一、单克隆抗体技术的基本原理单克隆抗体技术是一种通过克隆单个抗体细胞，制备具有相同抗原结合特异性的抗体的方法。
其主要原理是将抗原注射到实验动物体内，激发机体产生免疫应答，然后采集动物体内的B细胞，融合B 细胞与骨髓瘤细胞，形成杂交瘤细胞，最后通过筛选获得特异性抗原结合能力的单克隆抗体。
二、单克隆抗体制备步骤1. 免疫原选择：选择合适的免疫原，通常为纯化的蛋白质或多肽。
2. 免疫程序：将免疫原注射到实验动物体内，激发免疫应答。
3. B细胞采集：从免疫动物体内采集脾细胞或淋巴结细胞，富集含有目标抗体的B细胞。
4. 杂交瘤细胞制备：将采集到的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
5. 杂交瘤细胞筛选：通过限制性稀释法或酶标记法等方法，筛选出分泌特异性抗原结合能力的杂交瘤细胞。
6. 单克隆抗体生产：将筛选出的杂交瘤细胞进行扩增培养，收集培养上清液，纯化得到单克隆抗体。
三、单克隆抗体技术的应用领域1. 生物学研究：单克隆抗体可用于特定分子或细胞的定位和鉴定，帮助研究者了解生物体内的生物过程和机制。
2. 临床诊断：单克隆抗体可用于检测和诊断疾病，如癌症、感染性疾病和自身免疫性疾病等。
3. 治疗应用：单克隆抗体可用于治疗某些疾病，如肿瘤、免疫性疾病和传染病等，具有较高的治疗效果和较低的副作用。
4. 生物制药：单克隆抗体作为生物制药领域的重要工具，可用于药物研发、质量控制和生产等方面。
结论：单克隆抗体技术是一种重要的生物医学研究方法和生物制药工具，其制备步骤简单明了，应用领域广泛。
随着技术的不断发展和完善，单克隆抗体技术在生物医学领域将发挥越来越重要的作用，为疾病的诊断和治疗提供更多的选择和可能。
相信随着对单克隆抗体技术的深入研究和应用，必将为人类健康事业作出更大贡献。
抗体的制备与应用
优点: 克服了HAMAR的问题 分子量小、渗透性高，靶向性增加 ScFv可保留较高活性
类型
（1）二硫键稳定的单链抗体(dsFv） （2）由连接肽连接的单链抗体（ScFv）
1.dsFv（二硫键稳定的单链抗体）
利用基因突变技术在VH和VL上加入 半胱氨酸，利用两者形成的二硫键 将VH和VL连接在一起。
杂交瘤细胞（HGPRT+, TK+ , 能生长, 且 能永生化）
4.杂交瘤细胞的筛选和克隆化
筛选： 免疫荧光 ELISA等
克隆化： 有限稀释法 单个细胞显微操作法 软琼脂培养法
5.杂交瘤细胞的冻存与复苏
配制方案: 杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml) + 细胞冻存液 (30%～40% 牛血清，50%～60% RPMI-1640培养液， 10%DMSO ) “慢冻”: 分步冷冻，30℃→-70℃→液氮 “快融”: 取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、 复苏
• 激活补体 Immune complex（IC） 激活补体经典途径
• 与细胞表面FcR结合 1）调理作用（opsonization)；
IgG 或IgM的Fc段与吞噬细胞表面FcR结合促吞噬；
2）抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用 （Ab-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)
3.杂交瘤细胞的筛选
采用筛选培养基: HAT培养基 H-次黄嘌呤、A-氨基喋呤、T-胸腺嘧啶
只有融合成功的细胞（杂交瘤）才能在HAT培 养基上长期生长，原因在于只有杂交瘤能成功 合成DNA。
DNA合成途径
内源性途径（主要途径） 利用谷氨酰胺（Gln）或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还
原酶的催化下合成DNA (氨基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂, 因此能有效阻
详细介绍抗体的生产制备
添加 标题
抗体的人工进化技术的流程：抗体的人工进化技术包括抗体基因的突变、重组、表达、筛选和选择等步骤。 通过这些步骤可以获得具有更高亲和力、更低免疫原性、更稳定等特性的抗体。
添加 标题
抗体的人工进化技术的应用：抗体的人工进化技术广泛应用于药物研发、生物治疗、诊断试剂等领域。通过 该技术可以获得针对特定疾病靶点的抗体用于治疗和诊断疾病。
随着肿瘤免疫疗 法、自身免疫性 疾病等领域的快 速发展抗体药物 的需求量将进一 步增加。
抗体药物的研发 和生产技术不断 创新为抗体药物 的产业化发展提 供了有力支持。
抗体药物的国际 市场竞争激烈国 内企业也在逐步 崛起未来发展前 景广阔。
抗体药物的生产工艺和质量控制
抗体药物的细胞 培养技术：介绍 细胞培养的基本 原理、培养基的 选择与优化、细 胞培养的过程控 制等方面的知识。抗体药物的来自发和注册审批流程添加 标题
抗体药物的研发：从靶点发现到临床试验阶段需要经过大量的实验和验证以确保药物的安全性和有效性。
添加 标题
注册审批流程：新药在进入市场前需要经过国家药品监管部门的注册审批。这一过程需要提供大量的数据和 资料包括药效、安全性、生产质量等方面的信息。
添加 标题
抗体药物的产业化：随着技术的不断发展抗体药物的生产已经实现了产业化。产业化可以大大提高生产效率 和降低成本使更多的患者能够受益于抗体药物的治疗。
02 抗体的生产过程
抗体的来源和制备方法
抗体的来源：动物免疫血清、单克隆抗体 制备方法：杂交瘤技术、基因工程、噬菌体展示技术等
免疫原的制备和免疫动物的接种
免疫原的制备：将抗原物质与佐剂混合形成免疫原以增强免疫反应。 免疫动物的接种：将免疫原注射到动物体内刺激动物产生特异性抗体。 接种途径：可采用皮下、皮内、肌肉注射等多种途径进行免疫接种。 接种剂量：根据动物种类、免疫原性质等因素确定适当的接种剂量。
抗体制剂工艺流程
抗体制剂工艺流程下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by the editor. I hope that after you download them, they can help yousolve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts,other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!抗体制剂工艺流程是制造抗体制剂的关键步骤，通过精确的工艺流程设计和优化可以提高产品的纯度和产量，保证产品质量和稳定性。
实验二多克隆抗体的制备
摇匀 置 37℃ ℃ 水浴 箱内 15~3 0min
全溶 全溶 全溶 全溶 全溶 大半溶 全不溶
ห้องสมุดไป่ตู้
注意事项： 注意事项： 1.抗原注射的方式和量要准确。 抗原注射的方式和量要准确。 抗原注射的方式和量要准确 2.补体和绵羊红细胞要新鲜。 补体和绵羊红细胞要新鲜。 补体和绵羊红细胞要新鲜
作业：计算本组的溶血素单位。 作业：计算本组的溶血素单位。
实验二 多克隆抗体的制备
LOGO
目的： 目的：掌握溶血素的制备和溶血素单位滴定 的原理和方法。 的原理和方法。 原理：绵羊红细胞（ 原理：绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔后可以 ） 产生抗SRBC的抗体，该抗体能与 的抗体， 结合， 产生抗 的抗体 该抗体能与SRBC结合， 结合 在补体参与下，能使SRBC溶解，此抗体也称 溶解， 在补体参与下，能使 溶解 溶血素， 溶血素，常用于补体结合及补体活性测定等 实验。 实验。
LOGO
实验器材： 实验器材： 1.器具： 冰箱、水浴箱、显微镜、平皿、小 器具： 器具 冰箱、水浴箱、显微镜、平皿、 试管、滴管、注射器。 试管、滴管、注射器。 2.材料：家兔、全羊血、20%羊红细胞悬 材料：家兔、全羊血、 材料 羊红细胞悬 液。
LOGO
实验方法
1.溶血素的制备 溶血素的制备
最后一次注射后，间歇3d，自耳静脉采血，滴定溶血素单位。 最后一次注射后，间歇3d，自耳静脉采血，滴定溶血素单位。如果达 3d 5000以上时 可由心脏或颈动脉放血，分离血清，加甘油4℃ 以上时， 4℃保存 到1：5000以上时，可由心脏或颈动脉放血，分离血清，加甘油4℃保存
LOGO
2.溶血素单位滴定法 溶血素单位滴定法
注射日期 1 3 5 7 9 12 15 注射途径 皮内 皮内 皮内 皮内 皮内 静脉 静脉 注射剂量 全羊血0.5ml 全羊血 全羊血1.0ml 全羊血 全羊血1.5ml 全羊血 全羊血2.0ml 全羊血 全羊血2.5ml 全羊血 20%羊红细胞 羊红细胞1.0ml 羊红细胞 20%羊红细胞 羊红细胞1.0ml 羊红细胞
详细介绍抗体的生产制备
详细介绍抗体的生产制备抗体是一种由人类或动物免疫系统产生的蛋白质分子，用于识别和抵御入侵体内的外来抗原，如细菌、病毒或其它异物。
它们起到了非常重要的免疫调节和防御作用。
抗体的生产制备可以通过以下步骤进行：免疫原选择、免疫动物筛选、抗原接种和免疫、细胞融合和克隆、抗体纯化和检测。
首先，选择合适的免疫原。
免疫原一般是指从目标病原体中提取出的具有抗原性的物质。
免疫原可以是细菌、病毒、真菌、寄生虫等。
选择合适的免疫原非常重要，因为它决定了抗体的特异性和亲和性。
其次，选择合适的免疫动物。
大多数情况下，小鼠是最常用的免疫动物。
它们具有一种高度多样化的基因组和良好的免疫系统。
其他常用的免疫动物还包括兔子、猴子、鸟类等。
第三，进行抗原接种和免疫。
将免疫原注射到免疫动物的体内，触发其免疫系统产生特异性抗体。
免疫过程可以通过多次接种来增强免疫效果。
根据需要，可以选择不同的免疫方法，如小鼠腹腔注射、小鼠尾静脉注射、兔子皮下注射等。
接下来的步骤是细胞融合和克隆。
细胞融合是将免疫细胞与肿瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
这些杂交瘤细胞拥有免疫细胞的能力和肿瘤细胞的无限增殖能力。
杂交瘤细胞可以在体外持续产生特异性抗体，这使得抗体的大规模生产成为可能。
接下来，通过限稀克隆的方法，从杂交瘤细胞中筛选出特异性抗体的产生细胞株。
最后，抗体纯化和检测。
通过对培养物中的细胞和抗体的分离，可以获得纯化的抗体。
这可以通过多种方法实现，如亲和层析、凝胶渗透层析和蛋白质A/G结合等。
检测抗体的纯度和活性也是十分重要的。
常用的方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹（Western blotting）和流式细胞术等。
总结起来，抗体的生产制备是一个复杂的过程，需要经过免疫原选择、免疫动物筛选、抗原接种和免疫、细胞融合和克隆、抗体纯化和检测等多个步骤。
这些步骤都需要仔细和精确地操作，以确保最终获得高质量和高效能的抗体产品。
抗体的生产制备能够为医学研究和临床诊断提供重要的工具和方法。
抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg 卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
兔单克隆抗体的制备
兔单克隆抗体的制备
兔单克隆抗体的制备分为以下步骤：
1.免疫兔子：选择合适的抗原免疫兔子，通常需要免疫3-4次。
2.细胞融合：取免疫后的兔子脾细胞与骨髓瘤细胞进行体外融合，得
到杂交瘤细胞。
3.筛选克隆：通过对杂交瘤细胞进行限制性稀释，筛选出单克隆细胞，并进行克隆扩增。
4.抗体生产：将单克隆细胞放入合适的培养基中进行大量培养，得到
兔单克隆抗体。
5.鉴定抗体：对所得兔单克隆抗体进行鉴定，包括抗原特异性、克隆
纯度、同种异型抗体污染等方面。
6.应用：将兔单克隆抗体应用于特定实验或临床应用中，如ELISA、
免疫印迹、免疫组化等。
抗血清制备
抗血清制备抗血清是一种广泛应用于医学、生物学、农业等领域的重要抗体。
它可以通过对动物实验的刺激来制备，具有较高的特异性和灵敏性。
本文将介绍抗血清的制备过程和应用领域。
一、抗血清的制备抗血清的制备需要对动物实验进行免疫刺激，让其产生免疫反应，生成相应的抗体。
制备抗体的方法有多种，包括:1. 多次免疫法：将抗原与适当的佐剂混合后注射给动物，每次注射间隔时间大于1个星期。
免疫周期主要根据抗原型以及免疫状态来确定。
一般情况下，需要多次免疫才能达到所需的浓度。
2. 单次免疫法：在抗原一侧布局NMDA表达杂交的细胞，给兔子单偏免疫或初免疫后再进行免疫，以提高抗体效价。
3. 聚集物制备法：将抗原加入雄鹰蛋白中，然后注射到家兔或小猪体内，以选育出抗体。
以上三种方法都有它们的优缺点，适用于不同的条件下。
二、抗血清的应用抗体在医学、生物学、农业等领域都有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1. 诊断：通过抗血清与疾病相关物质的特异性结合可以进行诊断，如HIV、狂犬病、乙肝等病毒感染的检测。
2. 治疗：抗体被广泛应用于治疗各种疾病，如肿瘤、自身免疫性疾病、传染病等。
3. 细胞学：抗体可用于细胞学实验，用于检测细胞内、细胞表面或细胞核内的成分，如检测肿瘤细胞、细胞分离、特定蛋白识别等。
4. 农业：抗血清可用于畜牧业和农业生产，如检测动物或植物病毒感染、食品中添加的污染物等。
三、注意事项在制备抗血清时，需要注意以下几点：1. 选择优质的抗原，并进行适当的保护、存储。
2. 用药量应适当，尽量不要过多。
3. 对免疫动物的饲养和体温要求高。
4. 在注射时要注意卫生和安全问题，防止交叉感染。
5. 制备后需要进行充分的检测和鉴定，以确定抗体的特异性和效价。
抗血清的制备是一项重要的实验技术，应用领域广泛，但同时也需要谨慎和责任心。
只有严格遵守操作规定和注意事项，才能制备出优质的抗血清，促进科学的发展。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
9/14半抗原物质多数为低分子质量的物质，如：多糖、多肽、甾体激素、脂 肪胺、类脂质、核酸、某些药物及其它化学药品；
常用载体：蛋白质类如：牛血清白蛋白、人血清清蛋白、兔血清清蛋白 等。多肽聚合物：如多聚Lys（赖氨酸） 大分子聚合物：如羟甲基纤维素；
9/14/2019
4
第一节 多克隆抗体的制备与纯化
克隆（clone）:是指无性繁殖细胞系，是由单一个祖先细胞分裂繁殖而形成 的一簇细胞纯系。在这个家族的所有成员中，如无突变发生，其基因是完 全相同的。
多克隆抗体（polyclonal antibody , pAb）：用一种包含多种抗原决定簇的 抗原免疫细胞，可刺激多个B细胞克隆产生针对多个抗原表位的不同抗体。 多获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。
免疫原—天然抗原、人工合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原；
免疫原的分类：
（一）细胞性抗原制备：
绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素；
9/14/2019
细菌- 抗菌抗体（动物免疫血清）
8
1）细胞性抗原或颗粒性抗原
细胞性抗原：主要包括人、动物的细胞，还有细菌、螺旋体及寄生虫等。 如菌体（O）抗原的制备：选择标准菌株，接种于斜面或平板培养基表面； 置温箱37℃ 培养24h，用适量的无菌生理盐水刮下菌苔，移入无菌含有玻璃 珠的三角瓶中，充分摇匀菌体；100 ℃ 水浴2～2.5h杀菌并破坏鞭毛抗原。取 处理过的菌液，检测有无活菌的存在，合格后用无菌生理盐水稀释成每毫升8
9/14/2019
10
（3）蛋白提纯
① 超速离心法：常用密度梯度介质有蔗糖、甘油；
② 选择性沉淀法（盐析沉淀法）：其原理是根据蛋白质理化 特性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗 原成分沉淀，从而达到纯化的目的。如选用33～50％饱和度 的硫酸胺收集沉淀物；
9/14/2019
11
③ 凝胶层析法（分子筛层析）：蛋白质分子按大小被分离； ④ 离子交换层析；带电的生物大分子和离子交换色谱填料 上的离子基团进行交换而被分离纯化。以离子交换剂为固定 相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可 逆交换时的结合力大小的差别而进行分离； ⑤ 亲和层析：利用生物大分子的生物特异性如抗原抗体、 激素受体、IgG和葡糖球菌蛋白A（SPA）； ⑥ 制备电泳技术。
9/14/2019
12
⑦ 其它
聚丙烯酰胺凝胶胶内蛋白
可将抗原所在的电泳条带（或蛋白点）切下,研磨
后直接用以动物免疫。
NC膜结合蛋白
将含目的分子的蛋白进行SDS-PAGE电泳，转移
至NC膜上，丽春红显色至清晰显示目的条带，取目
的条带置于加有PBS的1.5ml离心管中，用PBS洗至
9/14/2019
13
抗血清纯化、鉴 定、保存
6
（一）抗原的制备 （二）免疫动物 （三）免疫血清的收集、分离和保存 （四）抗体的纯化 （五）免疫血清的鉴定 （六）免疫失败的可能原因及应采取的措施
9/14/2019
7
（一）抗原的制备
免疫原（immunogen）指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体 或致敏淋巴细胞；抗原最重要的性质是免疫原性 （immunogenicity）
抗体的生产制备
2016.12.05
特异性抗体的制备与纯化技术
多克隆抗体（抗血清） 单克隆抗体（杂交瘤技术）
9/14/2019
2
单克隆抗体与多克隆抗 体
9/14/2019
3
抗体发展史
抗体制备技术主要经历了三代： 第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体，称 为多克隆抗体（polyclonal antibody）； 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体 称为单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）； 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体（genetic engineering antibody）。
（1）组织匀浆的制备：所有的组织必须是新鲜的或低温保存的。器官或组织 获得后立即去除表面的包膜或结缔组织以及大血管，在4 ℃水浴或冰浴中将 洗净的组织剪成小块，加入适量生理盐水，装入捣碎机破碎制成组织匀浆。
（2）细胞破碎：提取细胞可溶性抗原，需将细胞破碎，常用方法有冷热交替 法、超声破碎法，反复冻融法、自溶法和酶处理法等。
亿～10亿个细菌，加入苯酚（石炭酸）至最终浓度为5％，即为O抗原。
9/14/2019
9
2）可溶性抗原
可溶性抗原主要包括蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、脂多糖、酶、补体、细菌外 毒素、核酸等。它们大多数来源组织细胞，成分复杂。制备这类抗原时，首 先需将组织和细胞破碎，然后再从组织和细胞匀浆中提取目的成分，提纯后 的抗原需鉴定后才能用做免疫原。
单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）:由一个识别一种抗原表位的B细 胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应 性。
9/14/2019
5
多克隆抗体（抗血清）的制备流程
9/14/2019
抗
半抗原+载
原
体
佐
免疫动剂物（3-
5次）
测效 价
动物采血，分 离血清
离子基团的交换作 用
分辨力强，分离量大
费时间，酸碱用量 大
可电离的生化物质
分离物与配体间的 亲和作用
分辨力很强
一种配体只分离一 类物质，局限性 生物大分子物质 大
物质的带电性质
设备简单、操作方便、 分辨率高
成本高
生物分子的分离、定 性、定量
9/14/2019
14
（4）纯化抗原的鉴定
含量测定：采用常规蛋白或糖类浓度测定法，一般采用分光光度计 测量法；
方法 离心分离法 盐析法 凝胶层析法 离子交换法 亲和层析法 电泳
分离纯化方法的比较
原理
优点
缺点
应用
离心力和物质沉降 系数的差别
操作简单
分辨率低
蛋白质分离
盐析作用
操作简单，成本低，重 复性较好
分辨率低，纯化倍 数低
蛋白质的分级沉淀
分子筛的排阻作用
分辨力强，不引起蛋白 质变性
成本高
分子质量有差别的可 溶性物质
半抗原－载体连接方法：常用物理法和化学法。 物理吸附的载体有羟甲基纤维素等，其借助电荷和微孔吸附半抗原； 化学法则是利用某些功能基团把半抗原连接到载体上。