详细介绍抗体的生产制备

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2）可溶性抗原
可溶性抗原主要包括蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、脂多糖、酶、补体、细菌外
毒素、核酸等。它们大多数来源组织细胞，成分复杂。制备这类抗原时，首 先需将组织和细胞破碎，然后再从组织和细胞匀浆中提取目的成分，提纯后
的抗原需鉴定后才能用做免疫原。
（1）组织匀浆的制备：所有的组织必须是新鲜的或低温保存的。器官或组织
免疫间隔时间是影响抗体产生的重要因素，其中首次与第二次免疫的间隔
时间尤为重要，一般以10～20天为佳，二次后间隔时间一般为7～10天， 若间隔时间太长，则刺激减弱，抗体效价不高。
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（三）免疫血清的收集
1）采血前测抗体效价
在第2次加强免疫后2周，从兔耳缘静脉取2～3ml血，制备血清，检测
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第一节 多克隆抗体的制备与纯化
克隆（clone）:是指无性繁殖细胞系，是由单一个祖先细胞分裂繁殖而形成 的一簇细胞纯系。在这个家族的所有成员中，如无突变发生，其基因是完 全相同的。 多克隆抗体（polyclonal antibody , pAb）：用一种包含多种抗原决定簇的 抗原免疫细胞，可刺激多个B细胞克隆产生针对多个抗原表位的不同抗体。 多获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。
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分离纯化方法的比较
方 法 原 理
离心力和物质沉降 系数的差别 盐析作用 分子筛的排阻作用 离子基团的交换作 用
优 点
缺 点
应 用
离心分离法
操作简单 操作简单，成本低，重 复性较好 分辨力强，不引起蛋白 质变性 分辨力强，分离量大
分辨率低 分辨率低，纯化倍 数低 成本高 费时间，酸碱用量 大 一种配体只分离一 类物质，局限性 大 成本高
单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）:由一个识别一种抗原表位的B细 胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应 性。
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多克隆抗体（抗血清）的制备流程
抗原 半抗原+载体 佐剂
免疫动物（3-5次）
测效价
动物采血，分离血清
抗血清纯化、鉴定、保存
细胞因子佐剂：
IL-2 IL-1 IFNr（羊痘病毒γ干扰素受体） CSF（集落刺激因子）等
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2、 佐剂的免疫生物学作用
①增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的物质变成持久或 强的免疫原； ②增强机体对抗原刺激的反应性：提高初次应答和再次应答所
产生的抗体滴度；
③改变抗体类型：使产生抗体由IgM型转变为IgG型； ④引起或增强迟发性超敏反应。
特性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗
原成分沉淀，从而达到纯化的目的。如选用33～50％饱和度 的硫酸胺收集沉淀物；
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③ 凝胶层析法（分子筛层析）：蛋白质分子按大小被分离；
④ 离子交换层析；带电的生物大分子和离子交换色谱填料 上的离子基团进行交换而被分离纯化。以离子交换剂为固定 相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可 逆交换时的结合力大小的差别而进行分离；
⑤ 亲和层析：利用生物大分子的生物特异性如抗原抗体、
激素受体、IgG和葡糖球菌蛋白A（SPA）； ⑥ 制备电泳技术。
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⑦ 其它
聚丙烯酰胺凝胶胶内蛋白 可将抗原所在的电泳条带（或蛋白点）切下,研磨后直接用以动物免疫。 NC膜结合蛋白 将含目的分子的蛋白进行SDS-PAGE电泳，转移至NC膜上，丽春红显色至清晰 显示目的条带，取目的条带置于加有PBS的1.5ml离心管中，用PBS洗至无色，继而 剪碎、研磨，用于动物免疫。
免疫原的分类： （一）细胞性抗原制备： 绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素； 细菌- 抗菌抗体（动物免疫血清）
（二）可溶性抗原制备：
指蛋白质、多糖和脂类等。
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1）细胞性抗原或颗粒性抗原
细胞性抗原：主要包括人、动物的细胞，还有细菌、螺旋体及寄生虫等。
如菌体（O）抗原的制备：选择标准菌株，接种于斜面或平板培养基表面；置
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二、动物免疫
（一）免疫动物的选择
选择动物时应考虑以下因素： ①抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫动物种属差异越远，其免疫源 性越强，免疫效果越好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。
②动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正常动物（以雄性为佳）；抗
体需要量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵 羊、山羊、马、驴等大动物。
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放射免疫法： 以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原（放射
性核素标记）混合，孵育24h后，测定其结合率（用液体闪烁
计数仪测定Ag*－Ab或游离Ag*）。通常以结合率为50%的血清 稀度为效价。如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1： 15000，则该血清的效价就是1：15000。抗血清的效价，除由 抗血清本身的性质决定外，还受标记抗原的质量、孵育时间，
抗体效价。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗
体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。 抗血清的效价：就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常
用的是放射免疫法，此法对所有的抗体均适用。某些由大分子（如蛋白类）
抗原所产生的抗体，可用双向扩散等方法测定。前者测定的效价极为精确。 而后者则粗糙得多。
所用稀释液的成分及其pH等因素的影响，在工作中必须引起
注意。
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双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产
生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。
琼脂板的制备：100ml pH7.1 的磷酸盐缓冲液加到15g的琼脂内，于水浴 中加温，搅拌，使琼脂完全溶解，趁热用纱布过滤，待溶液冷却到65℃左
右时，加入叠氮钠（NaN3），使其在溶液中的浓度为0.1%。用移液管把琼
脂放在干净平皿或玻片上，约3mm厚，待其冷却，完全凝固后，用打孔器 打孔。中央孔内加适量抗原（容量为50μl），周围各孔内分别加入50μl
1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀释的抗血清，37℃下孵育24h，
观察有无沉淀线产生，以判断血清的稀释度。
纯度鉴定：常用区带电泳法鉴定。
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3）半抗原
半抗原物质多数为低分子质量的物质，如：多糖、多肽、甾体激素、脂 肪胺、类脂质、核酸、某些药物及其它化学药品； 常用载体：蛋白质类如：牛血清白蛋白、人血清清蛋白、兔血清清蛋白
等。多肽聚合物：如多聚Lys（赖氨酸）
大分子聚合物：如羟甲基纤维素；
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（二）免疫方法
选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫途径、免疫次数、免疫间 隔等因素。 1、免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、动物的个体状态 和免疫时间来确定。首次免疫时，剂量不宜过大，以免产生免疫麻痹。 2、免疫途径与免疫间隔时间 免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结等，视不同的免 疫方案而异。对于不易获取的宝贵抗原可采用淋巴结免疫法。
蛋白质分离
盐析法 凝胶层析法 离子交换法
蛋白质的分级沉淀 分子质量有差别的可 溶性物质 可电离的生化物质
亲和层析法
分离物与配体间的 亲和作用
物质的带电性质
分辨力很强
设备简单、操作方便、 分辨率高
生物大分子物质
生物分子的分离、定 性、定量
电
泳
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（4）纯化抗原的鉴定
含量测定：采用常规蛋白或糖类浓度测定法，一般采用分光光度计 测量法； 相对分子量的鉴定：一般采用SDS-PAGE电泳法；
酸：尿苷酸（poly A：U）；
④油剂：如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等；
⑤纳米佐剂
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应用最多的是弗氏佐剂和细胞因子佐剂
弗氏佐剂：
不完全佐剂:液体石蜡+羊毛脂 完全佐剂:液体石蜡+羊毛脂+卡介苗 弗氏佐剂：抗原=1：1 乳化成“油包水”乳液 （乳化方法主要有研磨法和注射器混合法）。 完全佐剂一般不连续2次使用
抗体的生产制备
2016.12.05
特异性抗体的制备与纯化技术


多克隆抗体（抗血清） 单克隆抗体（杂交瘤技术）
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单克隆抗体与多克隆抗体
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抗体发展史
抗体制备技术主要经历了三代： 第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体，称 为多克隆抗体（polyclonal antibody）； 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体 称为单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）； 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体（genetic engineering antibody）。
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（一）抗原的制备 （二）免疫动物 （三）免疫血清的收集、分离和保存 （四）抗体的纯化 （五）免疫血清的鉴定
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（六）免疫失败的可能原因及应采取的措施
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（一）抗原的制备
免疫原（immunogen）指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或 致敏淋巴细胞；抗原最重要的性质是免疫原性（immunogenicity） 免疫原—天然抗原、人工合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原；
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2）抗血清的采集
采集：颈动脉放血、心脏采血、静脉采血 分离：室温自然凝固1～2h，然后放4℃冰箱过夜，待血块收 缩后分离血清，有些血清须经56℃30min 使补体灭活。 保存：4℃保存—存放3个月至半年 低温保存（-70 ℃ ～-20 ℃ ）—2至3年，忌反复冻融 真空干燥保存—4-5年
半抗原－载体连接方法：常用物理法和化学法。
物理吸附的载体有羟甲基纤维素等，其借助电荷和微孔吸附半抗原；
化学法则是利用某些功能基团把半抗原连接到载体上。
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四）免疫佐剂
某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增强机体对该抗原的特 异性免疫应答或改变免疫应答类型，此类物质称为免疫佐剂 (immunoadjuvant)，简称佐剂。
获得后立即去除表面的包膜或结缔组织以及大血管，在4 ℃水浴或冰浴中将
洗净的组织剪成小块，加入适量生理盐水，装入捣碎机破碎制成组织匀浆。 （2）细胞破碎：提取细胞可溶性抗原，需将细胞破碎，常用方法有冷热交替 法、超声破碎法，反复冻融法、自溶法和酶处理法等。
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（3）蛋白提纯
① 超速离心法：常用密度梯度介质有蔗糖、甘油； ② 选择性沉淀法（盐析沉淀法）：其原理是根据蛋白质理化
• 具有无毒性或副作用低的特点。
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1、佐剂的种类
佐剂一般包括以下几类： ①无机佐剂：如氢氧化铝、明钒等 ②生物性佐剂：如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰 阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等； ③人工合成佐剂： 如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、双链多聚腺苷
温箱37℃ 培养24h，用适量的无菌生理盐水刮下菌苔，移入无菌含有玻璃珠的 三角瓶中，充分摇匀菌体；100 ℃ 水浴2～2.5h杀菌并破坏鞭毛抗原。取处理
过的菌液，检测有无活菌的存在，合格后用无菌生理盐水稀释成每毫升8亿～
10亿个细菌，加入苯酚（石炭酸）至最终浓度为5％，即为O抗原。
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注意：保存前需经除菌 保存液含防腐剂 避免反复冻融（分装）
良好的佐剂应当具备以下条件：
• 增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性；
• 佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，降低抗原的分解速度，使 抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体；
• 佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫；
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3、佐剂的作用机制
佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种：
①可增强抗原的表面积和改变抗原活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性。
②佐剂与抗原混合一起注入机体，可改变抗原的物理性状，形成抗原储存库，延
长抗原在局部组织的滞留时间，有利于抗原的缓慢释放。
③增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易被吞噬细胞吞噬），促进对抗 原的处理，刺激淋巴细胞增生，从而增强和扩大免疫应答的效应。