葡聚糖凝胶层析实验报告
葡聚糖层析实验报告
一、实验目的1. 掌握葡聚糖凝胶层析的原理及其在生物大分子分离中的应用。
2. 学习并掌握葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
3. 通过实验，验证葡聚糖凝胶层析对分子量不同的物质具有分离效果。
二、实验原理凝胶层析，又称分子排阻层析或凝胶过滤，是一种基于被分离物质分子量差异的层析分离技术。
该技术利用凝胶颗粒的多孔网状结构，通过分子量差异使不同组分在层析柱中以不同的速度移动，从而达到分离的目的。
葡聚糖凝胶是一种由直链的葡聚糖分子和交联剂3-氯1，2-环氧丙烷交联而成的高分子化合物。
通过调节葡聚糖和交联剂的比例，可以控制凝胶颗粒的孔径大小。
分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随溶剂流动快速流出层析柱；而分子量小的物质可进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程慢，后流出层析柱。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 葡聚糖凝胶（Sephadex）- 标准蛋白质溶液（如牛血清白蛋白、鸡蛋清蛋白等）- 溶剂（如磷酸盐缓冲溶液）- 离心机- 层析柱- 漏斗- 吸管2. 实验仪器：- 电子天平- 移液器- 显微镜四、实验步骤1. 准备层析柱：将葡聚糖凝胶倒入层析柱中，用溶剂冲洗，直至凝胶床均匀。
2. 加载样品：将标准蛋白质溶液加入层析柱中，使其在凝胶床表面形成一薄层。
3. 洗脱：用溶剂缓慢冲洗层析柱，收集不同时间流出的洗脱液。
4. 分析洗脱液：将收集到的洗脱液进行比色分析或电泳分析，确定各组分的位置。
五、实验结果与分析1. 实验结果：- 洗脱液在比色分析或电泳分析中，可观察到不同分子量的蛋白质分别在凝胶层析柱中的位置。
- 小分子量的蛋白质先流出层析柱，大分子量的蛋白质后流出。
2. 结果分析：- 通过实验，验证了葡聚糖凝胶层析对分子量不同的物质具有分离效果。
- 实验结果表明，小分子量的蛋白质在凝胶层析柱中的流动速度较快，大分子量的蛋白质流动速度较慢。
六、实验结论1. 葡聚糖凝胶层析是一种基于分子量差异的层析分离技术，在生物大分子分离中具有广泛的应用。
凝胶层析_实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理和操作方法。
2. 掌握凝胶层析分离混合物中不同组分的基本技能。
3. 分析实验结果，验证实验原理。
二、实验原理凝胶层析是一种基于分子筛效应的分离技术。
该技术利用凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛，分子量不同的物质通过凝胶柱的速度也不同。
在凝胶层析实验中，样品被注入凝胶柱，随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱，从而实现分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：混合样品、葡聚糖凝胶、洗脱液（如蒸馏水、乙醇等）。
2. 实验仪器：凝胶层析柱、注射器、恒流泵、收集器、滤纸、烧杯等。
四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：将葡聚糖凝胶倒入层析柱，轻轻敲打柱底，使凝胶均匀分布。
2. 洗脱液平衡：将凝胶层析柱放入盛有洗脱液的烧杯中，使凝胶充分浸泡。
3. 样品制备：将混合样品与洗脱液按一定比例混合，制成样品溶液。
4. 注射样品：将样品溶液注入凝胶层析柱。
5. 收集分离组分：随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱。
将收集器放置在凝胶柱下方，收集分离组分。
6. 分析实验结果：观察收集到的组分，分析实验结果。
五、实验结果与分析1. 分离效果：通过凝胶层析实验，成功分离出混合样品中的不同组分。
2. 分组情况：根据收集到的组分，分析其分子量大小，确定分离效果。
3. 实验原理验证：实验结果表明，凝胶层析能够有效分离混合物中的不同组分，验证了实验原理。
六、实验讨论1. 凝胶层析的原理：凝胶层析的原理是基于分子筛效应，通过凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
2. 影响分离效果的因素：实验过程中，洗脱液的种类、流速、凝胶的孔径等因素会影响分离效果。
在实验中，应严格控制这些因素，以确保分离效果。
3. 实验结果分析：通过分析实验结果，可以了解不同组分在混合样品中的含量和分子量大小，为后续研究提供数据支持。
葡聚糖凝胶Sephadex G–25柱层析法脱盐分离蛋白质实验技术总结
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结 构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富 于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网 眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼， 小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼 的物质分子则不能，故称为“分子筛”。 小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并 随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动， 从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒 的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝
胶
柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢； 大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不 能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶 颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、 流速快，比小分子先流出层析柱；小分 子最后流出。分子大小介于完全排阻不 能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质 分子，则居中流出。这样被分离物质即 被按分子的大小分开。
层析法的基本原理
层析法是利用混合物中各组分物理化学性 质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲 和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为 固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为 流动相）体系中的分布程度不同，从而使各组分 以不同的速度移动而达到分离的目的。
如盐析（粗分级分离）向蛋白质 溶液中加入大量的中性盐[（NH4)2SO4， Na2SO4，Na2SO4]，使蛋白质脱去水化 层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。
可见，不同类型的各种凝胶溶涨所需 的最少时间是不相同的，请参考有关的技 术数据。 在凝胶溶涨的处理过程中，不能进行 剧烈搅拌，禁止使用电磁搅拌器，以为这 样会使凝胶颗粒破裂而产生碎片。
2. 装柱
将层析剂装入柱中进行层析的方法称 柱层析法。 作层析用的柱子称层析柱。 柱子的一 端为进口，另一端为出口，出口端底部有 烧结玻璃砂板 ，能阻止层析剂流出，溶剂 则可流过。 层析柱的长短粗细根据实验的 目的而定，一般说来，凝胶层析时柱越长， 分离效果越好。但柱过长，层析时间长， 样品易稀释造成扩散。
05 实验五 葡聚糖凝胶层析
实验五. 葡聚糖凝胶层析【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。
2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
【实验原理】凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。
层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。
葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。
凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。
可分离的分子量范围从几百到几十万不等。
葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。
分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。
若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。
本实验以葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝。
蓝色葡聚糖—2000分子量接近2×106，而溴酚蓝分子量为670，二者分子量相差较大，前者完全排阻，而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内，二者通过层析柱的时间不同而分开。
【实验材料】1.实验器材层析柱(1×20cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹；洗脱液瓶(带下口的三角瓶，250m1)；试管及试管架；量筒10m1；721型分光光度计2.实验试剂(1) Tris—醋酸缓冲液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900m l，用浓醋酸调pH至7.0，加蒸馏水至1000m1。
葡聚糖凝胶层析
1.凝胶的预处理交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。
方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5～10倍的去离子水中，参照相关资料中凝胶溶胀所需时间，进行充分浸泡，然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。
在许多情况下，也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡。
2.装柱层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。
纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。
去除盐及游离荧光素约为样品体积的4～10倍。
柱太短，影响分离效果。
柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。
层析柱的内径也要选择适当。
内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。
所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。
对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。
凝胶柱的装填方法和要求，基本上与离子交换柱的制备相同。
一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致，没有空隙和气泡。
通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后，将带色的兰葡聚糖–2000、细胞色素，或血红蛋白等物质配制成质量浓度为2g/L的溶液过柱，观察色带是否均匀下移，以鉴定新装柱的技术质量是否合格，否则，必须重新装填。
3.加样与洗脱（1）加样量：加样量与测定方法和层析柱大小有关。
如果检测方法灵敏度高或柱床体积小，加样量可小；否则，加样量增大。
例如利用凝胶层析分离蛋白质时，若采用28Onm波长测定吸光度，对一根2cm×6Ocm的柱来说，加样量需5mg左右。
一般来说，加样量越少或加样体积越小(样品浓度高)，分辨率越高。
通常样品液的加入量应掌握在凝胶床总体积的5％～10％。
样品体积过大，分离效果不好。
对高分辨率的分子筛层析，样品溶液的体积主要由内水体积(Vi)所决定，故高吸水量凝胶如Sephadex G-200，每mL总床体积可加0.3～0.5mg溶质，使用体积约为0.O2倍总体积；而低吸水量凝胶如Sephadex G–75，每mL总床体积加溶质质量为0.2mg，样品体积为0.Ol倍总体积。
葡聚糖凝胶层析
葡聚糖凝胶层析一、实验目的1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。
二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。
一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。
这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
三、仪器、材料和试剂1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。
2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。
四、实验步骤1、装柱将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。
2、上样装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。
3、洗脱和收集打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。
4、样品的检测收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。
五、实验结果及分析1、实验结果：2、蛋白质样品洗脱曲线：收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。
实验五葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质
分配系数：在一定的条件下，某种组分在 固定相和流动相中浓度的比值，常用K值 表示。
溶质在固定相中的浓度（Cs）
K=
溶质在流动相中的浓度（Cm）
☻K值大：被固定相吸附的牢固，随流动相的移 动速度较慢。
☻若混合物中各组分K值相差较大, 则能较易地分 离，反之，K值相差较小，分离效果差。
离子交换层析(ion exchange chromatography)
低分子量蛋白、多肽的分离
3,000~70,000 中低分子量蛋白、多肽的分离 4,000 ~150,000 中高分子量蛋白的分离 5,000 ~400,000 高分子量蛋白的分离 5,000 ~800,000
重点1
凝胶层析的原理 分子筛效应
比孔径大的分子不能扩散到孔穴内部， 完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外 的空间随流动相向下流动，它们经历的 流程短，流动速度快，首先流出。
临床医学五年制本科
掌握装柱、加样、洗脱、收集样品的操作步骤。
使用教材：
《生物化学与分子生物学实验技术》，杨安钢主 编，高等教育出版社，2008年第1版
参考资料：
《生物化学》，贾弘褆主编，人卫出版社，2005 年第1版
推荐网站：
1. 第三军医大学生物化学与分子生物学教研室： http://192.168.4.133:8002/ 2. 美国国立生物技术信息中心：
较小的分子则可以渗透进入凝胶颗粒内 部，然后再扩散出来，经历的流程长， 流动速度慢，后流出。
凝胶层析的数理关系
外水体积Vo 柱床体积Vt 凝胶体积Vg = Vg + Vo + Vi = r2h
内水体积Vi
洗脱体积（Ve）：自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所 流出的洗脱液体积（Ve） 。
葡聚糖凝胶柱层析
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外。
亲水性
葡聚糖凝胶是一种亲水性凝胶，在 水中能够膨胀并保持稳定的结构。
分子筛作用
由于凝胶的网孔大小不同，不同大 小的分子在通过凝胶柱时的路径和 速度也不同，从而实现分子的分离。
柱层析分离原理
吸附与解吸
样品中的各组分在葡聚糖凝胶上 的吸附能力不同，通过选择合适 的洗脱液，可以实现各组分的分
离。
分子筛效应
4. 上样
5. 洗脱与收集
将待分离样品溶解在少量洗脱液中，沿柱 内壁缓慢加入，避免冲击凝胶表面。
开启恒流泵，以恒定流速进行洗脱，同时 用收集器按一定时间或体积收集流出液。
6. 检测与记录
7. 结果分析
对收集到的流出液进行适当稀释后，利用 紫外可见分光光度计或酶标仪等检测目标 物质的含量，并记录数据。
优点
分辨率高，操作简便，重 复性好，对样品的适用范 围广。
缺点
对于某些非水溶性物质或 极端条件下的分离效果不 佳，且分离过程中可能存 在吸附损失。
02 实验材料与方法
主要试剂与仪器
主要试剂
葡聚糖凝胶（如Sephadex G-25 、G-50、G-100等）、洗脱液（ 一般为缓冲液或盐水）、待分离 样品。
基本原理 • 实验材料与方法 • 葡聚糖凝胶柱层析在生物大分子分离中应
用 • 葡聚糖凝胶柱层析在药物分析中应用 • 葡聚糖凝胶柱层析在环境科学中应用 • 实验结果分析与讨论
01 葡聚糖凝胶柱层析基本原 理
葡聚糖凝胶结构与性质
三维网状结构
葡聚糖凝胶具有三维的交联网状 结构，这种结构允许小分子进入 凝胶内部，而大分子则被排除在
环境污染物检测与去除
层析凝胶法实验报告
1. 了解层析凝胶法的原理及其应用。
2. 掌握层析凝胶法的基本操作步骤。
3. 学习利用层析凝胶法分离混合物中的不同组分。
二、实验原理层析凝胶法，又称分子筛层析法，是一种利用凝胶作为固定相，根据分子大小不同进行分离的技术。
凝胶是一种具有多孔结构的物质，其孔径大小可以调节，从而实现对不同分子大小的分离。
在层析过程中，分子量较大的物质无法进入凝胶内部，只能沿凝胶颗粒间的缝隙流出；而分子量较小的物质可以进入凝胶内部，流速较慢，最后流出柱外。
通过这种差异，样品中的不同组分可以得到有效分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：混合物样品、葡聚糖凝胶、洗脱液、收集瓶等。
2. 实验仪器：层析柱、紫外-可见分光光度计、电子天平等。
四、实验步骤1. 准备凝胶：将葡聚糖凝胶用洗脱液浸泡，使其充分膨胀，然后装入层析柱中。
2. 样品制备：将混合物样品溶解于适量的洗脱液中，调整其浓度为1mg/mL。
3. 上样：将样品溶液缓慢加入层析柱中，使其均匀分布在凝胶表面。
4. 洗脱：用洗脱液冲洗层析柱，收集不同洗脱体积的洗脱液。
5. 分析：使用紫外-可见分光光度计测定不同洗脱体积的洗脱液吸光度，确定各组分的洗脱时间。
6. 收集：将不同洗脱时间的洗脱液收集于不同试管中，进行后续分析。
五、实验结果与分析1. 通过紫外-可见分光光度计测定不同洗脱体积的洗脱液吸光度，绘制洗脱曲线。
2. 根据洗脱曲线，确定各组分的洗脱时间。
3. 对收集的洗脱液进行后续分析，如质谱、核磁共振等，确定各组分的成分。
1. 层析凝胶法是一种有效分离混合物中不同组分的技术。
2. 通过调节凝胶的孔径大小，可以实现不同分子大小的分离。
3. 本实验成功分离了混合物中的不同组分，为后续分析提供了基础。
七、实验讨论1. 层析凝胶法的分离效果受多种因素影响，如凝胶的孔径大小、洗脱液的流速等。
在实际操作中，需要根据样品特性和实验目的选择合适的实验条件。
2. 层析凝胶法适用于分离分子量较大的物质，对于分子量较小的物质，可能需要采用其他分离方法。
葡聚糖凝胶Sephadex G–25柱层析法脱盐分离蛋白质实验技术总结
G –25 G-50 G-75 G-100
6 6 24 48
2 2 3 5
1000~5000 1500~30000 3000~70000 4000~1500000
目前多用“热法”溶涨，这样可大大 加速溶涨平衡，通常1—2h即可完成。 “热法”溶涨还可以消毒，杀灭凝胶中污 染的细菌，同时也排除了凝胶内的汽泡。
一实验目的1掌握葡聚糖凝胶柱层析法脱盐分离蛋白质的原理2学会葡聚糖凝胶柱层析法脱盐和分离蛋白质实验操作技术凝胶过滤层析技术二基本原理当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时根据它们分子大小不同而进行分离的技术
葡聚糖凝胶Sephadex G – 25柱 层析法脱盐分离蛋白析法也称色谱法，是1906年俄国植物学 家Michael等发现并命名的。他将植物叶子的色 素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的 速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名 为“色谱法”（Chromatography) 。后来无色 物质也可利用吸附柱层析分离。1944年出现纸层 析， 以后层析法不断发展，相继出现气相层析、 高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析 等。
6. 检测
在收集的同时，用 20%磺酰水扬酸检 测；加入奈氏试剂检测蛋白质中的硫酸铵， 蛋白管中不出现棕色。 合并纯化后的蛋白质管以待用。以光密 度值为纵坐标（紫外检测，因时间长） ，以 收集管的顺序号为横坐标，在坐标纸上绘图。 可获具有一条洗脱峰的曲线，称为洗脱曲线， 用以表示被分离物质流出的状态。
在凝胶层析中，不仅要保持静水压的 恒定，还要保持适当的静水压。这是因为 G–75以上的软胶胶体柔软易变形， 最初 流速会很快，其后随着静水压力过大将使 软胶变形压紧，流速逐渐降低，最后甚至 流不出。 保持恒定正确的静水压是凝胶层 析时获得满意结果的必要条件。 脱盐一般使用的是G–25属于硬胶，硬 胶不易变形，受静水压的影响较小。
葡聚糖凝胶层析实验报告
葡聚糖凝胶层析实验报告一、实验目的1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。
二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。
一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。
这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
三、仪器、材料和试剂1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。
2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。
四、实验步骤1、装柱将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。
2、上样装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。
3、洗脱和收集打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。
4、样品的检测收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。
五、实验结果及分析1、实验结果：序号 2 4 6 8 10 12 14吸光0．051 0.045 0.051 0.071 0.195 0.127 0.067 度A序号16 8吸光0.055 0.039 0.066 0.027 0.053 0.049 0.011度A2、蛋白质样品洗脱曲线：收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。
葡聚糖凝胶柱层析
分离 范围
颗粒 大小 （μm）
<700 <1500 1000~5000
干粉40~120 干粉40~120 干粉100~300
1000~5 000
干粉50~150
1000~5000
干粉20~80
1000~5000
干粉10~40
1500~30000
干粉100~300
1500~30000
干粉50~150
1500~30000
pH 稳定性 工作
2~13 2~13 2~13
干凝胶 溶胀体
积mL/g
2~3 2.5~3.5 4~6
溶胀最少 平衡时间h
室温 沸水
3
1
3
1
6
2
最快 流速 (cm/h)
2~5 2~5 2~5
2~13 4~6
6
2
2~5
2~13 4~6
6
2
2~5
2~13 4~6
6
2
2~5
2~10 9~11
6
2
2~5
2~10 9~11
2、影响凝胶层析分离的因素：
2.1、样品的体积、粘度。 2.2、层析柱 ：（高度，内径，材质）。 2.3、洗脱液的流速：
过慢：扩散； 过快：拖尾。 2.4、洗脱液的离子强度、pH。
2.1、样品的体积、粘度：
分析分离时：Vsample=1-4%Vbed； 制备分离时：Vsample=25-30%Vbed. 分离体积(Vsep): 相邻两组分Ve之差，用于衡量相邻两组分的
同型号的胶，同样的床体积，粒度小的胶对样品的分离度要优 于粒度大的胶，即有较高的分辨率。
4.4、凝胶的防腐、保存：
Sephadex、Sepharose 是多糖类物质，易于长菌。因 此，常在凝胶不用时，加入抑菌剂，使用时再除去。
葡聚糖凝胶层析
葡聚糖凝胶层析一、实验目的1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。
二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。
一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。
这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
三、仪器、材料和试剂1、仪器：内直径为1cm，外直径为 1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。
2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。
四、实验步骤1、装柱将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。
2、上样装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。
3、洗脱和收集打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。
4、样品的检测收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。
五、实验结果及分析1、实验结果：序号 2 4 6 8 10 12 14 吸光0．051 0.045 0.051 0.071 0.195 0.127 0.067 度A序号16 18 20 22 24 26 28 吸光0.055 0.039 0.066 0.027 0.053 0.049 0.011度A2、蛋白质样品洗脱曲线：收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。
实验五葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质
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装柱时需保持柱体垂直于水平面，不可随意 晃动层析柱，以保持凝胶柱表面平整。
加样时移液器垂直伸入柱内，接近液面处集 中滴加，动作要轻柔，不要将床面冲起。 实验过程中需密切注意保持层析柱中的凝胶 始终处于蒸馏水中，防止蒸馏水排空。
吸附层析(absorption chromatography)
低分子量蛋白、多肽的分离
3,000~70,000 中低分子量蛋白、多肽的分离 4,000 ~150,000 中高分子量蛋白的分离 5,000 ~400,000 高分子量蛋白的分离 5,000 ~800,000
重点1
凝胶层析的原理 分子筛效应
比孔径大的分子不能扩散到孔穴内部， 完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外 的空间随流动相向下流动，它们经历的 流程短，流动速度快，首先流出。
亲和力 生物分子间存在很多特异性的相互作用， 如抗原－抗体、酶－底物、激素－受体等， 它们之间都能够专一而可逆的结合。 分离原理 在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的 配基，这些配基可以与流动相中溶质分子发 生可逆的特异性结合而进行分离纯化。
1. Incubate crude sample with the immobilized ligand
混合物随流动相经固定相(网状孔径)的
层析柱时，混合物中各组份按其分子大
小不同而被分离的技术。
固定相（凝胶）
凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔 网状结构的高分子聚合物，每个颗粒的细 微结构及筛孔的直径均匀一致。
☻葡聚糖凝胶（Sephadex） ☻琼脂糖凝胶（Sepharose）
☻聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide）
葡聚糖凝胶柱层析法分离蛋白质
葡聚糖凝胶层析法
实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法；一、实验目的；1.掌握凝胶层析的基本原理；2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实；二、实验原理；凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大；将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表；式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大；上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶；如果假定蛋白质实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法一、实验目的1.掌握凝胶层析的基本原理。
2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。
二、实验原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。
当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。
该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。
凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。
当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。
大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。
若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。
总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。
将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。
实质上Vt是由V i与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi 为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。
实验五葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质.
现代人提倡的十大健康生活方式一、少食肉俄罗斯眼下流行素食风。
他们认为大量食用各类肉及其制品，会加重某些疾病或诱发某些疾病。
二、晒太阳美国纽约州的居民推崇有空即晒太阳的生活方式，他们认为平常接受阳光的适当照射，有助身体贮存大量的维生素D，有益牙齿与骨骼的健康。
三、雨中行冒着霏霏细雨逛街或散步是现代欧美人的一种时髦。
他们认为，绵绵细雨可洗涤尘埃，净化空气，增加空气中的负氧离子，有益肺与大脑的保健。
四、常唱歌美国马里兰大学的专家倡导，经常唱歌，有益健康长寿。
因为唱歌有益大脑的逻辑思维，且唱歌时声带、肺部、胸肌等能得到良好锻炼。
五、饭后息饭后稍事休息或卧床片刻，再去散步或做其他事情，更有利于食物的消化吸收、胃肠保养和肝脏功能的养护。
因此，在日本、韩国“饭后稍休息，再去百步走”已成为一种健康养生的大众之举。
六、挺起胸抬头挺胸，不仅令人有气质、看上去年轻而精力充沛，而且抬头有助减轻腰骨疼，挺胸会减少脊椎的负荷。
七、静坐思忙中偷闲，静下心来，每日静坐冥思1～2次，每次30分钟左右，排除杂念，放松身心，有助解除神经头痛、降血压。
美国得克萨斯州的居民流行这样的健康风。
八、步当车以步当车可以防止骨骼退化，有助增加心肺功能，还有利于新陈代谢，有利于减肥，欧美国家已日渐盛行。
九、行善事助人为乐，帮人之困，济人之危，可以使你心情舒畅，获得一种难以名状的心理满足，这有助强化人的免疫系统，调节身心“合二为一”，有利健康长寿。
十、户外行将风靡欧洲的野餐生活新体验方式带入中国的YODO悠度友情提醒：多去户外走走，有益身体健康;在呼吸新鲜空气的同时，也可享受阳光灿烂的美好。
享受天天好心情的惬意。
今天的生活习惯决定了十年后的身体健康。
我们每天高达90%的行为都是出于习惯，你每天吃什么、运动与否、心态好坏、有无信仰……都决定了你的身体处于什么状态。
以下20个健康的生活方式，可以让你远离疾病困扰，健康长寿。
1、喝茶前进行充分搅拌。
茶中富含的抗氧化剂(多酚)有助于人体抵御心脏病、癌症和过早老化。
实验八 凝胶层析
实验八凝胶层析一实验目的：掌握凝胶层析的基本原理，学会使用凝胶层析分离纯化蛋白质。
二重点难点：凝胶层析分离蛋白质的基本原理三实验原理：凝胶层析又称凝胶过滤，是选用一定大小空隙的凝胶，将混合液中的小分子和大分子物质“筛”开来的一种分离方法。
本实验采用交联葡萄聚糖凝胶G-25作为层析柱，将蓝色葡聚糖和铬酸钾混合物进行分离。
加样后，以0.9% NaCl为溶剂进行洗脱。
由于蓝色葡聚糖和铬酸钾分子量不同，通过交联葡聚糖凝胶层析柱时，分子量较小的铬酸钾进入凝胶颗粒内部网格中，而分子量较大的蓝色葡聚糖分子经凝胶颗粒间的空隙随溶剂先流出，易进入凝胶颗粒内部网格中的铬酸钾分子经过一定时间后才能随溶剂洗出，即分子量大者先洗出，分子量小者后流出，如此，分子大小不同的物质就能被分开。
蓝色葡聚糖和铬酸钾在凝胶柱中可被分离出两条不同颜色的区带，并可分别进行收集。
四实验步骤：具体内容如下：（具体步骤见《基础生物化学实验》P102）1凝胶处理0.9% NaCl浸泡过夜，不用时置4度冰箱保存（夏天需加入叠氮钠防腐）。
2装柱将柱垂直装好，关闭出口。
加入洗脱液1cm高。
将处理好的凝胶用等体积的洗脱液调成浆状，自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中，待底部凝胶沉积约1cm时再打开出口，继续加入凝胶浆至凝胶沉积至一定的高度即可。
装柱要求连续、均匀，无气泡，无纹路。
3平衡洗脱液平衡4加样将柱中多余的液体放出，使得液面刚好盖过凝胶，关闭出口。
将1ml样品沿层析柱管壁小心加入，加完后打开底端入口，使液面降至与凝胶面相平时关闭出口。
5洗脱收集不断加入洗脱液，保持洗脱液面高于凝胶面。
收集洗脱液，紫外检测，记录。
6实验结束后，反复用蒸馏水洗脱柱。
回收玻璃管内凝胶。
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葡聚糖凝胶层析实验报告
一、实验目的
1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；
2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。
二、实验原理
凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排
阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水
体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的
筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出
柱外，而大分子先从柱中流出。
一些中等大小的分子介于大分子与小
分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这
些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。
这样样品经过凝胶
层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
三、仪器、材料和试剂
1、仪器：内直径为1cm，外直径为 1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。
2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。
四、实验步骤
1、装柱
将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让
柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。
2、上样
装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。
3、洗脱和收集
打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。
4、样品的检测
收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。
五、实验结果及分析
1、实验结果：
序号 2 4 6 8 10 12 14
吸光
0．051 0.045 0.051 0.071 0.195 0.127 0.067 度A
序号16 8
吸光
0.055 0.039 0.066 0.027 0.053 0.049 0.011
度A
2、蛋白质样品洗脱曲线：
收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：
流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。