葡聚糖凝胶层析

实验操作
1.实验凝胶的处 理: 用洗脱液把杂质 漂洗干净. 2.装柱: A.将层析柱洗净, 垂直固定在铁支 架上,选择有薄 膜端作为层析柱 下口,将下口接 上乳胶管并用螺 旋夹夹紧.
B.层析柱中加入洗脱液,打开下口 螺旋夹,让溶液流出,排除残留气 泡,最后保留约2厘米高度的洗脱液, 拧紧螺旋夹. C.将凝胶轻轻搅动均匀,用玻璃棒 沿层析柱内壁缓缓注入柱中,待凝 胶沉积到柱床下已超过l厘米时,打 开下口螺旋夹,继续装柱至柱床高 度达到12厘米,关闭出口.再用洗脱 液平衡l至2个柱床体积,凝胶面上 始终保持有一定的洗脱液.平衡后, 拧紧下端螺旋夹.注意事项:装柱 过程中严禁产生气泡,尽可能一次 装完,避免出现分层.
3.加样品:打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出, 直至床面与液面刚好平齐为止,关闭下端出口. 取溴酚蓝及蓝色葡聚糖—2000混合液0.3毫升,小 心地加于凝胶表面上,切勿搅动层析柱床表面. 打开下端出口,使样品溶液进入凝胶内,并开始 收集流出液.当样品溶液恰好流至与凝胶表面平 齐时,关闭下端出口.用少量洗脱液清洗层析柱 加样区,共洗涤三次,每次清洗液应完全进入凝 胶柱内后,再进行下一次洗涤.最后在凝胶表面 上加入洗脱液,保持高度为3—4cm.
葡聚糖凝胶层析
实验目的
【实验目的】 实验目的】 1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理.
2.学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术.
葡聚糖凝胶层析原理
凝胶过滤层析也称分子筛层析,排阻层析. 是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用, 根据被分离物质的分子大小不同来进行分 离
凝胶层析: 凝胶层析:
4.洗脱与收集:连接好凝胶柱层析系统,调 节洗脱液流速为每分钟1毫升,进行洗脱. 仔细观察样品在层析柱内的分离现象,收 集洗脱液,每收集3毫升即换一支收集管(试 管预先编号),收集约20管左右,样品即可 完全被洗脱下来.将各收集管中的洗脱液 分别用721型分光光度计在波长540nm处测 定其光密度.
5.凝胶回收处理方法:将样品完全洗脱下来 后,继续用三倍柱床体积的洗脱液冲洗凝 胶后,将柱下口放在小烧杯中,慢慢打开, 再将上口慢慢松开,使凝胶全部回收至小 烧杯中,备用.
实验结果
以洗脱管号为横坐标,以光密度为纵坐标 作图即得洗脱曲线.分析曲线图并讨论实 验结果.
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反筛效应, 反筛效应, 大分子在前, 大分子在前, 小分子在后. 小分子在后.
凝胶类型:葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼 脂糖凝胶(Sepharose). 葡聚糖凝胶:直链的葡聚糖分子和交联剂 3—氯1,2—环氧丙烷交联而成.
葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体,来分离 蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝.蓝色葡聚 糖—2000分子量接近2×106, 而溴酚蓝分 子量为670,二者分子量相差较大,前者完 全排阻,而后者则可完全进入凝胶颗粒网 孔内,二者通过层析柱的时间不同而分开.
实验材料
1.实验器材:层析柱(1×20cm)附有一小 实验器材: 实验器材 段乳胶管及螺旋夹;洗脱液瓶(带下口的 三角瓶,250m1);试管及试管架;量筒 10m1;721型分光光度计 2.实验试剂 实验试剂
(1)Tris—醋酸缓冲液(pH7.0): (2)溴酚蓝与葡聚糖—2000 混合样品. (3ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex-G-25)