实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质
葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质
凝胶层析的实际操作
4、上样 上样体积不大于6%柱床体积，上样浓度控制再35mg / ml~50 mg / ml， 以不大于12cm / h线性流速上样。
5、洗脱 用0.05mol / L NaCl-5mmol / L PB溶液，以不大于12cm / h线性流速洗脱
凝胶层析的操作注意事项
1、盐析过程盐溶液加少，盐析程度不够；盐溶液加多，盐 浓度过高有可能会导致蛋白变性； 2、蛋白的上样浓度不宜过高（70 mg / ml GE公司凝胶手册 数据 ），否则样品粘稠影响分离效果； 3、样品必须是均匀的溶液体系，没有颗粒，否则容易造成 柱子阻塞；
凝胶柱层析 分离纯化蛋白质
学习目的
了解：层析技术的基本原理;
有效分配系数Kav的计算。
理解：凝胶的选择和准备。 掌握：凝胶层析的原理和操作方法;
有效分配系数Kav的意义。
重点：
1、凝胶层析的原理和实际操作步骤。
2、分配系数与被分离分子量之间的关系。
蛋白质的分离纯化
蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间 特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。
凝胶层析的基本原理
凝胶层析（又叫分子筛层析或排阻层析） 指混合物随流动相经过装有凝胶作为固 定相的层析柱时，各组分因分子大小不 同而被分离的技术。
凝胶：一些具有立体网状结构 和一定孔径的高分子化合物。
分子大于凝胶孔隙范围的物质： 随着溶剂在凝胶颗粒间流动
分子小于凝胶孔隙范围的物质： 渗入凝胶颗粒的孔隙中
型号：S-100,S-200,S-300,S-400等
Sephacryl的常见规格（分级范围）
预装柱
车间现有规格 1000~100000
凝胶层析的实际操作
葡聚糖凝胶层析实验报告
葡聚糖凝胶层析实验报告一、实验目的1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。
二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。
一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。
这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
三、仪器、材料和试剂1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。
2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。
四、实验步骤1、装柱将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。
2、上样装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。
3、洗脱和收集打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。
4、样品的检测收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。
五、实验结果及分析1、实验结果：序号 2 4 6 8 10 12 14吸光0．051 0.045 0.051 0.071 0.195 0.127 0.067 度A序号16 8吸光0.055 0.039 0.066 0.027 0.053 0.049 0.011度A2、蛋白质样品洗脱曲线：收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。
实验三 蛋白质脱盐(透析和凝胶过滤)
20min.离心后倒掉上清液，加 5ml 蒸馏水溶解沉淀物，即为样品。
5、 上样：当胶床表面仅留约 1mm 液层时，吸取 1ml 样品，小心的注入层析柱胶床面中央，
慢慢打开螺旋夹，待大部分样品进入胶床，床面上仅有 1mm 液层时，用乳头滴管加入
少量蒸馏水，使剩余样品进入胶层，然后用滴管小心加入 3cm～5cm 高的洗脱液。
6、 洗脱：继续用蒸馏水洗脱，调整流速，使上下流速同步。用核酸蛋白检测仪检测，同时
用部分收集器收集洗脱液。合并与峰值相对应的试管中的洗脱液，即为脱盐后的蛋白质
溶液。
7、 用氯化钡溶液检测蛋白质溶液和其他各管收集液，评价脱盐效果。
结果处理
记录并解释实验现象，讨论凝胶过滤的脱盐效果。 注意事项
1、 整个操作过程中凝胶必须处于溶液中，不得暴露于空气，否则将出现气泡和断层，应当 重新装柱。
内径的滤纸片，保护凝胶床面。
3、 平衡：继续用蒸馏水洗脱，调整流量，使胶床表面保持 2cm 液层，平衡 20min。
4、 样品制备：取 5ml 蛋白质溶液于离心管中，加 4g 硫酸铵粉末，边加边搅拌，使之溶解。
然后在 4℃下静置 20min，出现絮状沉淀。将上述絮状沉淀液以 1000r/min 的速度离心
实验原理
蛋白质是大分子生物，它不能透过透析膜而小分子物质可以自由透过。
在分离提纯蛋白质的过程中，常利用透析的方法使蛋白质与其中夹杂的小分子物质分
开。
实验器材
1、透析管或玻璃纸
2、烧杯
3、玻璃棒
4、电磁搅拌器
5、试管及试管架
6、离心机
7、冰箱
8、电炉
实验试剂
1、1%氯化钡溶液
2、硫酸铵粉末
3、1mol/L EDTA
葡聚糖凝胶柱的特点
葡聚糖凝胶柱的特点
葡聚糖凝胶柱是一种常用的色谱柱，用于分离和纯化生物大分子，如蛋白质、核酸和多糖等。
它具有以下几个特点：
1. 大孔结构：葡聚糖凝胶柱内部存在着大量的孔隙，这些孔隙可以提供足够的表面积和空间来容纳样品分子。
这种大孔结构使得样品分子可以在柱内自由扩散和迁移，从而实现有效的分离。
2. 选择性：葡聚糖凝胶柱的选择性主要取决于其孔径大小和孔隙结构。
不同孔径的葡聚糖凝胶柱可以用于分离不同大小的生物大分子。
较大孔径的葡聚糖凝胶柱适用于分离较大分子，而较小孔径的葡聚糖凝胶柱适用于分离较小分子。
3. 高效性：葡聚糖凝胶柱由于具有大孔结构和选择性，可以提供高效的分离和纯化。
样品分子可以在柱内快速扩散和迁移，从而实现高效的分离。
此外，葡聚糖凝胶柱还具有较高的样品加载容量，可以处理大量样品。
4. 稳定性：葡聚糖凝胶柱具有良好的化学和物理稳定性。
它们可以在不同的溶剂和温度下使用，并且可以承受较高的压力。
这种稳定性使得葡聚糖凝胶柱可以在多种条件下进行分离和纯化。
5. 可重复使用：葡聚糖凝胶柱可以反复使用。
在使用后，可以通过适当的清洗和再生方法将其恢复到初始状态，以便下一次使用。
葡聚糖凝胶柱在生物分离和纯化领域具有广泛的应用。
它们常用于蛋白质和核酸的分离和纯化，如蛋白质层析、核酸净化和多糖分析等。
葡聚糖凝胶柱的特点使其成为生物大分子分离和纯化的重要工具，为科学研究和生物制药提供了有力支持。
葡聚糖凝胶使用说明书
葡聚糖凝胶使用说明书一、产品名称产品名称：葡聚糖凝胶型号：Gel-300二、适用范围葡聚糖凝胶适用于生物实验室、化学实验室、制药厂等场所，用于分离、纯化蛋白质、核酸、肽类等生物分子。
三、使用方法1. 准备葡聚糖凝胶和缓冲液。
根据所需的分离纯化效果，选择合适的缓冲液类型和浓度。
2. 将缓冲液加入玻璃柱或层析柱中，直至填满整个柱子。
3. 加入适量的葡聚糖凝胶，使其均匀分布在柱子的底部。
4. 将样品溶液缓慢地加入柱子中，注意不要过快，以免影响分离效果。
5. 收集洗脱液，并进行分析。
根据分离纯化的目的，可以采用不同的收集方法，如分步收集或集中收集。
6. 在每次使用后，及时清洗和保存凝胶柱，以延长其使用寿命。
四、注意事项1. 在使用葡聚糖凝胶前，应仔细阅读本说明书并遵守操作规程。
2. 避免直接接触皮肤和眼睛，若不慎接触，应立即用清水冲洗。
3. 使用过程中要避免剧烈震动或晃动，以免影响分离效果。
4. 在使用前应确认所需缓冲液的种类和浓度是否合适，避免浪费和影响分离效果。
5. 不要使用已经过期或变质的凝胶和缓冲液。
6. 在储存和使用过程中要保持环境干燥，避免潮湿和高温。
7. 使用后要及时清洗和保存凝胶柱，以免被污染和变质。
五、常见问题及解决方案1. 分离效果不佳：可能是由于凝胶或缓冲液质量问题、操作不当等原因引起的。
解决方法是检查凝胶和缓冲液的质量和浓度是否合适，确认操作规程是否正确。
若问题仍未解决，建议更换新的凝胶柱。
2. 柱子压力过高：可能是由于样品溶液中存在杂质或凝胶柱堵塞等原因引起的。
解决方法是检查样品溶液是否含有杂质，或者对样品进行预处理以去除杂质。
同时检查凝胶柱是否堵塞，若堵塞则进行清洗或更换新的凝胶柱。
3. 柱子漏液：可能是由于接头松动或密封圈损坏等原因引起的。
解决方法是重新拧紧接头或更换新的密封圈。
若问题仍未解决，建议联系售后服务与支持部门寻求帮助。
4. 洗脱液中含有杂质：可能是由于样品溶液中存在杂质或缓冲液不纯等原因引起的。
葡聚糖凝胶层析
1.凝胶的预处理交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。
方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5～10倍的去离子水中，参照相关资料中凝胶溶胀所需时间，进行充分浸泡，然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。
在许多情况下，也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡。
2.装柱层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。
纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。
去除盐及游离荧光素约为样品体积的4～10倍。
柱太短，影响分离效果。
柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。
层析柱的内径也要选择适当。
内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。
所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。
对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。
凝胶柱的装填方法和要求，基本上与离子交换柱的制备相同。
一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致，没有空隙和气泡。
通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后，将带色的兰葡聚糖–2000、细胞色素，或血红蛋白等物质配制成质量浓度为2g/L的溶液过柱，观察色带是否均匀下移，以鉴定新装柱的技术质量是否合格，否则，必须重新装填。
3.加样与洗脱（1）加样量：加样量与测定方法和层析柱大小有关。
如果检测方法灵敏度高或柱床体积小，加样量可小；否则，加样量增大。
例如利用凝胶层析分离蛋白质时，若采用28Onm波长测定吸光度，对一根2cm×6Ocm的柱来说，加样量需5mg左右。
一般来说，加样量越少或加样体积越小(样品浓度高)，分辨率越高。
通常样品液的加入量应掌握在凝胶床总体积的5％～10％。
样品体积过大，分离效果不好。
对高分辨率的分子筛层析，样品溶液的体积主要由内水体积(Vi)所决定，故高吸水量凝胶如Sephadex G-200，每mL总床体积可加0.3～0.5mg溶质，使用体积约为0.O2倍总体积；而低吸水量凝胶如Sephadex G–75，每mL总床体积加溶质质量为0.2mg，样品体积为0.Ol倍总体积。
蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用
蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用一、蛋白FITC标记1. 准备FITC溶液：将FITC溶解在适量的溶剂中（如PBS缓冲液），使其浓度为1 mg/ml。
2. 准备蛋白溶液：将待标记的蛋白溶解在PBS缓冲液中，使其浓度为1 mg/ml。
3. 将FITC溶液加入蛋白溶液中：将适量的FITC溶液加入蛋白溶液中，使其FITC蛋白的浓度为10 μg/ml。
溶液要充分混合，可以轻轻摇晃或使用旋转器。
4.反应：将反应溶液在室温下孵育30分钟至1小时。
反应时间可以根据实验需要进行调整。
5.停止反应：将反应溶液加入适量的停止溶液中，如甘氨酸溶液。
停止溶液可以中和未反应的FITC，并保护标记的蛋白不被降解。
6.蛋白FITC标记的纯化：可以通过蛋白层析或其他纯化方法将蛋白FITC标记纯化。
葡聚糖凝胶柱是一种常用的蛋白层析方法，用于分离和纯化蛋白。
1.准备葡聚糖凝胶柱：将葡聚糖凝胶柱放入层析柱中，并用适量的缓冲液（如PBS）均匀填充柱内。
2.样品加载：将待分离的蛋白样品加入层析柱中，样品可以预先进行适当的处理，如去除杂质、调整pH值等。
3.缓冲液洗脱：通过加入适量的缓冲液（如PBS），将未结合的蛋白从凝胶柱中洗脱。
可以通过监测洗脱液的吸光度或测定蛋白浓度来确定洗脱的程度。
4.目标蛋白洗脱：通过加入适量的洗脱缓冲液（如含有高浓度盐的缓冲液），将目标蛋白从凝胶柱中洗脱。
可以根据实验需要选择不同的洗脱条件，如改变盐浓度、改变pH值等。
5.纯化目标蛋白：通过收集洗脱的蛋白样品，可以进行进一步的纯化步骤，如使用其他层析方法、电泳等。
葡聚糖凝胶柱的使用可以根据实验需要进行调整，如选择不同的凝胶柱大小、调整缓冲液成分和流速等。
通过葡聚糖凝胶柱的分离和纯化，可以获得纯度较高的蛋白样品，用于后续的实验分析。
总结：蛋白FITC标记和葡聚糖凝胶柱使用是常见的蛋白实验技术。
蛋白FITC标记可以用于检测蛋白的位置和定量，通过将FITC与蛋白共价结合。
葡聚糖凝胶柱层析
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
外。
亲水性
葡聚糖凝胶是一种亲水性凝胶，在 水中能够膨胀并保持稳定的结构。
分子筛作用
由于凝胶的网孔大小不同，不同大 小的分子在通过凝胶柱时的路径和 速度也不同，从而实现分子的分离。
柱层析分离原理
吸附与解吸
样品中的各组分在葡聚糖凝胶上 的吸附能力不同，通过选择合适 的洗脱液，可以实现各组分的分
离。
分子筛效应
4. 上样
5. 洗脱与收集
将待分离样品溶解在少量洗脱液中，沿柱 内壁缓慢加入，避免冲击凝胶表面。
开启恒流泵，以恒定流速进行洗脱，同时 用收集器按一定时间或体积收集流出液。
6. 检测与记录
7. 结果分析
对收集到的流出液进行适当稀释后，利用 紫外可见分光光度计或酶标仪等检测目标 物质的含量，并记录数据。
优点
分辨率高，操作简便，重 复性好，对样品的适用范 围广。
缺点
对于某些非水溶性物质或 极端条件下的分离效果不 佳，且分离过程中可能存 在吸附损失。
02 实验材料与方法
主要试剂与仪器
主要试剂
葡聚糖凝胶（如Sephadex G-25 、G-50、G-100等）、洗脱液（ 一般为缓冲液或盐水）、待分离 样品。
基本原理 • 实验材料与方法 • 葡聚糖凝胶柱层析在生物大分子分离中应
用 • 葡聚糖凝胶柱层析在药物分析中应用 • 葡聚糖凝胶柱层析在环境科学中应用 • 实验结果分析与讨论
01 葡聚糖凝胶柱层析基本原 理
葡聚糖凝胶结构与性质
三维网状结构
葡聚糖凝胶具有三维的交联网状 结构，这种结构允许小分子进入 凝胶内部，而大分子则被排除在
环境污染物检测与去除
生化凝胶层析实验报告
一、实验目的本实验旨在通过凝胶层析技术，对混合物中的不同分子量物质进行分离和纯化。
具体目标包括：1. 掌握凝胶层析的原理和操作步骤。
2. 学习如何根据分子量差异对蛋白质等生物大分子进行分离。
3. 观察和分析实验结果，验证凝胶层析技术的有效性和可行性。
二、实验原理凝胶层析（Gel Filtration）又称分子筛层析，是一种基于分子量差异进行物质分离的方法。
该技术利用凝胶作为固定相，凝胶具有多孔结构，分子量不同的物质在凝胶中的移动速度不同，从而实现分离。
实验中常用的凝胶材料包括葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。
凝胶颗粒的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制。
交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松。
因此，不同型号的凝胶具有不同的分子量分级范围。
实验过程中，将待分离物质加入凝胶柱中，在溶剂的作用下，各组分因分子量差异在凝胶柱中以不同的速度移动。
分子量大的物质在凝胶柱中的移动速度较慢，先流出柱子；而分子量小的物质则可以进入凝胶颗粒的网孔内，移动速度较快，后流出柱子。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 待分离的混合物- 葡聚糖凝胶（Sephadex G-100）- 洗脱液（例如磷酸盐缓冲液）- 标准蛋白质溶液（例如牛血清白蛋白、肌红蛋白等）- 紫外分光光度计- 凝胶层析柱- 量筒- 移液器- 离心机2. 实验仪器：- 凝胶层析柱- 紫外分光光度计- 移液器- 量筒- 离心机四、实验步骤1. 准备凝胶柱：将葡聚糖凝胶（Sephadex G-100）用洗脱液充分溶胀，装入凝胶层析柱中。
2. 准备样品：将待分离的混合物用洗脱液稀释，调整蛋白质浓度至适当水平。
3. 加样：将样品加入凝胶柱中，待样品完全进入凝胶柱后，用洗脱液冲洗柱子，直至流出液为无色。
4. 收集洗脱液：用紫外分光光度计检测洗脱液中的蛋白质浓度，收集不同分子量范围的蛋白质组分。
5. 分析结果：将收集到的蛋白质组分进行SDS-PAGE电泳或Western blot分析，观察蛋白质的分子量和纯度。
实验三 凝胶层析法脱盐和分离蛋白质(0806)
实验三Sephadex G-25凝胶层析法脱盐和离子交换柱层析分离菠萝蛋白酶一、Sephadex G-25凝胶层析法脱盐（一）目的和要求掌握凝胶层析法的原理及操作技术。
（二）原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。
脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。
前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。
凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatography）、分子筛过滤（molecular sieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。
它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。
其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。
网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。
人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。
凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。
分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。
这样被分离物质即被按分子的大小分开。
葡聚糖凝胶柱使用及注意事项
葡聚糖凝胶柱使用及注意事项葡聚糖凝胶柱是一种常用的色谱柱，其主要由多糖聚合物构成，具有多孔结构以及极高的比表面积。
葡聚糖凝胶柱在生物分离、蛋白质纯化以及分析等方面有重要的应用。
下面将介绍葡聚糖凝胶柱的使用方法以及注意事项，并列举了几种常见溶剂的溶胀系数作为参考。
使用方法：1.预处理：新柱使用前需进行预处理。
首先，在使用前用适当的缓冲液再生柱子，一般推荐使用PBS缓冲液进行再生。
其次，用去离子水进行洗脱，去除缓冲液中的离子。
2.样品准备：准备好带有样品的溶液，可以是蛋白质溶液、核酸溶液或者其他需要分离的溶液。
3.进样：将样品溶液注入到柱子中，可以使用曲线尖管或者注射器进行。
4.溶剂流动：使用适当的流动缓冲液进行柱子的着色，常用的缓冲液有PBS缓冲液、甲醇和乙醇。
5.收集分离的组分：通过收集分离的组分，可以进行后续的实验操作或者分析。
注意事项：1.柱子的平衡：在使用柱子前，将柱子放入合适的缓冲液中，进行平衡处理，通常需要约30分钟。
2.柱子的保管：使用完毕后，需将柱子用适当的缓冲液保存，避免干燥。
3.柱子的温度：柱子的运行温度一般在室温下进行，避免过高温度的使用，以免影响柱子的性能。
4.溶液选择：在选择适当的缓冲液时，应根据样品的性质以及需求进行选择，不同的缓冲液对分离的效果会有影响。
5.柱子的清洗：使用完毕后的柱子需要进行彻底的清洗工作，尤其是对于经常使用的柱子，清洗工作要做得彻底。
下面是几种常见溶剂的溶胀系数参考值：1.水：溶胀系数为1，对于葡聚糖凝胶柱来说，水是适用的溶剂。
2.硫酸：溶胀系数为0.57，硫酸能够完全渗透葡聚糖凝胶柱。
3.乙醇：溶胀系数为0.44，适量的乙醇可以使用，但过高浓度的乙醇可能会影响柱子的性能。
4.甲醇：溶胀系数为0.65，甲醇也可以使用，但同样需要注意控制浓度。
总结：葡聚糖凝胶柱是一种常见的色谱柱，具有广泛的应用。
在使用葡聚糖凝胶柱时，需进行适当的处理以及注意事项，以保证柱子的性能和寿命。
葡聚糖凝胶层析法分离蛋白质、
1
有效分配系数Kav
已知 Kd=（Ve-Vo）/Vi，将Vt-Vo代替Vi， 则Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo） 即 Ve=Vo+Kav（Vt-Vo）
Kav与Kd对交联度小的凝胶差别较小，而对交联 度大的凝胶差别大。
在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当 流动相流过Vt体积后，所有的组分都应该被洗出 来，这一点为凝胶层析法的特点
层析柱的形状，一般直径 与高度的比为l：15为宜。
柱形必须根据层析介质和
分离目的而定。待分离物
质的性质相近，柱越细长， 则分离效果越好，但流速 较慢。在样品组分并不复 杂的情况下，采用“矮胖柱”. 要求:垂直 柱面平 无气泡 无节痕 松散 均匀
灌注凝胶时要求将均匀的凝胶一直加到所需柱 床高度，不能时断时续，否则将出现分层或 “纹路”等毛病。若在灌好胶后才发现“纹 路”、分层等现象时，要重新装柱，以免影响 层析效果。
（8）实验纪律：不迟到和缺席。实验室的卫生要轮流值日。
成绩评定
平时成绩：考勤 实验技能测试和实验报 告等 50～ 60%
期末理论考试： 50 ～ 40%
实验 葡聚糖凝胶层析法 分离蛋白质
张萍萍
一. 目的和要求
1. 掌握葡聚糖凝胶柱层析法的分离原 理及基本操作技术: 装柱 平衡 加样 洗脱收集等步骤.
分配系数 Kd =（Ve － Vo）/ Vi
Kd 可以有下列几种情况： (1)当Kd=O时，则Ve=Vo，即对于根本不能进入凝胶内部的大分子
物质(全排阻)，洗脱容积等于空隙容积(组分I)。 (2)当Kd=1时，Ve=Vo+Vi，即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗
脱容积应为空隙容积与内容积之和(组分Ⅲ)。 (3)当0<Kd>1时,Ve=Vo+KdVi,即表示组分不同大小可部分进入凝
实验三血清球蛋白的分离纯化及鉴定七年制
实验三血清γ球蛋白的分离纯化及鉴定七年制
9
盐析步骤
取离心管一支加入血清 2ml
加入2ml 0.9%氯化钠摇匀
边搅拌混匀边缓慢滴加饱和(NH4)2SO4 4ml
静置10min，再离心（5000转/分）10min
上清液（主要含清蛋白） 倾去
沉淀用1ml 0.9%氯化钠搅拌溶解
逐滴加饱和(NH4)2SO4 2ml,摇匀
26
操作
将脱盐后的球蛋白加于DEAE柱上（方法同 凝胶过滤），用0.0175 mol/l pH 6.3 NH4Ac 缓冲液洗脱，流速10滴～15滴/分，用小试管连 续收集流出液（约1.0 ml/管），用20%磺基水杨 酸溶液检查蛋白质分布情况，收集含量最高的部 分，浓缩作纯度鉴定。用该缓冲液洗脱下来的是 γ－球蛋白。
实验三血清γ球蛋白的分离纯化及鉴定七年制
21
⑤.层析后洗脱液检测
¡ 白色比色板,洗净备用。 ¡ 一块在各孔滴加奈氏试剂（检测NH4+）,另一
块滴加20%璜基水杨酸（检测蛋白质）。 ¡ 不用滴管,避免污染,直接倒… ¡ 用“-”表示无现象，用“+”, “++”,
“+++”等表示颜色深浅
⑥ 回收凝胶
实验三血清γ球蛋白的分离纯化及鉴定七年制
实验三血清γ球蛋白的分离纯化及鉴定七年制
17
（1）完全被排阻的极端大分子，Ve=Vo，Kd=0
（2）中等分子，Ve=Vo+Kd·Vi，0<Kd<1
（3）完全渗透的小分子，Ve=Vo+Vi， Kd=1
实验三血清γ球蛋白的分离纯化及鉴定七年制
18
操作步骤：
▲ Sephadex G-25的准备 ▲ 装柱（15~20cm）
实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质课件
实验三葡聚糖凝胶柱 层析纯化蛋白质课件
目录
• 实验原理 • 实验材料与设备 • 实验步骤 • 结果分析与讨论 • 注意事项与安全
01
实验原理
葡聚糖凝胶柱层析的原理
葡聚糖凝胶是一种具有三维网络结构的凝胶，具有良好的机 械强度和化学稳定性。它可以通过改变凝胶孔径的大小来分 离不同大小的分子。
当混合物溶液通过葡聚糖凝胶柱时，分子量较小的物质可以 进入凝胶孔内，而分子量较大的物质则被排阻在外。随着流 动相的流动，分子量小的物质逐渐被冲出凝胶柱，而分子量 大的物质则被滞留在凝胶柱内或缓慢流出。
结果的讨论与优化
结果讨论
根据实验结果，讨论凝胶柱层析纯化蛋白质的效果，分析可能影响分离效果和蛋 白质纯度的因素，如凝胶柱的填装、洗脱液的组成和洗脱速度等。
结果优化
根据结果讨论，提出优化实验条件的建议，如改变凝胶柱的填装方式、调整洗脱 液的组成或改变洗脱速度等，以提高蛋白质的分离效果和纯度。
05
注意事项与安全
分离度的计算
分离度是相邻两个峰之间的距离与峰宽的比值，可以通过测量洗脱液中 蛋白质的浓度变化来计算。
03
回收率的计算
回收率是纯化后蛋白质的质量与纯化前蛋白质的质量的比值，可以通过
称重法或紫外吸收法来测量。
蛋白质纯度的检测
检测方法：蛋白质纯度的检测方法包 括电泳法、质谱法、免疫学检测法和 光谱分析法等。电泳法是最常用的方 法之一，可以通过观察电泳图谱来判 断蛋白质的纯度。
电泳图谱的分析：电泳图谱中，单一 的、清晰的条带表明蛋白质纯度较高 ；而模糊的、多条带则表明蛋白质中 含有杂质。
纯度标准：蛋白质纯度标准通常由国 际蛋白质协会制定，分为一级、二级 和三级纯度标准。一级纯度标准要求 蛋白质中仅含有一种单体蛋白质，不 含有其他杂质；二级纯度标准要求蛋 白质中主要含有一种单体蛋白质，其 他杂质含量不得超过5%；三级纯度标 准要求蛋白质中主要含有一种单体蛋 白质，其他杂质含量不得超过10%。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
分级分离时（如多蛋白质组分样品的分离纯 化），应根据待分离样品中各组分的分子量 大小和分子量分布范围来确定型号。
可编辑ppt
6
2.3、凝胶层析法的原理：
凝胶层析是一种液相层析，机理是分子筛效应。 当洗脱开始以后，小分子可进入凝胶颗粒内部， 流程长，流动慢；大分子不能进入凝胶颗粒内 部，流程短，流动快。分子量大小不同的多种 成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排 队”，凝胶表现分子筛效应。
③0＜Kd<1,则Ve=Vo+Kd×Vi ，部分掺入；
④Kd>1，则Ve>Vo+Vi ，如某些芳香族化 合物（Phe,Tyr,Trp等），Sephadex G-25对它们 有吸附作用。
可编辑ppt
11
2.4、影响凝胶层析分离的因素：
2.4.1、样品的体积、粘度； 2.4.2、层析柱 ； 2.4.3、洗脱液流速的影响 ； 2.4.4、洗脱液离子强度、PH的影响。
实验二、葡聚糖凝胶柱层析
可编辑ppt
1
1、目的与要求：
1.1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理； 1.2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层 析的操作技术。
可编辑ppt
2
2、概述及原理：
凝胶 是一类不溶于水，在水中却有 较大膨胀度和较好的分子筛功能，具有 立体网状结构的物质（如葡聚糖、琼脂 糖、聚丙烯酰胺等）。
可编辑ppt
10
Kd是分配系数：用于衡量两个物质的分离分辩率， 是凝胶层析的一个特征常数，只与被分离物质 分子大小和凝胶孔径大小有关，与层析柱的长 短粗细无关。
Kd值的计算：Kd=(Ve-Vo)/Vi
几个特征Kd值意义：
①Kd=0,则Ve=Vo ，全排阻；
②Kd=1,则Ve=Vo+Vi , 全掺入；
可编辑ppt
12
2.4.1、样品的体积、粘度：
分析分离时，Vsample=1-4%Vbed； 制备分离时，Vsample=10-30Vbed. 相对粘度 样品液粘度与洗脱液粘度的比值。
分离效果只与相对粘度有关，一般来说， 相对粘度不得超过1.5―2。
今天的上样量（0.4ml）约为1%柱床体积。
可编辑ppt
可编辑ppt
17
2.6、凝胶的防腐、保存：
Sephadex、Sepharose等都是多糖类物质， 易于长菌，因此常在凝胶（不用时）中 加入抑菌剂，使用时再除去。
常用0.02％叠氮钠或20%乙醇溶液作防腐剂。 1 厘 米 光 程 时 ， 254nm 处 透 光 率 为 60 ％ ，
280nm处透光率为100％。
13
2.4.2、层析柱：
①柱长：组别分离时，20－30厘米； 分级分离时，可长至100厘米；
②柱径：柱长与柱径的比为5:1─10:1(脱 盐)，20:1─100:1 (纯化) 。
今天选用的是1cm ×30cm的层析柱。
可编辑ppt
14
2.4.3、洗脱液流速的影响：
洗脱液的流速与样品分离的分辨率相关。 流速过快，会使色谱峰变形， 流速过慢，样品扩散倾向加剧。 一般流速控制在30－200ml/h。
可编辑ppt
7
可编辑ppt
8
层析柱的重要参数 ：
Vt(total volume) Vo(outer volume) Vi(inner volume) Ve(elution volume) Vg(gel volume) Vt=Vo+Vi+Vg , Ve=Vo+Kd×Vi。
可编辑ppt
9
组分的洗脱体积（Ve）：①当样品的 体积很少时（与洗脱体积比较可以忽 略不计） ，在洗脱图中，从加样到峰 顶位置所用洗脱液体积为Ve。 ②当样 品体积与洗脱体积比较不能忽略时， 洗脱体积计算可以从样品体积的一半 到峰顶位置。③当样品体积很大时， 洗脱体积计算可以从应用样品开始到 洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。
可编辑ppt
4
交联葡聚糖凝胶 ：
是凝胶层析法中使用最广泛的一类层析 凝胶，商品名称：Sephadex。其基本骨 架是葡聚糖，它是由右旋葡萄糖残基通 过α－1，6糖苷键连接而成，葡聚糖分 子之间通过醚桥（甘油基）交联形成三 维空间网状结构
可编辑ppt
5
2.2、不同型号的葡聚糖凝胶 (Sephadex) 的选用原则：
今天洗脱流速控制在1ml/min。
可编辑ppt
15
2.4.4、洗脱液的离子强度和pH值的影响：
纯化蛋白时,通常选用离子强度＞0.02的盐 溶液作洗脱剂，以增加样品的溶解度和 消除凝胶的吸附作用；
酸性组分应选用偏碱性洗脱液； 碱性组分应选用偏酸性洗脱液。
可编辑ppt
16
2.5、凝胶层析法的应用：
1、生物分子的分离提纯； 2、测定高分子物质的分子量 ； 3、脱盐工具； 4、高分子溶液的浓缩 ； 5、用于去除热原物质 。
可编辑ppt
19
4、实验操作过程：
4.1、凝胶的溶胀 4.2、装柱； 4.3、上样； 4.4、洗脱和收集。
可编辑ppt
204.1、凝胶的Fra bibliotek胀：将称好的凝胶干粉投入烧杯中，加以适 量洗脱液，沸水浴溶胀2小时（也可室温 24小时）。
沸水浴溶胀的好处：省时，还可消毒， 驱除凝胶颗粒内部的气泡。
可编辑ppt
可编辑ppt
3
2.1、能用于层析的凝胶主 要有下面几种：
目前主要有葡聚糖凝胶（商品名为 Sephadex），天然琼脂糖凝胶（商品名 为Sapharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品 名为Bio-Gel），其后还发展了凝胶的各 种衍生物，如羧甲基-交联葡聚糖（CMSephadex），二乙基氨乙基-交联葡聚糖 （DEAE- Sephadex）等种类。
21
4.2、装柱：
①流程：
可编辑ppt
22
4.2、装柱：
②装柱：
干净的层析柱调整固定在垂直状态，柱内装放 适量洗脱液，排除下接头处滤膜下的空气泡， 关闭出口，柱内存留四分之一床体积的洗脱液， 加入搅拌均匀的凝胶浆液，打开出口，控制流 速，凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉隆到层 析柱底部，不断补充凝胶浆液至胶面上升至层 析柱上部，注意凝胶面上应始终保持有洗脱液。 调节流速1ml/min。床面上覆盖尼龙膜或滤纸 （对操作熟练者不需要而且不放更好）。
可编辑ppt
18
3、试剂、器材：
3.1、层析介质 Sephadex G-50； 3.2、样品（包含三个组分）： ①蓝色葡聚糖2000， ②溶菌酶，③ Trp
上样量：0.4ml/柱。 3.3、洗脱液：0.15M氯化钠，即生理盐 水。
3.4、层析系统：层析柱、恒流泵、部分 收集器、核酸蛋白检测仪、记录仪。