实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质
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层析柱的重要参数 ：
Vt(total volume) Vo(outer volume) Vi(inner volume) Ve(elution volume) Vg(gel volume) Vt=Vo+Vi+Vg , Ve=Vo+Kd×Vi。
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组分的洗脱体积（Ve）：①当样品的 体积很少时（与洗脱体积比较可以忽 略不计） ，在洗脱图中，从加样到峰 顶位置所用洗脱液体积为Ve。 ②当样 品体积与洗脱体积比较不能忽略时， 洗脱体积计算可以从样品体积的一半 到峰顶位置。③当样品体积很大时， 洗脱体积计算可以从应用样品开始到 洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。
今天洗脱流速控制在1ml/min。
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2.4.4、洗脱液的离子强度和pH值的影响：
纯化蛋白时,通常选用离子强度＞0.02的盐 溶液作洗脱剂，以增加样品的溶解度和 消除凝胶的吸附作用；
酸性组分应选用偏碱性洗脱液； 碱性组分应选用偏酸性洗脱液。
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2.5、凝胶层析法的应用：
1、生物分子的分离提纯； 2、测定高分子物质的分子量 ； 3、脱盐工具； 4、高分子溶液的浓缩 ； 5、用于去除热原物质 。
实验二、葡聚糖凝胶柱层析
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1、目的与要求：
1.1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理； 1.2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层 析的操作技术。
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2
2、概述及原理：
凝胶 是一类不溶于水，在水中却有 较大膨胀度和较好的分子筛功能，具有 立体网状结构的物质（如葡聚糖、琼脂 糖、聚丙烯酰胺等）。
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4.2、装柱：
①流程：
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4.2、装柱：
②装柱：
干净的层析柱调整固定在垂直状态，柱内装放 适量洗脱液，排除下接头处滤膜下的空气泡， 关闭出口，柱内存留四分之一床体积的洗脱液， 加入搅拌均匀的凝胶浆液，打开出口，控制流 速，凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉隆到层 析柱底部，不断补充凝胶浆液至胶面上升至层 析柱上部，注意凝胶面上应始终保持有洗脱液。 调节流速1ml/min。床面上覆盖尼龙膜或滤纸 （对操作熟练者不需要而且不放更好）。
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4、实验操作过程：
4.1、凝胶的溶胀 4.2、装柱； 4.3、上样； 4.4、洗脱和收集。
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4.1、凝胶的溶胀：
将称好的凝胶干粉投入烧杯中，加以适 量洗脱液，沸水浴溶胀2小时（也可室温 24小时）。
沸水浴溶胀的好处：省时，还可消毒， 驱除凝胶颗粒内部的气泡。
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2.4.1、样品的体积、粘度：
分析分离时，Vsample=1-4%Vbed； 制备分离时，Vsample=10-30Vbed. 相对粘度 样品液粘度与洗脱液粘度的比值。
分离效果只与相对粘度有关，一般来说， 相对粘度不得超过1.5―2。
今天的上样量（0.4ml）约为1%柱床体积。
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③0＜Kd<1,则Ve=Vo+Kd×Vi ，部分掺入；
④Kd>1，则Ve>Vo+Vi ，如某些芳香族化 合物（Phe,Tyr,Trp等），Sephadex G-25对它们 有吸附作用。
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2.4、影响凝胶层析分离的因素：
2.4.1、样品的体积、粘度； 2.4.2、层析柱 ； 2.4.3、洗脱液流速的影响 ； 2.4.4、洗脱液离子强度、PH的影响。
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2.4.2、层析柱：
①柱长：组别分离时，20－30厘米； 分级分离时，可长至100厘米；
②柱径：柱长与柱径的比为5:1─10:1(脱 盐)，20:1─100:1 (纯化) 。
今天选用的是1cm ×30cm的层析柱。
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2.4.3、洗脱液流速的影响：
洗脱液的流速与样品分离的分辨率相关。 流速过快，会使色谱峰变形， 流速过慢，样品扩散倾向加剧。 一般流速控制在30－200ml/h。
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Kd是分配系数：用于衡量两个物质的分离分辩率， 是凝胶层析的一个特征常数，只与被分离物质 分子大小和凝胶孔径大小有关，与层析柱的长 短粗细无关。
Kd值的计算：Kd=(Ve-Vo)/Vi
几个特征Kd值意义：
①Kd=0,则Ve=Vo ，全排阻；
②Kd=1,则Ve=Vo+Vi , 全掺入；
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4
交联葡聚糖凝胶 ：
是凝胶层析法中使用最广泛的一类层析 凝胶，商品名称：Sephadex。其基本骨 架是葡聚糖，它是由右旋葡萄糖残基通 过α－1，6糖苷键连接而成，葡聚糖分 子之间通过醚桥（甘油基）交联形成三 维空间网状结构
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2.2、不同型号的葡聚糖凝胶 (Sephadex) 的选用原则：
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2.1、能用于层析的凝胶主 要有下面几种：
目前主要有葡聚糖凝胶（商品名为 Sephadex），天然琼脂糖凝胶（商品名 为Sapharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品 名为Bio-Gel），其后还发展了凝胶的各 种衍生物，如羧甲基-交联葡聚糖（CMSephadex），二乙基氨乙基-交联葡聚糖 （DEAE- Sephadex）等种类。
组别分离时，Sephadex G－25最为常用。例如 样品中缓冲液的更换，蛋白质的脱盐 ；
分级分离时（如多蛋白质组分样品的分离纯 化），应根据待分离样品中各组分的分子量 大小和分子量分布范围来确定型号。
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2.3、凝胶层析法的原理：
凝胶层析是一种液相层析，机理是分子筛效应。 当洗脱开始以后，小分子可进入凝胶颗粒内部， 流程长，流动慢；大分子不能进入凝胶颗粒内 部，流程短，流动快。分子量大小不同的多种 成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排 队”，凝胶表现分子筛效应。
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2.6、凝胶的防腐、保存：
Sephadex、Sepharose等都是多糖类物质， 易于长菌，因此常在凝胶（不用时）中 加入抑菌剂，使用时再除去。
常用0.02％叠氮钠或20%乙醇溶液作防腐剂。 1 厘 米 光 程 时 ， 254nm 处 透 光 率 为 60 ％ ，
280nm处透光率为100％。
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3、试剂、器材：
3.1、层析介质 Sephadex G-50； 3.2、样品（包含三个组分）： ①蓝色葡聚糖2000， ②溶菌酶，③ Trp
上样量：0.4ml/柱。 3.3、洗脱液：0.15M氯化钠，即生理盐 水。
3.4、层析系统：层析柱、恒流泵、部分 收集器、核酸蛋白检测仪、记录仪。
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层析柱的重要参数 ：
Vt(total volume) Vo(outer volume) Vi(inner volume) Ve(elution volume) Vg(gel volume) Vt=Vo+Vi+Vg , Ve=Vo+Kd×Vi。
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组分的洗脱体积（Ve）：①当样品的 体积很少时（与洗脱体积比较可以忽 略不计） ，在洗脱图中，从加样到峰 顶位置所用洗脱液体积为Ve。 ②当样 品体积与洗脱体积比较不能忽略时， 洗脱体积计算可以从样品体积的一半 到峰顶位置。③当样品体积很大时， 洗脱体积计算可以从应用样品开始到 洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。
今天洗脱流速控制在1ml/min。
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2.4.4、洗脱液的离子强度和pH值的影响：
纯化蛋白时,通常选用离子强度＞0.02的盐 溶液作洗脱剂，以增加样品的溶解度和 消除凝胶的吸附作用；
酸性组分应选用偏碱性洗脱液； 碱性组分应选用偏酸性洗脱液。
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2.5、凝胶层析法的应用：
1、生物分子的分离提纯； 2、测定高分子物质的分子量 ； 3、脱盐工具； 4、高分子溶液的浓缩 ； 5、用于去除热原物质 。
实验二、葡聚糖凝胶柱层析
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1、目的与要求：
1.1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理； 1.2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层 析的操作技术。
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2
2、概述及原理：
凝胶 是一类不溶于水，在水中却有 较大膨胀度和较好的分子筛功能，具有 立体网状结构的物质（如葡聚糖、琼脂 糖、聚丙烯酰胺等）。
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4.2、装柱：
①流程：
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4.2、装柱：
②装柱：
干净的层析柱调整固定在垂直状态，柱内装放 适量洗脱液，排除下接头处滤膜下的空气泡， 关闭出口，柱内存留四分之一床体积的洗脱液， 加入搅拌均匀的凝胶浆液，打开出口，控制流 速，凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉隆到层 析柱底部，不断补充凝胶浆液至胶面上升至层 析柱上部，注意凝胶面上应始终保持有洗脱液。 调节流速1ml/min。床面上覆盖尼龙膜或滤纸 （对操作熟练者不需要而且不放更好）。
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4、实验操作过程：
4.1、凝胶的溶胀 4.2、装柱； 4.3、上样； 4.4、洗脱和收集。
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20
4.1、凝胶的溶胀：
将称好的凝胶干粉投入烧杯中，加以适 量洗脱液，沸水浴溶胀2小时（也可室温 24小时）。
沸水浴溶胀的好处：省时，还可消毒， 驱除凝胶颗粒内部的气泡。
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2.4.1、样品的体积、粘度：
分析分离时，Vsample=1-4%Vbed； 制备分离时，Vsample=10-30Vbed. 相对粘度 样品液粘度与洗脱液粘度的比值。
分离效果只与相对粘度有关，一般来说， 相对粘度不得超过1.5―2。
今天的上样量（0.4ml）约为1%柱床体积。
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③0＜Kd<1,则Ve=Vo+Kd×Vi ，部分掺入；
④Kd>1，则Ve>Vo+Vi ，如某些芳香族化 合物（Phe,Tyr,Trp等），Sephadex G-25对它们 有吸附作用。
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2.4、影响凝胶层析分离的因素：
2.4.1、样品的体积、粘度； 2.4.2、层析柱 ； 2.4.3、洗脱液流速的影响 ； 2.4.4、洗脱液离子强度、PH的影响。
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2.4.2、层析柱：
①柱长：组别分离时，20－30厘米； 分级分离时，可长至100厘米；
②柱径：柱长与柱径的比为5:1─10:1(脱 盐)，20:1─100:1 (纯化) 。
今天选用的是1cm ×30cm的层析柱。
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2.4.3、洗脱液流速的影响：
洗脱液的流速与样品分离的分辨率相关。 流速过快，会使色谱峰变形， 流速过慢，样品扩散倾向加剧。 一般流速控制在30－200ml/h。
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Kd是分配系数：用于衡量两个物质的分离分辩率， 是凝胶层析的一个特征常数，只与被分离物质 分子大小和凝胶孔径大小有关，与层析柱的长 短粗细无关。
Kd值的计算：Kd=(Ve-Vo)/Vi
几个特征Kd值意义：
①Kd=0,则Ve=Vo ，全排阻；
②Kd=1,则Ve=Vo+Vi , 全掺入；
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交联葡聚糖凝胶 ：
是凝胶层析法中使用最广泛的一类层析 凝胶，商品名称：Sephadex。其基本骨 架是葡聚糖，它是由右旋葡萄糖残基通 过α－1，6糖苷键连接而成，葡聚糖分 子之间通过醚桥（甘油基）交联形成三 维空间网状结构
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2.2、不同型号的葡聚糖凝胶 (Sephadex) 的选用原则：
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2.1、能用于层析的凝胶主 要有下面几种：
目前主要有葡聚糖凝胶（商品名为 Sephadex），天然琼脂糖凝胶（商品名 为Sapharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品 名为Bio-Gel），其后还发展了凝胶的各 种衍生物，如羧甲基-交联葡聚糖（CMSephadex），二乙基氨乙基-交联葡聚糖 （DEAE- Sephadex）等种类。
组别分离时，Sephadex G－25最为常用。例如 样品中缓冲液的更换，蛋白质的脱盐 ；
分级分离时（如多蛋白质组分样品的分离纯 化），应根据待分离样品中各组分的分子量 大小和分子量分布范围来确定型号。
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2.3、凝胶层析法的原理：
凝胶层析是一种液相层析，机理是分子筛效应。 当洗脱开始以后，小分子可进入凝胶颗粒内部， 流程长，流动慢；大分子不能进入凝胶颗粒内 部，流程短，流动快。分子量大小不同的多种 成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排 队”，凝胶表现分子筛效应。
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2.6、凝胶的防腐、保存：
Sephadex、Sepharose等都是多糖类物质， 易于长菌，因此常在凝胶（不用时）中 加入抑菌剂，使用时再除去。
常用0.02％叠氮钠或20%乙醇溶液作防腐剂。 1 厘 米 光 程 时 ， 254nm 处 透 光 率 为 60 ％ ，
280nm处透光率为100％。
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3、试剂、器材：
3.1、层析介质 Sephadex G-50； 3.2、样品（包含三个组分）： ①蓝色葡聚糖2000， ②溶菌酶，③ Trp
上样量：0.4ml/柱。 3.3、洗脱液：0.15M氯化钠，即生理盐 水。
3.4、层析系统：层析柱、恒流泵、部分 收集器、核酸蛋白检测仪、记录仪。