有机化学实验十柱色谱

实验十柱色谱

一．实验目的：

1. 学习柱色谱的原理及方法。

二．实验重点和难点：

1.学习柱色谱的原理及方法。

实验类型：基础性实验学时：4学时

三．实验装置和药品：

主要实验仪器：色谱柱(或25mL碱式滴定管) 25mL锥形瓶

普通漏斗玻璃棉或脱脂棉量筒试管电子天平烧杯

主要化学试剂：石油醚（600C—900C）丙酮中性氧化铝(100--200目) 500g

菠菜色素95%乙醇

四．实验装置图：

五．实验原理：

图 1 柱色谱装置柱色谱法是色谱方法之一。

色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。

(一)色谱法的基本原理：

是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能(即分配) 的不同，或其它亲

和作用的性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从

而将各组分分开。

(二)色谱法的分类：

1.根据组分在固定相中的作用原理不同，可分为吸附善谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻色谱等。

2.根据操作条件的不同，可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相

色谱等类型。

(三)柱色谱原理：

柱色谱是化合物在液相和固相之间的分配，属于固--液吸附层析。

图1就是一般柱色谱装置。柱内装有”活性”固体(固定相) 如氧化铝或硅胶等。液

体样品从柱顶加入流经吸附柱时，即被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入洗脱溶剂冲洗。由于固定相对各组分吸附能力不同，以不同速度沿柱下移，形成若干色带。再用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分随溶剂首先流出，分别收集各组分，再逐个鉴定。

1.吸附剂：常用的吸附剂有：氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。吸附剂一般

要经过纯化和活性处理。选择吸附剂的首要条件是与被吸附物及展开剂均无化学作用。吸

附能力与颗粒大小有关。颗粒太粗，流速快分离效果不好。颗粒小，表面积大，吸附能力

就高，但流速慢，因此应根据实际分离需要而定。色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性

三种。

2.溶质的结构与吸附能力的关系：化合物的吸附能力与分子极性有关。分子极性越强，

吸附能力越大。分子中所含极性较大的基团，其吸附能力也较强。具有下列极性基团的化合物，其吸附能力按下列排列次序递增：

CL－Br－I－〈>C=C〈－OCH3〈－CO2R〈>C=O 〈－CHO 〈－SH 〈－NH2 〈－OH 〈－COOH

氧化铝对各种化合物的吸附性按以下次序递减：

酸和碱〉醇、胺、硫醇〉酯、醛、酮〉芳香族化合物〉卤代物、醚〉烯〉饱和烃

3.溶剂：吸附剂的吸附能力与吸附剂和溶剂的性质有关。选择溶剂时还应考虑到被分离物各组分的极性和溶解度。

先将要分离的样品溶于一定体积的溶剂中，选用的溶剂极性应低，体积要小。如有的样品在极性低的溶剂中溶解度很小，则可加入少量极性较大的溶剂，使溶液体积不致太大。色层的展开首先使用极性较小的溶剂，使最容易脱附的组分分离。然后加入不同比例的极性溶剂配成的洗脱剂，将极性较大的化合物自色谱柱中洗脱下来。

常用的洗脱剂的极性按以下次序递增：

己烷和石油醚〈环已烷〈四氯化碳〈三氯乙烯〈二硫化碳〈甲苯〈苯〈二氯甲烷〈氯仿〈乙醚〈乙酸乙酯〈丙酮〈丙醇〈乙醇〈甲醇〈水〈吡啶〈乙酸

所用溶剂必须纯粹和干燥，否则会影响吸附剂的活性和分离效果。

4.装柱：吸附柱色谱的分离效果不仅依赖于吸附剂和洗脱溶剂的选择，而且与制成的色谱柱有关。

色谱柱的大小，视处理量而定。柱的长度于直径之比约为1：10---1：20，固定相用量与分离物质的量比约为1：50---100。先将玻璃管洗净干燥，柱底铺一层玻璃棉或脱脂棉，再铺上一层约0.5cm厚的海石砂然后将氧化铝装入管内，必须装填均匀，严格排除空气，吸附剂不能有裂缝，装填方法有湿法和干法两种：

（1）湿法：是将溶剂装入管内，再将氧化铝和溶剂调成浆状，慢慢倒入管中，将管子下端活塞打开，使溶剂流出，吸附剂渐渐下沉，加完氧化铝后，继续让溶剂流出，至氧化铝沉淀不变为止。

（2）干法：是在管的上端放一漏斗，将氧化铝均匀装入管内，轻敲玻璃管，使之填装均匀，然后加入溶剂，至氧化铝全部润湿，氧化铝的高度为管长的3/4。氧化铝顶部盖一层约0.5cm厚的砂子，敲打柱子，使氧化铝顶端和砂子上层保持水平。先用纯溶剂洗柱，再将要分离的物质加入，溶液流经柱后，流速保持1-2滴/s，可由柱下的活塞控制。最后用溶剂洗脱。整个过程都应有溶剂覆盖吸附剂。

六．实验內容及步骤：

1.取25ml酸式滴定管一支作色谱柱，垂直装置以25ml锥行瓶作洗脱液的接受器。

2.按图所示依次装入脱脂棉。

3.取少量石油醚于层析柱中，打开旋塞，检查其密闭性，确定不漏水后，再加入石油醚至层析柱高的2/3。

4.称取20g的中性氧化铝，从玻璃漏斗中缓缓加入到层析柱中，小心打开柱下旋钮，保持石油醚高度不变，并轻轻敲击（轻敲柱子将填料弄平，必要时可用吸气机将氧化铝填料吸实），流下的氧化铝在柱在柱子中堆积。

5.当溶剂液石油醚的高度距氧化铝表面5mm时，关闭旋塞，然后在层析柱上端加入少量脱脂棉（注：脱脂棉必须完全盖住氧化铝表面，在任何情况下，氧化铝表面不得露出液面）。

6.将上次实验菠菜色素的浓缩液滴入层析柱中（使用滴管），打开下端旋塞，让液面下

降到柱面以下1mm左右，关闭旋塞，用滴管加数滴石油醚安，打开旋塞，使液面下降，重复，直到色素全部进入柱体。控制流速

7.加入约15mL的9:1石油醚与丙酮混合液，打开旋塞，当第一个有色成分即将滴出时，取一试管收集，得橙黄溶液（ß-胡萝卜素）。控制流速

8.用同样的方法，用体积比7:3石油醚—丙酮作洗脱剂，分出第二个色带（浅黄液，叶黄素），再用95%乙醇洗脱得蓝色液（叶绿素a）和黄绿色液（叶绿素b）（叶绿素a,b两组份颜色差别小，可能导致色带模糊）。

9.实验完毕，洗净仪器，整理实验台。

10.当液面接近氧化铝填料时，将2.0 mL植物色素的浓缩提取液小心地加到色谱柱顶部。加完后，打开下端活塞，让液面下降到高于氧化铝填料1 mm左右，关闭活塞，加2 mL石油醚，打开活塞，使液面下降，经几次反复洗涤，使色素全部进入氧化铝柱体。待色素全部进入柱体后，在柱顶小心加入25 mL石油醚-丙酮（9:1）溶液，适当加压洗脱出第一个有色组分―橙黄色的β?胡萝卜素溶液。然后用约石油醚-丙酮（7:3）溶液洗脱出第二个黄色带―叶黄素溶液，和第三个色带―叶绿素a（蓝绿色）。最后用石油醚-丙酮（1:1）溶液洗脱叶绿素b（黄绿色）组分。收集各色带后，转入棕色瓶低温保存。七．实验注意事项：

1.色谱柱填装紧密与否，对分离效果很有影响。若柱中留有气泡或各部分松紧不匀(更不能有断层或暗沟)时，会影响渗滤速度和显色的均匀。但如果填装时过分敲击，又会因太紧密而流速太慢。

2.为了保持色谱柱的均一性，使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中是必要的。否则当柱中溶剂或溶液流干时，就会使柱身干裂，影响渗透和显色的均一性。

3.最好用移液管或滴管将分离的溶液转移至柱中。

4.如不装置滴液漏斗，也可用每次倒入10mL洗脱剂的方法进行洗脱。

5.中性氧化铝应在500℃烘干4 h，然后冷却至100℃，迅速装瓶，置于干燥器中待用。

6.分离后的单一色素提取液不宜长期存放，必要时应抽干充氮避光低温保存。

八．实验相关內容：

柱色谱

柱色谱法（column chromatography）

柱色谱法又称柱层析。固定相装于柱内，流动相为液体，样品沿竖直方向由上而下移动而达到分离的色谱法。柱色谱法被广泛应用于混合物的分离，包括对有机合成产物、天然提取物以及生物大分子的分离。

(一)液--固色谱原理：液-固色谱是基于吸附和溶解性质的分离技术，柱色谱属于液-固吸附色谱。

当混合物溶液加在固定相上，固体表面借各种分子间力（包括范德华力和氢键）作用于混合物中各组分，以不同的作用强度被吸附在固体表面。由于吸附剂对各组分的吸附能力不同，当流动相流过固体表面时，混合物各组分在液-固两相间分配。吸附牢固的组分在流动相分配少，吸附弱的组分在流动相分配多。流动相流过时各组分会以不同的速率向下移动，吸附弱的组分以较快的速率向下移动。随着流动相的移动，在新接触的固定相表面上又依这种吸附-溶解过程进行新的分配，新鲜流动相流过已趋平衡的固定相表面时也重复这一过程，结果是吸附弱的组分随着流动相移动在前面，吸附强的组分移动在后面，吸附特别强的组分甚至会不随流动相移动，各种化合物在色谱柱中形成带状分布，实现混合物的分离。

(二)柱色谱分离条件：