hBMP-2真核表达载体的构建及转染兔骨髓间充质干细胞的表达
慢病毒介导hBMP-2转染BMSCs复合脱钙松质骨修复兔股骨缺损的实验研究
•212«中国骨与关节损伤杂志2021年2月第36卷第2期Chin J Bone Joint Injury,Feb.2021,Vol.36.NO.2•临床论著•慢病毒介导hBMP-2转染BMSCs复合脱钙松质骨修复兔股骨缺损的实验研究陈佳滨打陈志达打肖莉莉食宋超-蔡役艺■,李强，，陶旋'1.解放军联勤保障部队第909医院（厦门大学附属东南医院）全军骨科中心，福建漳州363000；2.解放军联勤保障部队第909医院超声诊断科；3.桂林医学院创伤急救中心摘要：目的研究慢病毒介导人骨形态发生蛋白（Human bone morphogenetic protein,hBMP-2）转染骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSCs）植入脱钙松质骨后对兔股骨大段缺损的修复作用。
方法体外对兔BMSCs分离、培养、传代及表型鉴定后，采用慢病毒介导hBMP-2转染兔BMSCs,然后采用Western Blot法检测hBMP-2基因的表达情况。
兔股骨大段缺损模型制造成功后随机分为4组（n=6）,A组左侧股骨大段缺损区单纯行钢板螺钉内固定；B、C、D组左侧股骨大段缺损区行钢板螺钉内固定后分别植入脱钙松质骨.BMSCs复合脱钙松质骨、慢病毒介导hBMP-2转染BMSCs复合脱钙松质骨。
结果慢病毒介导hBMP2转染后的BMSCs细胞内hBMP-2基因能持续高效表达目的蛋白。
术后12周X线片显示，A、B、C组骨缺损修复未完成，D组左股骨缺损区骨痂开始塑形，骨缺损消失，髓腔再通，骨缺损修复完成：内固定取出后进行三维CT检查，A、B、C组左侧股骨缺损处再次发生骨折.D组并未再次发生骨折「结论慢病毒介导hBMP2转染后的兔BMSCs细胞内hBMP2目的基因能高效持续表达目的蛋白，能诱导兔BMSCs分化成骨从而促进兔股骨缺损的修复。
关键词：骨形态发生蛋白-2；慢病毒；骨髓间充质干细胞；兔股骨缺损；脱钙松质骨中图分类号:R-33文献标识码：B文章编号:1672-9935（2021）02-0212-03骨移植是目前治疗骨缺损的主要方法，包括自体骨移植和同种异体骨移植，自体骨移植来源有限且容易出现供区岀血、感染，同种异体骨来源较广但存在免疫排斥或感染等风险"7。
脂质体介导的hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的实验研究
１ １ 主要 仪 器 多 通 道 Ｐ Ｒ 扩增 仪 （ Ｅ公 司， ． Ｃ Ｐ 美 国） 低温高速 离心 机 （ 因公 司 ， 国 ） 凝 胶 电泳成 ， 基 美 ， 像分 析系统 （ Ｉ ＢＯ—Ｒ Ｄ公 司， 国 ） 电泳仪 （ Ａ 美 ， 北京六
一
１５ １ 实验分 组 ． ．
将 兔 Ｂ Ｃ 细胞株 分为转染 重组 ＭＳ ｓ
发 生 蛋 白 一２ ｈｍ ｎ ｂｎ ｏ ｈｇｎｔ ｒ ｅ （ ｕ ａ ｏｅｍ ｒ ａｅｅ ｃｐｏ ｉ ｐ ｉ ｔ ｎ一２ ，
除未贴壁的血细胞 ， ８ｄ传第 １ ， ７～ 代 传至第 ３代（ Ｐ）
细胞时应。
ｈ ＭＰ一 ） Ｂ ２ 基因导人到 Ｂ Ｓ ｓ ， Ｍ Ｃ 中 使其 持续稳 定表达 ， 并发挥 其诱 导 成骨 作用 仍 是亟 待解 决 的问题 。２ ０ ０８ 年 ９月至 ２ １ 年 ６月我们进行 了相关研究 ， 果报告 ０１ 结
５ ０ ６０ ７ ０ ８０ Ｉ ／ Ｌ８个梯 度 。观察 细胞 生长 状 ０ 、 、０ 、０ ｇｍ ０ ￣
况， 以第 ８～ ０天细胞全 部死 亡为 最佳筛 选浓 度。结 １ 果为以最低致死 浓度 ４ ０Ｉ ／ Ｌ作为下一步筛选转基 ０ ｇｍ ￣
因细胞株的浓度 。
１ ５ ｐ Ｄ Ａ３ １一ｈ ＭＰ一２转 染 兔 Ｂ Ｃ ． ｃ Ｎ ． Ｂ ＭＳ ｓ
子细胞 … ， 而骨形 态发 生蛋 白 一２被认 为是 骨形 态发
静脉注射麻醉 ， ２ Ｌ注射器带 １ 用 ０ｍ ８号穿刺针 头 自胫 骨上端穿刺抽取 骨髓 ， 抽取 ４— Ｌ 直接 用 Ｄ Ｅ 共 ６ｍ ， ＭＭ 培养基冲洗入培养瓶 中。４ — ２ｈ后首次换液 。以去 ８ ７
pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒的构建及其活性测定
pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒的构建及其活性测定詹玉林;白靖平;库热西·玉努斯;黄国虹【摘要】目的:构建pIRES2-绿色荧光蛋白(EGFP)-骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)真核表达质粒,并检测其表达活性.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人骨肉瘤组织中扩增出人骨形态发生蛋白2 (hBMP-2)的基因片段,构建成pIRES2-EGFP-BMP-2重组质粒,经酶切、测序检测其构建的正确性,通过转染3T3细胞后分别采用RT-PCR、免疫组化及Western免疫印迹(Western blotting, WB)法检测其转录、表达活性.结果:构建的pIRES2-EGFP-BMP-2质粒经酶切、测序、RT-PCR、免疫组化、EGFP表达鉴定、WB等检验表明质粒构建成功并具有转录活性.结论:本实验成功构建了具有表达活性的hBMP-2真核表达质粒,为进一步研究用BMP-2基因转染的方法来促进实验动物骨折的愈合奠定了基础.【期刊名称】《新疆医科大学学报》【年(卷),期】2008(031)005【总页数】4页(P524-527)【关键词】人类;pIRES2-EGFP;骨形成蛋白2;基因【作者】詹玉林;白靖平;库热西·玉努斯;黄国虹【作者单位】新疆医科大学第一附属医院骨科,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学附属肿瘤医院,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学基础医学院分子生物学教研室,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学基础医学院分子生物学教研室,新疆,乌鲁木齐,830011【正文语种】中文【中图分类】R34骨形成蛋白2(Bone morphogenic proteins 2, BMP-2)被认为是骨形成蛋白(BMPs)家族中诱导成骨作用最强且能单独诱导成骨的细胞因子。
pIRES2绿色荧光蛋白(EGFP)是来源于心肌炎病毒的载体，经改建后，在其中加入了可表达增强绿色荧光蛋白的基因，是一种高效、简便的真核表达载体。
腺病毒介导hBMP-2转染BMSCs复合DBM修复兔缺血性股骨头坏死的实验研究
Ｄ ｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｅ ｍ ｅ ｒ ｇ ｅ ｎ ｃ ｙ Ｔ ｒ ａ ｕ ｍ ａ ｔ ｉ ｃ Ｓ ｕ ｒ ｇ ｅ ｒ ｙ ， ｔ ｈ ｅ Ａ ｆ ｉｌ ｆ ａ ｔ ｅ ｄ Ｈ ｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ｆＧ ｏ ｕ ｉ ｌ ｉ ｎ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｇ ｕ ｉ ｌ ｉ ｎ ， Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ ｘ ｉ ５ ４ １ ０ ０ １ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ
显优于 Ｂ、 Ｃ组 。Ｌ ａ ｎ ｅ — Ｓ ａ ｎ ｄ ｈ ｕ Ｘ线评 分 Ａ组＜ Ｂ、 Ｃ组＜ Ｄ组 （ 尸＜０ ． ０ ５ ） ， Ｂ和 Ｃ组 差异无统计学意义 。大体观示 Ａ组
股骨头塌 陷 ， 钻 孔存在 ； Ｂ、 Ｃ组股骨 头未塌 陷 ， 钻孑 Ｌ 存在； Ｄ组股 骨头未塌 陷 ， 钻孑 Ｌ 消失 。Ｈ Ｅ染 色示 Ａ组骨小梁坏 死、 碎裂， 大量 空骨 陷窝 ； Ｂ、 Ｃ组可见成骨细胞及新生幼稚 骨小梁 ； Ｄ组 大量骨细胞 ， 新 生骨小梁与正常骨小梁无异 。 空骨 陷窝率 Ａ组＞ Ｂ、 Ｃ组＞ Ｄ组 （ Ｐ＜０ ． ０ ５ ） ， Ｂ和 ｃ组差异无统计学 意义。结论 够诱导 Ｂ ＭＳ Ｃ ｓ向成骨方 向分化 ， 对兔股骨头坏死具有较好的修复效果。
关键词 ： 股 骨头坏死 ； 疾病模 型， 动物 ； 腺病 毒 ； 骨形态发生蛋 白一 ２ ； 脱 钙松质骨基 ； 骨髓 间充质 干细胞 ； ｈ Ｂ ＭＰ 一 ２ ／
pEGFP_N1_BMP_2真核表达质粒的构建与鉴定
基金项目:高等学校博士点专项科研基金(编号:20060183050)3通讯作者文章编号:1007-4287(2009)12-1683-03pEGFP 2N1/BMP 22真核表达质粒的构建与鉴定张明磊,常 非,高忠礼,柳 扬,刘光耀3(吉林大学中日联谊医院骨科,吉林长春130033)摘要:目的 构建pEG FP 2N1/BMP 22真核表达质粒,并进行鉴定。
方法 利用RT 2PCR 方法从组织中提取骨形态发生蛋白(BMP 22)的基因片段,与pM D182T 载体连接,构建pM D182T/BMP 22重组质粒,酶切后与pEG FP 2N1真核表达载体连接,构建pEG FP 2N1/BMP 22真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。
结果 通过测序、酶切鉴定,证明pM D182T/BMP 22质粒构建成功。
结论 本实验成功构建了pEG FP 2N1/BMP 22真核表达质粒,为进一步研究利用BMP 22基因修饰骨组织工程骨种子细胞提供实验基础。
关键词:pEG FP 2N1;骨形成蛋白2;基因中图分类号:R34文献标识码:AConstruction and identification of euk aryotic expression vector pEGFP 2N 1/BMP 22 ZH ANG Ming 2lei ,CH ANG fei ,G AO Zhong 2li ,et al.(China 2Japan Union Hospital o f Jilin Univer sity ,Changchun 130033,China )Abstract :Objective T o construct a eukary otic expression vector carrying BMP 22gene.Methods BMP 22gene was cloned from tissue by using RT 2PCR method and was inserted into pM D182T to constrcuct pM D182T/BMP 22plasmid ,and to construct pEG FP 2N1/BMP 22plasmid by using restriction enzyme.T o identify the plasmid by sequencing and restriction enzyme.R esults The eukary otic expression vector pEG FP 2N1/BMP 22was constructed and identified.Conclusion T o construct the expression vector suc 2cess fully ,BMP 22gene was able to was for bone engineering.K ey w ords :pEG FP 2N1;BMP 22;gene(Chin J Lab Diagn ,2009,13:1683) 在新生骨组织的形成过程中,多种相关细胞因子参与其中并起到十分重要的作用,通过细胞因子的浓度发生改变,继而通过募集祖细胞,发挥调节细胞的增殖和分化等作用。
BMP2真核表达载体的构建
２ ０ 染 试 剂 盒 、 Ｍ Ｍ 培 养 基 购 自 Ｉｖｒｇｎ公 ００转 Ｄ Ｅ ｎｉｏｅ ｔ 司； 胎牛 血清 为北 京鼎 国生 物技 术公 司 出产 ； 蛋 白 胰 酶 购 自 Ｐｏ ａ 公 司 。 ｒ ｇ ｍ
１ ２ 方 法 ．
过基 因克 隆 的 方 法 可 以将 Ｂ ２基 因转 到细 胞 内 ， ＭＰ 并表 达 Ｂ ２ 长 因子 …。为 研究 其 对 骨 愈合 的促 ＭＰ 生 进作 用 ， 本研 究 构 建 Ｂ Ｐ Ｍ ２真 核 表 达 载 体 以研 究 其
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第４ 卷 第 ６ ｌ 期 ２０ ０７年 ｌ ２月
哈尔滨 医科大学学报
Ｊ ＯＵＲＮＡ ＯＦ ＨＡＲＢ Ｎ ＭＥ Ｃ Ｌ Ｉ ＤＩ ＡＬ ＵＭ ＶＥ Ⅱ’ ＲＳ Ｙ
Ｖ０ ． １ Ｎｏ． １４ ． ６
Ｄ ｃ ． ｅ ．姗
Ａ ｓ ａｔ Ｏｂｅｔ ｅ Ｔ ｌ ｅａｄｃｎｔ ｃ ｍ ｍｍ ｌ ｘｒｓｏ ｅｔ ｒ ｕ ｎｂｎ ｏ ｈｇｎ ｔ ｒ— ｂｔ ｃ： ｊｃ ｖ ｏｃ ｎ ｏｓ ｕｔ ａ ａ ｅｐｅｓ ｎｖｃ ｒｏ ｍａ ｏｅｍ ｒ ｏｅｅ ｃｐｏ ｒ ｉ ｏ ｎ ｒ ｉ ｏｆ ｈ ｐ ｉ ｔ ｎ２（ Ｍ ２ ， ｒｅ ｔ ｓ ｄ ｅｅｔｅ ｐ ｒ ｎ ｅ ｃ ｄ ｅｓ ． ｔｏ ｓ Ｐａｍ ｄｏＰ Ｍ ２ｗ ｓｄ— ｅ Ｂ Ｐ ） ｉ ｏｄｒ ｏ ｔ ｙｇｎ ｒ ｙｆ ｅｄｆ ｔ ｉ ａｅ Ｍｅ ｄ ｌ ｉ ｓ Ｂ Ｐ ａ ｉ ｉ ｎ ｕ ｈａ ｏｂ ｏ ｅ ｓ ｈ ｓ
PCV2真核表达载体的构建及其在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达
PCV2真核表达载体的构建及其在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus Type 2, PCV2）作为一种病毒感染引起的猪病，给养猪业造成了重大损失。
为了进一步探究PCV2的致病机制及开展疫苗研发，需要构建PCV2的真核表达载体，并在哺乳动物体内表达，以模拟自然感染状况。
一、PCV2真核表达载体的构建1.1 PCV2基因组的测序和分析起首对PCV2的基因组进行测序和分析，确定其中的开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）和调控序列。
通过该基因组信息，设计并合成了PCV2 Cap的全长基因。
Cap基因是编码PCV2的结构蛋白的基因，对病毒的感染和复制起着重要作用。
1.2 载体的选择与构建为了在哺乳动物细胞中表达PCV2的Cap基因，需要选择合适的真核表达载体。
依据需要，选择了pCDNA3.1(+)作为基本载体。
将合成的PCV2 Cap基因与pCDNA3.1(+)载体进行酶切后，接受毗连酶的作用将两者毗连起来，并通过转化大肠杆菌获得重组质粒。
通过测序确认质粒重组成功，得到了PCV2真核表达载体。
1.3 转染与表达：将PCV2真核表达载体转染到奶山羊胎儿成纤维细胞中，利用Western blot和实时荧光定量PCR检测Cap蛋白或Cap mRNA 的表达状况。
结果显示，Cap蛋白和Cap mRNA的表达量在转染24小时后逐渐增加。
二、奶山羊胎儿成纤维细胞中表达PCV2的意义2.1 模拟真实感染通过在奶山羊胎儿成纤维细胞中表达PCV2，可以模拟自然感染的过程，更好地理解PCV2对细胞的感染和复制机制。
2.2 探究PCV2致病性机制通过观察PCV2在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达状况，可以揭示PCV2感染的潜在机制，例如病毒如何进入细胞、如何复制等，为进一步阐明其致病性机制提供线索。
2.3 疫苗研发的依据奶山羊胎儿成纤维细胞中表达PCV2不仅可以探究病毒感染机制，也为疫苗研发提供了依据。
BMP-2转染兔骨髓间充质干细胞及其表达测定的开题报告
PEG/BMP-2转染兔骨髓间充质干细胞及其表达测定的开题报告一、研究背景及意义：骨髓间充质干细胞（BMSCs）作为一种重要的细胞来源，具有广泛的应用前景，包括修复骨组织缺损、治疗免疫性疾病和心血管病等。
近年来研究表明，BMSCs可通过基因转染进一步增强其在组织工程和再生医学中的应用。
其中，紫外激活的聚乙二醇（PEG）和骨形态发生蛋白2（BMP-2）是常用的基因载体。
PEG能够通过暴露于紫外线下后产生的极端亲疏水性改变，进而实现基因递送；BMP-2则可以促进BMSCs向成骨分化方向发展。
本研究旨在通过PEG/BMP-2转染兔BMSCs，并对转染效率及表达情况进行检测，为今后在骨组织再生修复方面提供一定的理论基础和实践经验。
二、研究内容和方法：1.构建基因转染体系。
将PEG和BMP-2克隆入质粒载体，并用文库筛选合适的转染载体。
经过体外菌落PCR、限制性内切酶酶切、测序等方法鉴定合格的质粒载体。
2.培养和鉴定BMSCs。
采集新鲜兔骨髓，将骨髓细胞分离培养至90%的汇聚度后进行CD29、CD44、CD90和CD45表面标记的流式细胞术检测，筛选并扩增BMSCs，存活性检测和细胞形态学观察。
3.基因载体转染。
将所筛选的质粒载体转染入BMSCs中，分别选用PEG及BMP-2载体分别转染，同时设置空白对照组和阴性对照组。
4.转染效率和表达测定。
利用聚合酶链式反应（PCR）、Western blot和免疫荧光技术等手段，对转染效率和表达情况进行检测。
三、预期研究结果：1.成功构建PEG/BMP-2转染体系。
2.成功分离出鉴定合格的BMSCs。
3.成功将PEG/BMP-2载体转染入BMSCs，有效提高BMSCs向成骨分化的能力。
4.成功检测转染效率和表达情况。
四、研究的价值与意义：本研究旨在探讨PEG/BMP-2基因转染方法对BMSCs向成骨分化方向的影响，对骨髓间充质干细胞的应用及组织修复和再生方面具有重要的理论和实践意义。
PEGBMP-2转染兔骨髓间充质干细胞及其表达测定的开题报告
PEGBMP-2转染兔骨髓间充质干细胞及其表达测定的开题报告一、研究背景与意义：骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是来源广泛、潜能多样、分化能力强的多潜能干细胞，在组织工程、干细胞治疗、再生医学等领域具有广泛的应用前景。
然而，近年来的研究表明，BMSCs在体内骨折修复等过程中的再生能力并不理想，从而限制了它在再生医学应用中的效果。
PEGBMP-2是一种重要的具有促进骨细胞分化和骨再生作用的生物分子，其对BMSCs骨分化能力具有重要的调节作用。
因此，利用基因转染技术，将PEGBMP-2基因转染到BMSCs中，可以有效提高BMSCs骨分化能力，从而改善其再生效应。
二、研究内容和方法：本研究拟使用基因转染技术，将PEGBMP-2基因转染到兔BMSCs中，通过检测细胞的骨分化指标来评估其骨分化能力的变化，并探究PEGBMP-2对BMSCs骨分化能力的调节机制。
具体研究方法如下：1、提取兔骨髓间充质干细胞。
2、构建PEGBMP-2载体，并进行质粒酶切及其它鉴定工作。
3、使用基因转染技术，将PEGBMP-2载体转染到BMSCs中。
4、通过RT-qPCR和Western blot技术检测PEGBMP-2基因在转染后的BMSCs中的表达情况。
5、检测转染后BMSCs细胞骨分化指标（碱性磷酸酶、骨特异性蛋白、骨钙素等）的变化。
6、对实验结果进行统计分析。
三、研究预期结果：通过基因转染技术实现PEGBMP-2基因的转染到BMSCs中，并检测到其在细胞中的表达，同时检测到PEGBMP-2转染后BMSCs的骨分化指标明显提高，表明PEGBMP-2能够调节BMSCs的骨分化能力，并为骨折修复等再生医学应用提供有效的方法和手段。
四、研究意义：本研究的意义在于，通过PEGBMP-2基因转染技术，提高BMSCs的骨分化能力，对于BMSCs在再生医学中的应用具有重要的意义。
hBMP-2基因转染对Hucb-MSC及软骨细胞影响的实验研究的开题报告
hBMP-2基因转染对Hucb-MSC及软骨细胞影响的实验研究的开题报告摘要：本研究旨在探究人脐带间充质干细胞（Hucb-MSC）和软骨细胞在转染hBMP-2基因后的变化及互作关系，为其在软骨组织工程中的应用提供实验依据。
首先，本研究将利用离体培养的Hucb-MSC和软骨细胞，通过质粒转染技术导入hBMP-2基因，并对其进行荧光显微镜观察，以确定转染效率。
随后，利用实时荧光定量PCR和Western Blot法检测hBMP-2基因的表达及蛋白质含量。
最后，通过细胞增殖、形态、细胞骨架等实验检测软骨细胞和Hucb-MSC在转染hBMP-2基因后的变化，探究两种细胞的增殖、分化及互作关系。
本研究将为软骨组织工程及干细胞研究提供新思路和实验证据。
关键词：人脐带间充质干细胞，软骨细胞，hBMP-2基因，转染，增殖，分化，互作。
Abstract: The aim of this study is to explore the changes and interaction between human umbilical cord mesenchymal stem cells (Hucb-MSC) and chondrocytes after transfection with hBMP-2 gene, providing experimental evidence for its application in cartilage tissueengineering. Firstly, the plasmid transfection technology will be used to introduce hBMP-2 gene into Hucb-MSC and chondrocytes, and its transfection efficiency will be determined through fluorescence microscopy observation. Then, real-time fluorescence quantitative PCR and Western Blot method will be used to detect the expression and protein content of hBMP-2 gene. Finally, the changes of chondrocytes and Hucb-MSC after transfection with hBMP-2 gene will be detected through cell proliferation, morphology, and cell skeleton experiments, exploring the proliferation, differentiation, and interaction between the two cells. This study will provide new ideas and experimental evidence for cartilage tissue engineering and stem cell research.Keywords: Human umbilical cord mesenchymal stem cells; chondrocytes; hBMP-2 gene; transfection; proliferation; differentiation; interaction.。
BMP-2重组质粒转染骨髓间充质干细胞及表达的检测
BMP-2重组质粒转染骨髓间充质干细胞及表达的检测张明磊;常非;高忠礼;柳扬;刘光耀【摘要】目的 pEGFP-N1/BMP-2真核表达质粒转染骨髓间充质干细胞,并检测其在靶细胞中的表达.方法脂质体将pEGFP-N1/BMP-2真核表达质粒转染入BMSCs,荧光显微镜下观察绿色荧光,计算转染率,利用ELLISA法检测目的基因在靶细胞中的表达,免疫组化染色检测成骨特异性生化指标(I型胶原、ALP及骨钙素).结果本实验成功的利用脂质体将质粒转染入BMSCs,目的基因可以持续高表达,并促进细胞向成骨方向分化.结论为进一步利用BMP-2基因修饰组强Ⅰ程骨促进成骨提供实验基础.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2010(014)011【总页数】3页(P1742-1744)【关键词】骨髓间充质干细胞;骨形态发生蛋白;转染【作者】张明磊;常非;高忠礼;柳扬;刘光耀【作者单位】吉林大学中日联谊医院,骨科,吉林,长春130021;吉林大学中日联谊医院,骨科,吉林,长春130021;吉林大学中日联谊医院,骨科,吉林,长春130021;吉林大学中日联谊医院,骨科,吉林,长春130021;吉林大学中日联谊医院,骨科,吉林,长春130021【正文语种】中文【中图分类】Q7骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为骨组织工程常用种子细胞之一,具有很强的成骨分化能力,在特定环境中可以被诱导分化为成骨细胞,促进骨修复过程。
但其成骨速度、成骨效率、修复骨缺损的效果并不令人满意[1]。
基因治疗及转基因技术的发展为解决这些问题提供了一条有效的道路,将编码细胞因子的基因导入BMSCs中,植入骨缺损部位,在局部持续产生细胞因子,以自分泌和旁分泌的方式诱导成骨。
本实验中将 BMP-2基因转染BMSCs,表达BMP-2,促进骨修复效应,为治疗临床上治疗骨缺损奠定良好的基础。
1 材料和方法1.1 材料 pEGFP-N1/BMP-2真核表达质粒(吉林大学中日联谊医院骨科构建),LIPofectamineTM脂质体转染试剂盒(Gibco公司),DMEM培养基(美国Gibco 公司),胎牛血清(美国Hyclone公司),SP免疫组化试剂盒、DAB(福州麦新生物技术有限公司),兔抗人BMP-2抗体(Santa Cruz)。
重组pcDNA3.1-hBMP-2转染兔脂肪干细胞体外诱导的成骨分化
重组pcDNA3.1-hBMP-2转染兔脂肪干细胞体外诱导的成骨分化安荣泽;赵豪;王兆杰;刘凡凡;齐新文;袁小洪;陈军平;赵俊延;胡小军;杨晋【摘要】BACKGROUND: Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) shows strong potential to induce osteogenesis of stem cells. OBJECTIVE: To construct an eukaryotic expression vector of human BMP-2 (hBMP-2) gene and then to investigate its effect in osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells (ADSCs). METHODS: hBMP-2 gene was obtained by screening human mixed cell cDNA library by plaque in situ hybridization and connected with the eukaryotic expression vector pcDNA3.1. The recombinant plasmid pcDNA3.1-hBMP-2 was identified by BamHⅠ/ EcoRⅠenzyme digestion and DNA sequencing. ADSCs were isolated from fat tissues at the back of a 3-month-old New Zealand white rabbit neck, then cultured and proliferated for further use. The hBMP-2 group (experimental group), EGFP group (negative control group) and non-transfected group (blank control group) were used. Mediated by Lipofectamine, 2000, hBMP-2 gene and EGFP gene were transfected with the 4th generation of ADSCs respectively. At 2 days after transfection, 400 μg/mL G418 was used for screening the transfected cells. At 48 hours after transfection, green fluorescent cells were counted for determining transient transfection efficiency under fluorescence microscope. Cell growth curves of each group were drawn by MTT colorimetry. The hBMP-2 content in cell supernatants of each group was quantitated by ELISA.CollagenⅠcontent was determined by immunocytochemical staining, alkaline phosphatase (ALP) activity in the cell supernatant was measured through the use of ALP activity detection kit, and the number of calcium nodules was calculated by alizarin red staining. RESULTS AND CONCLUSION: After BamHⅠ/ EcoRⅠdigestion and DNA sequencing, the recombinant plasmid was constructed successfully. The transfection of pcDNA3.1-hBMP-2 and pcDNA3.1-EGFP can be mediated by Lipofectamine, 2000. The transient transfection efficiency was (18.0 ±0.42) %. With the screening of 400 μg/mL G418, cells stably tra nsfected were harvested. The cell growth curve of each group was drawn by MTT colorimetry, indicating that there was no significant effect on the growth and proliferation of ADSCs with gene transfection mediated by Lipofectamine, 2000. The hBMP-2 levels in the cell supernatant quantified by ELISA showed that hBMP-2 expression was higher in the hBMP-2 group than in the EGFP group and non-transfected group at the corresponding period (between groups P < 0.05). The cells of hBMP-2 group provided a steady hBMP-2 expression (intra-group P > 0.05). ADSCs transfected by hBMP-2 gene showed greater collagenⅠ content and higher activity of ALP, more calcium nodules compared with the EGFP and non-transfected groups (P < 0.05). The recombinant plasmid pcDNA3.1-hBMP-2 was constructed successfully; the transfection of hBMP-2 gene into ADSCs can be mediated by Lipofectamine, 2000 successfully, and there is no significant effect on the growth and proliferation of the transfected cells. With the screening of G418, the stably transfected cells can be harvested.The hBMP-2 expression of ADSCs transfected by hBMP-2 gene is stable and efficient, and with the induction of hBMP-2, they self-expressed. ADSCs can carry on the differentiation into osteoblast cells.%背景:骨形态发生蛋白2 具有很强的诱导干细胞成骨活性.目的:构建人骨形态发生蛋白2 基因真核表达载体,探讨其转染脂肪干细胞后的成骨效果.rn方法:通过噬菌斑原位杂交筛选人混合细胞cDNA 文库获得人骨形态发生蛋白2基因,与真核表达载体pcDNA3.1-连接,构建重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2.利用脂质体LipofectamineTM2000分别介导人骨形态发生蛋白2基因、EGFP基因转染第4 代脂肪干细胞,并经G418 进行筛选.结果与结论:酶切鉴定及DNA 测序结果证实重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2 构建成功.经计算脂质体介导的脂肪干细胞瞬时转染率为(18.0±0.42)%,并经过G418 筛选后获得了稳定转染的细胞.细胞生长曲线表明转染后对脂肪干细胞生长、增殖无明显影响.ELISA 检测发现人骨形态发生蛋白2 组的人骨形态发生蛋白2 因子表达量均高于EGFP组及未转染组,且能够稳定表达.经人骨形态发生蛋白2 基因转染的脂肪干细胞的Ⅰ型胶原含量、碱性磷酸酶活性以及钙结节数目均比EGFP组及未转染组有明显升高.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2011(015)041【总页数】6页(P7601-7606)【关键词】骨形态发生蛋白2;脂肪源性干细胞;脂质体;转染;骨组织工程【作者】安荣泽;赵豪;王兆杰;刘凡凡;齐新文;袁小洪;陈军平;赵俊延;胡小军;杨晋【作者单位】遵义医学院第五附属(珠海)医院,广东省珠海市519100;遵义医学院第五附属(珠海)医院,广东省珠海市519100;遵义医学院第五附属(珠海)医院,广东省珠海市519100;遵义医学院第五附属(珠海)医院,广东省珠海市519100;遵义医学院第五附属(珠海)医院,广东省珠海市519100;遵义医学院第五附属(珠海)医院,广东省珠海市519100;遵义医学院第五附属(珠海)医院,广东省珠海市519100;遵义医学院第五附属(珠海)医院,广东省珠海市519100;遵义医学院第五附属(珠海)医院,广东省珠海市519100;遵义医学院第五附属(珠海)医院,广东省珠海市519100【正文语种】中文【中图分类】R3180 引言骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)由Urist等[1]于1965年在骨基质中发现，至今已有43种，除BMP-1外均属于转化生长因子β超家族的成员[2]。
人骨形态发生蛋白-2真核表达质粒的制备、转染及表达
人骨形态发生蛋白-2真核表达质粒的制备、转染及表达康春雨;章庆国【期刊名称】《现代医学》【年(卷),期】2005(33)5【摘要】目的制备含人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)基因的真核表达质粒,获得可稳定高效表达BMP-2的兔骨髓基质细胞,为进一步研究BMP-2在骨牵张区的成骨作用作准备。
方法制备携带有hBMP-2的全长真核表达质粒pcDNA3.1-BMP2。
通过脂质体法将所得到的重组真核质粒转染到兔骨髓基质细胞中,用G418进行梯度筛选,从而得到能够稳定表达hBMP-2的细胞克隆。
采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测骨髓基质细胞(MSCs)hBMP-2 mRNA的表达。
结果重组质粒通过EcoRI酶切后,电泳图示约1.5 kb的hBMP-2的目的片段及5.5 kb的载体片段,经测序显示核苷酸序列正确无误。
经RT-PCR检测hBMP-2在转录水平mRNA的表达情况,提示转染组hBMP-2的mRNA量较空白对照组明显增加。
结论成功制备了含hBMP-2基因的真核表达质粒,转染后获得了高效表达hBMP-2的兔骨髓基质细胞。
【总页数】4页(P302-305)【关键词】骨形态发生蛋白-2;真核表达质粒;骨髓基质细胞;基因转染【作者】康春雨;章庆国【作者单位】东南大学附属中大医院整形外科【正文语种】中文【中图分类】R782.2【相关文献】1.人遗传印记基因PEG10重组真核表达质粒的构建及其在转染细胞株中的表达[J], 张琼;谢娜;王晓燕;常莹;林园园;林菊生2.人重组真核表达质粒pIRES-骨形态发生蛋白-血管内皮生长因子165的体外转染对兔骨髓间充质干细胞成骨分化的影响 [J], 肖飞;焦竞;黄玉成;徐海军;左伟;王俊文3.人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒的构建及体外表达 [J], 孙立;田晓滨;张宇坤;郜勇;杨述华4.ADAM28真核表达质粒的构建及转染人牙囊细胞后的表达分析 [J], 赵征;黄征难;徐军明5.人端粒酶逆转录酶真核表达质粒转染人成纤维细胞的体外培养及生物学特性研究[J], 解慧琪;杨志明;屈艺;李秀群;秦廷武;赵金梅;刘军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
BMP-2表达载体的构建及其转录活性测定
BMP-2表达载体的构建及其转录活性测定邓少林;权毅;潘显明;屈波【期刊名称】《四川医学》【年(卷),期】2006(27)12【摘要】目的构建BMP-2表达载体及测定其转录活性.方法将骨形成蛋白(bone morphology protein-2,BMP-2)基因克隆入带HA标签的BMP-2表达载体中,得到带HA标签的重组质粒pGBKT7/HA-BMP-2,转染pGBKT7/HA-BMP-2重组质粒入酵母AH109、Y187细胞.结果 Western印迹检测表明表达了与预期分子量大小一致的BMP-2.结论 BMP-2表达载体的成功构建为我们深入研究BMP-2在促进骨痂生成过程中的分子机制及其生物学功能打下了坚实的基础.【总页数】3页(P1222-1224)【作者】邓少林;权毅;潘显明;屈波【作者单位】成都军区总医院骨科,四川,成都,610083;成都军区总医院骨科,四川,成都,610083;成都军区总医院骨科,四川,成都,610083;成都军区总医院骨科,四川,成都,610083【正文语种】中文【中图分类】R4【相关文献】1.乳腺癌雌激素受体β不同亚型表达载体的构建及其转录活性分析 [J], 关鑫;程龙;邹大阳;廉攀峰;王超;叶棋浓2.雌激素受体α真核表达载体的构建及其转录活性 [J], 李勤操;郑喜邦;丁丽华;王朝云;韦玮;周岩;张浩;叶棋浓3.雌激素受体β真核表达载体的构建及其转录活性 [J], 李勤操;何宝祥;杨智洪;丁丽华;李杰萍;张浩;袁斌;叶棋浓4.骨形成蛋白-2表达载体的构建及其转录活性测定 [J], 邓少林;郭强;黄昭明5.雌激素受体β表达载体的构建及其转录活性测定 [J], 谢向阳;叶棋浓;刘亚玲;朱建华;丁丽华;文春根;黄翠芬因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒表达载体转染兔骨髓间充质干细胞
人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒表达载体转染兔骨髓间充质干细胞何春耒;姬广林;刘午阳;吴东宝;何澄;王茂源;叶勇军;莫建文;高辉【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2012(016)010【摘要】背景:采用GatewayTM 技术构建腺病毒载体,显著弥补了外源性细胞因子局部应用的缺陷.目的:观察人骨形态发生蛋白2 重组腺病毒表达载体(Ad-BMP-2/GFP) 转染兔骨髓间充质干细胞后骨形态发生蛋白2 的表达情况.方法:密度梯度离心联合贴壁培养法,分离、培养、纯化兔骨髓间充质干细胞;GatewayTM 技术构建的Ad-BMP-2/GFP 腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞.结果与结论:RT-PCR 检测转染诱导后的细胞表达成骨细胞特异性产物骨钙素;转染后兔骨髓间充质干细胞在mRNA 水平和蛋白水平均有人骨形态发生蛋白2 的表达.结果表明构建的Ad-BMP-2/GFP 可高效转染兔骨髓间充质干细胞,骨形态发生蛋白2 在细胞中能高效表达.%BACKGROUND: The adenovirus vector structured by GatewayTM has made up the deficiencies of exogenous cytokine application. OBJECTIVE: To observe the target gene expression and osteoblastic differentiation of human bone morphogenetic protein-2 (hBMP-2) recombinant adenovirus expression vector (Ad-BMP-2/GFP) after transfected with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (rBMSCs). METHODS: To isolate and culture, purify rBMSCs through the density gradient centrifugation combined with adherent cultivation; the Ad-BMP-2/GFP adenovirus vector constructed by GatewayTM technology wastransfected with rBMSCs. RESULTS AND CONCLUSION: Osteocalcin was the osteoblast-specific product which could be expressed on the transfected rBMSCs detected by RT-PCR method; hBMP-2 gene was positive at mRNA and protein levels. Rabbit bone marrow stromal cells were successfully separated and purified. Ad-BMP-2 can efficient ly transfect rBMSCs and the BMP-2 can be expressed in BMSCs efficiently.【总页数】5页(P1817-1821)【作者】何春耒;姬广林;刘午阳;吴东宝;何澄;王茂源;叶勇军;莫建文;高辉【作者单位】赣南医学院第一附属医院骨科,江西省赣州市341000;赣南医学院第一附属医院骨科,江西省赣州市341000;赣南医学院第一附属医院骨科,江西省赣州市341000;赣南医学院第一附属医院骨科,江西省赣州市341000;赣南医学院第一附属医院骨科,江西省赣州市341000;赣南医学院第一附属医院骨科,江西省赣州市341000;赣南医学院第一附属医院骨科,江西省赣州市341000;赣南医学院第一附属医院骨科,江西省赣州市341000;赣南医学院第一附属医院骨科,江西省赣州市341000【正文语种】中文【中图分类】R394.2【相关文献】1.基因重组腺病毒载体与慢病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的对比 [J], 李诗鹏;李强;石正松;蔡伟良;宁寅宽;陶旋;2.基因重组腺病毒载体与慢病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的对比 [J], 李诗鹏;李强;石正松;蔡伟良;宁寅宽;陶旋3.腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞 [J], 尹承慧;邱俊钦;曾昭勋;陈宗雄;4.腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞*☆ [J], 尹承慧;邱俊钦;曾昭勋;陈宗雄5.人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒表达载体转染兔骨髓间充质干细胞 [J], 何春耒;姬广林;刘午阳;吴东宝;何澄;王茂源;叶勇军;莫建文;高辉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞
pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞詹玉林;库热西·玉努斯;黄国虹;白靖平【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2008(012)047【摘要】背景:骨形成蛋白2是骨基质中最重要骨生长因子,主要生物学作用是促进未分化的间充质细胞和骨系细胞的募集和分化,是骨生成的启动因子,可以作为骨修复基因治疗的理想目的基因.目的:使用前期已经构建成功的pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞.设计、时间及地点:细胞学观察实验,于2007-12/2008-06在新疆医科大学自治区地方病分子牛物学实验室完成.材料:良种新两兰大白兔由新疆医科大学动物试验中心提供,pIRES2.EGFP.BMP-2由奉校分子生物学实验室构建、保存.方法:采用贴壁法及密度梯度离心法提取骨髓间充质干细胞.采用脂质体介导转染法将pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞.主要观察指标:通过荧光显微镜、反转录聚合酶链式反应、免疫组织化学及Western免疫印迹检测其转录、表达活性.结果:转染的兔骨髓间充质干细胞细胞可见绿色荧光蛋白的持续表达,绿色荧光蛋白分布于整个细胞.呈胞浆分布,说明重组载体构建成功并能在体细胞中表达.转染pIRES2-EGFP-BMP-2的兔骨髓间充质干细胞经G418抗性筛选并传代、培养4周后,RT-PCR反应可扩增出112 kb条带,大小与预期相符合.Western免疫印迹检测显示,经pIRES2-EGFP-BMP-2转染的兔骨髓间充质干细胞经在相对分子质量为30×103处显现单一特异性条带,表明为骨形成蛋白2基因表达产物.免疫组织化学显示,转染pIRES2-EGFP-BMP-2后经G418抗性筛选并传代、培养4周后的兔骨髓间充质干细胞细胞质中有棕黄色颗粒阳性信号.结论:用pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒成功转染兔骨髓间充质干细胞并获得表达.【总页数】5页(P9226-9230)【作者】詹玉林;库热西·玉努斯;黄国虹;白靖平【作者单位】新疆医科大擘第一附属医院骨科,新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市,830054;新疆医科大学基础医学院分子生物学教研室,新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市,830011;新疆医科大学基础医学院分子生物学教研室,新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市,830011;新疆医科大学附属肿瘤医院,新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市,830011【正文语种】中文【中图分类】R394.2【相关文献】1.pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒的构建及其活性测定 [J], 詹玉林;白靖平;库热西·玉努斯;黄国虹2.SOX-9真核表达质粒转染兔骨髓基质细胞 [J], 徐忠世;肖德明;林博文;卢小虎;李冉3.VEGF165基因转染兔骨髓间充质干细胞治疗兔激素性股骨头坏死的实验研究 [J], 白志刚;巩凡;马军;孙玺淳;杨绿林;尚小可;李立新;黄朋4.SOX-9真核表达质粒转染兔骨髓基质细胞的可行性 [J], 徐忠世;肖德明;林博文;卢小虎;李冉5.重组真核表达质粒pEGFP/hVEGF_(165)转染兔成骨细胞条件的优化 [J], 陈国武;孟纯阳;蒋电明;胡侦明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
hBMP-2基因转染骨髓基质细胞及效果检测
hBMP-2基因转染骨髓基质细胞及效果检测郑德宇;秦书俭;郑国顺;姚素艳【期刊名称】《解剖科学进展》【年(卷),期】2004(10)2【摘要】目的通过观察转染hBMP 2基因在骨髓基质细胞生物学性状变化和检测hBMP 2基因在受体细胞中表达水平 ,探讨骨髓基质细胞作为hBMP 2基因受体细胞的可行性。
方法应用脂质体介导的方法将携带hBMP 2基因的重组载体PcDNA3 hBMP2导入体外培养的骨髓基质细胞中 ,用G4 18筛选获得阳性细胞 ,分别应用PCR技术、原位杂交技术和ELISA检测目的基因DNA、mRNA和蛋白质的存在与表达状况 ,并绘制细胞的生长曲线。
结果PCR方法显示实验组可见约36 0bp的基因条带 ,原位杂交方法显示实验组约有 15～ 2 0 %的阳性细胞 ,ELISA 方法显示培养第 1～ 4天时hBMP 2的含量为37ng/3× 10 5细胞 ,培养第 11～14天和第 2 5～ 2 8天均约5 4ng/3× 10 5细胞。
转染后阳性细胞的倍增时间和生长时间没有因为目的基因的导入而改变 ,与正常培养的细胞相比差异不显著。
结论骨髓基质细胞可以作为hBMP 2基因的受体细胞 ,基因表达可分泌hBMP 2蛋白质 ,可作为骨组织工程学中的种子细胞。
【总页数】5页(P136-139)【关键词】hBMP-2;基因转染;骨髓基质细胞;检测;种子细胞;骨缺损【作者】郑德宇;秦书俭;郑国顺;姚素艳【作者单位】锦州医学院解剖学教研室;锦州医学院卫生所;锦州医学院药理学教研室【正文语种】中文【中图分类】R318【相关文献】1.脂质体介导的hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的实验研究 [J], 黄旋平;周诺;杨媛媛;江献芳;李华;谢庆条2.hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞体内移植后hBMP-2的活性检测 [J], 石正松;李强;宁寅宽;蔡伟良;李诗鹏3.hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的表达及生物学效应的观察 [J], 胡运生;范清宇;马保安;裘秀春;潘勇4.hBMP-2转染自体兔骨髓基质细胞附和异体兔脱钙骨基质的成骨实验研究 [J], 李军;范清宇;俞兰;范德刚;文艳华5.转染hBMP-2基因的骨髓基质细胞与生物活性陶瓷复合材料异位成骨能力观察[J], 郑德宇;姚素艳;刘学;张玉华;秦书俭因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
可诱导表达 hBMP-2 的慢病毒载体构建及其在人脐血间充质干细胞中的表达
可诱导表达hBMP-2的慢病毒载体构建及其在人脐血间充质干细胞中的表达周明1石新艳2田少奇1王丽3张积华4孙康1邢士超5孙伟雪1黄洪杰1吴丹6【摘 要】 目的构建可诱导表达hBMP-2的慢病毒载体，并研究hBMP-2在人脐血间充质干细胞（human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，HUMSCs）中的可诱导性表达。
方法以pcDNA-hBMP-2为模板，通过PCR反应获取hBMP-2，运用GATEWAY技术构建pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2、pLV/EXPN2-Puro-EF1A-反向反式激活因子（reverse transactivator，rtTA），通过PCR鉴定重组慢病毒载体构建。
将重组慢病毒与辅助质粒共同转染293FT细胞，包装成能表达hBMP-2的可控性慢病毒，并测定病毒滴度。
用病毒转染HUMSCs，使用强力霉素进行诱导，分别在相同诱导时间（48 h）不同诱导浓度（0、10、100 ng/mL，1、10、100 μg/mL）及不同诱导时间（12、24、48、72 h）相同诱导浓度（10 μg/mL）两种情况下用ELISA法测定hBMP-2的表达情况。
对转染前后的HUMSCs 进行成骨诱导，用茜素红染色法观察矿化物结节形成情况。
结果成功构建了携带hBMP-2的可控性慢病毒载体pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2、pLV/ EXPN2-Puro-EF1A-rtTA，并获得相应的病毒，病毒滴度分别为3.5 × 108 TU/mL和9.5 × 107 TU/mL；病毒转染HUMSCs后，HUMSCs可通过强力霉素的诱导可控性表达hBMP-2。
在相同诱导时间情况下，强力霉素10 μg/mL时诱导表达最强；而在相同诱导浓度下，hBMP-2的表达在诱导48 h达峰值。
HUMSCs成骨诱导培养2周后，茜素红染色示胞浆中有大量红色的钙化基质沉积。
克隆并构建人骨形成蛋白2真核表达载体
克隆并构建人骨形成蛋白2真核表达载体田晓滨;孙立;杨述华【期刊名称】《中国修复重建外科杂志》【年(卷),期】2006(20)2【摘要】目的探讨构建人骨形成蛋白2(humanbonemorphgeneticprotein2,hBMP-2)真核表达载体的方法。
方法由人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA,利用RT-PCR方法扩增获得hBMP-2基因cDNA,将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM-T-hBMP-2重组质粒载体,转化到大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。
分别用EcoR和Not双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3.1(+)真核表达载体,将克隆载体中hBMP基因重组到pcDNA3.1(+)真核表达载体,提取质粒作酶切电泳、PCR鉴定及DNA测序。
结果人骨肉瘤细胞中经RT-PCR得到1.2kbp的hBMP-2扩增条带,重组质粒pGEM-T-hBMP-2经酶切电泳可见1.2kbp的hBMP-2条带和4.0kbp的载体片断;pcDNA3.1-hBMP-2质粒经酶切电泳可见1.2kbp的hBMP-2条带和5.0kbp的载体片断,重组质粒酶谱分析与预期一致;DNA序列分析测序结果校对后经BLAST分析,表明核酸序列与GeneBank 中和hBMP-2的mRNA序列完全吻合。
结论通过此方法能成功克隆获得hBMP-2基因,并构建其真核表达载体。
【总页数】4页(P112-115)【关键词】骨形成蛋白2;真核表达载体;基因克隆【作者】田晓滨;孙立;杨述华【作者单位】贵州省人民医院骨科;华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科【正文语种】中文【中图分类】R318;Q813.6【相关文献】1.人骨形成蛋白2基因克隆及真核表达载体的构建 [J], 郭勇;张西正;李娜;赵红斌;曾强成2.人骨形成蛋白2和人骨形成蛋白7成熟肽编码区基因克隆和真核表达载体的构建[J], 吉建新;廖伟娇;刘利东;卢春生;朱伯平;范婷婷3.人骨形成蛋白7荧光真核表达载体的构建及体外生物学活性检测 [J], 杨雪超;樊明文4.构建含双顺反子绿色荧光蛋白标记人骨诱导形成蛋白2真核表达载体 [J], 苗军;刘春蓉;黄鸿超;夏群;石可松;崔国盛5.人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达 [J], 孙立;田晓滨;杨述华;胡如印;汪雷;陆延盛;张字坤;傅德皓因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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（ 西 医科 大 学 附 属 口腔 医 院 口腔 颌 面 外 科 广
摘 要 目的 ： 建 ｐＤ 构 ｃ ＮＡ３ １ｈ ＭＰ 真 核 表 达 质 粒 并 检 测 其 在 兔 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 （ ＭＳ ｓ 中 的表 达 。方 法 ： 用 逆 转 录 聚 ． 一Ｂ ２ Ｂ Ｃ） 采 合 酶链 式 反 应 （ Ｔ Ｐ Ｒ 技 术 ， 人 骨 肉 瘤 中 扩 增 出 人 骨 形 成 蛋 白一 （ Ｂ ２ 基 因 片 段 ， 建 成 ｐＤ Ｒ —Ｃ ） 从 ２ ｈ ＭＰ ） 构 ｃ ＮＡ３ １ Ｂ ２重 组 质 ． 一ｈ ＭＰ 粒 。转 染 兔 骨 髓 问 充 质 干 细 胞 并 通 过 Ｒ — Ｃ 和 免 疫 组 化 检 测 其 表 达 。 结 果 ： 实 验 构 建 的 重 组 质 粒 目 的 基 因 片 段 为 ＴＰ Ｒ 本 ｈ ＭＰ 一Ｄ Ｂ ２ｃ ＮＡ。经 ＲＴ Ｐ Ｒ 和免 疫 组 化 证 实 ， 染 ｐ Ｄ ３ １ｈ ＭＰ —Ｃ 转 ｃ ＮＡ ．－ Ｂ ２后 的兔 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 内 有 大 量 ｈ ＭＰ Ｎ 的 Ｂ ２ｍＲ Ａ 转 录 和蛋 白 的表 达 。结 论 ： 实 验 成 功 构 建 ｈ ＭＰ 本 Ｂ ２真 核 表 达 质 粒 并 在 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 中 得 到 表 达 ， 为进 一 步研 究 用 Ｂ ２ ＭＰ
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基 因转 染 的 方 法 来 加 速 牵 张 成 骨新 骨 形成 奠 定 了基 础 。
关键词
人 骨 形 成 蛋 白～ ； ２ 骨髓 间充 质 干细 胞 ； 染 ； 达 转 表 Ｒ７２ ８
中国 图 书 资 料 分 类 法 分 类 号
Ｃｏ ＮＳ ＴＲＵＣＴＩ Ｎ ｏ ｏＦ ＨＵ Ｍ ＡＮ ＢＭ Ｐ一 ２ ＥＵＫ ＡＲＹｏＴＩ ＥＸＰＲＥＳ Ｉ Ｃ Ｓ ＯＮ ＶＥＣＴＯＲ ＡＮＤ ＥＸ— Ｉ Ｉ ＰＲＥＳ Ｉ Ｓ ＯＮ ＡＦＴＥＲ ＴＲＡＮＳ ＦＥＣＴＩ ｏＮ Ｆ Ｒ ＡＢＢＩ ’ ＮＥ ＥＳ ｏ Ｔ Ｓ Ｂｏ Ｍ ＥＮ ＣＨ ＹＭ ＡＬ ＴＥＭ Ｓ ＣＥＬＬＳ
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