GFP 基因转染对骨髓基质细胞体内向软骨细胞分化的示踪作用
细胞示踪技术与应用(GFP)
降低成本与普及推广
降低成本
通过规模化生产和优化生产过程，降低绿色荧光蛋白的 生产成本，使其更容易被广大科研人员所接受和使用。
普及推广
加强绿色荧光蛋白技术的宣传和培训，提高科研人员对 其的认识和应用能力，促进其在生物学、医学和生物工 程领域更广泛的应用和推广。
07 结论
GFP技术在细胞示踪中的优势与局限性
细胞示踪技术与应用（GFP）
目录
• 引言 • 细胞示踪技术概述 • GFP技术原理与特性 • GFP技术在生物学研究中的应用 • GFP技术在医学研究中的应用 • GFP技术的挑战与未来发展 • 结论
01 引言
目的和背景
细胞示踪技术是一种用于追踪和观察 细胞生长、分裂、迁移等行为的方法 ，对于研究细胞生物学和疾病机制具 有重要意义。
发光机制
在蓝色光激发下，GFP分子中的生色团（由6个疏水性的色氨酸残基组成）吸收 能量后，从基态跃迁至激发态，随后通过能量传递回到基态，释放出绿色荧光。
GFP的荧光特性与稳定性
荧光特性
GFP发出的荧光呈鲜艳的绿色，且不受其他荧光物质干扰， 易于与其他荧光标记物区分。
稳定性
在大多数细胞内环境中，GFP荧光相当稳定，不易淬灭，可 长时间保持亮度。
1994年
该实验室的另一位科学家发现，通过将GFP与其他蛋白质 结合，可以实现对特定蛋白质的荧光标记，从而开启了细 胞示踪技术的新篇章。
2000年以后
随着其对细胞生长、分裂等行为的影响，进一步加深 了对细胞生物学和疾病机制的理解。
02 细胞示踪技术概述
用于追踪药物在体内的分 布、代谢和排泄过程，评 估药物的疗效和安全性。
用于研究干细胞分化和再 生过程，为组织工程和再 生医学提供技术支持。
EGFP基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究
EGFP基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究郑立恒魏会平许松梅何波杨明理王黎明刘全胜【摘要】目的: 探讨外源性EGFP基因转染修饰兔骨髓间充质干细胞(m esenchymal stem cells, MSCs)的可行性。
方式: 用增强型荧光绿色蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP)作为报告基因，以脂质体法转染骨髓间充质干细胞，观看转染结果、表达情形及对靶细胞活力的阻碍。
结果: 经荧光显微镜下观看证明：成功地对骨髓间充质干细胞实现了基因转染。
结论: 兔骨髓间充质干细胞能够在体外适宜的条件下进行长期培育; 骨髓间充质干细胞可直接作为基因靶细胞, 成立稳固表达EGFP 的骨髓间充质干细胞系具有可行性,为进一步做标记的MSCs细胞的移植研究奠定基础。
【关键词】增强型绿色荧光蛋白（EGFP）；转染；骨髓间充质干细胞（MSCs）【ABSTRACT】Objective: To study the feasibility of exogenous gene transfecting into bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs). Methods: MSCs were cultured and treated with pEGFPC1 with the help of lipofectamine. The transgene results were confirmed by fluoroscopy and the cell viability after transfection was evaluated by light microscopy and electronmicroscopy. Results: Bone marrow MSCs were successfully transfected with pEGFPC1 gene. Conclusion: The MSCs originated from rat bone can be cultured in vitro under appropriate conditions, and they can be directly used as gene target cells. Moreover, it is feasible to construct the MSCs expressing EGFP stably, which can be further applied to label target cells in the transplantation study.【KEY WORDS】 Enhanced green fluorescent protein(EGFP); Transfection; Mesenchymal stem cells(MSCs)间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）由于具有自我更新，多向分化的潜能，且容易获取和体外扩增培育，成为最近几年来干细胞研究的热点。
GFP融合蛋白技术对细胞内定位及功能阐释作用
GFP融合蛋白技术对细胞内定位及功能阐释作用细胞是生物体的基本组成单位，了解细胞内蛋白的定位及功能对于理解生物体的生理过程和发病机制至关重要。
为了揭示蛋白的定位和功能，科学家们开发了GFP融合蛋白技术。
GFP融合蛋白技术能够将绿色荧光蛋白（GFP）与目标蛋白融合，在细胞内形成一个可视化的标记，从而可以追踪目标蛋白在细胞中的位置和分布状况，并进一步解析其功能。
GFP是源自一种发光水母的蛋白质，其在自然界中已经被广泛应用于生物成像领域。
通过将GFP与目标蛋白发生融合，可以在活体细胞中直接观察目标蛋白的分布情况，无需特殊的染色剂或抗体。
融合蛋白中的GFP可以发出特定波长的绿色荧光，因此使得目标蛋白在细胞中的定位和运动轨迹可以被即时观察和记录。
GFP融合蛋白技术的应用涉及到多个领域，包括细胞生物学、生物化学、分子生物学和遗传学等。
特别是在细胞内定位和功能方面，GFP融合蛋白技术提供了一种直接窥探目标蛋白所处位置和参与的生物过程的手段。
首先，GFP融合蛋白技术能够帮助研究者确定目标蛋白在细胞内的定位。
细胞内的蛋白质可以存在于不同的细胞器和亚细胞结构中，而这些定位信息对于蛋白功能的理解至关重要。
通过将GFP与目标蛋白融合，研究者可以观察到融合蛋白的绿色荧光信号在细胞中的位置和分布。
例如，当GFP与高尔基体定位蛋白融合时，研究者可以通过观察绿色荧光信号是否出现在高尔基体附近来确定该蛋白的定位。
因此，GFP融合蛋白技术为细胞内蛋白的定位提供了一种可视化的手段，有助于筛选新的蛋白定位标记。
其次，GFP融合蛋白技术还可以帮助研究者解析目标蛋白的功能。
目标蛋白的功能常常与其定位有关，因此通过观察融合蛋白在细胞内的动态变化，可以推断目标蛋白的功能。
当目标蛋白参与到细胞内的一系列生物过程中时，在使用GFP融合蛋白技术时可以观察到融合蛋白在细胞内的局部或全局运动。
例如，在细胞分裂过程中，GFP融合蛋白技术可以显示融合蛋白在细胞质中的动态变化，从而帮助我们理解该蛋白在细胞分裂中的功能和作用机制。
GFP 基因转染对骨髓基质细胞体内向软骨细胞分化的示踪作用
・论著・文章编号:1007-8738(2004)01-0027-04GFP 基因转染对骨髓基质细胞体内向软骨细胞分化的示踪作用周广东,王晓云,刘德莉,崔 磊,刘 伟,曹谊林3(上海第二医科大学附属第九人民医院整形外科上海市组织工程重点实验室,上海200011)收稿日期:2003-01-02; 修回日期:2003-03-24基金项目:国家高技术研究发展计划(863)资助(No.2002AA205021)国家重点基础研究发展规划(973)资助(No.G 19990543)作者简介:周广东(19722),男,山东陵县人,助理研究员,博士.T el :(021)6313834125192;Email :guangd ongzhou @3Corresponding authorIn vivo tracing of bone marrow stromalcell differentiating into chondrocytes by green fluorescent protein gene transfec 2tionZHOU Guang 2dong ,W A N G Xiao 2yun ,L IU De 2li ,CU I L ei ,L IU Wei ,CA O Yi 2li n 3Department of Plastic and Reconstructive Surgery of the 9th People ’s Hospital ,Shanghai Second Medical University ,Shanghai Tissue Engineering Laboratory ,Shanghai 200011,ChinaAbstractAIM :T o achieve highly efficient ,stable and long 2term expre ssion of green fluore scent protein (GFP )reporter gene in bone marrow stromal cells (BMSCs )and to trace directly the distribution and differentiation of BMSCs in articular cartilage defects.METH ODS :Recombinant RV 2GFP expre ssion vector was constructed and transfected into packaging cell PT67.A fter G 418screening and amplification ,cell clone s producing high level recombinant viruse s were obtained and in vitro expanded.The virus supernatant from in fected PT 67cell culture was used to in fect BMSCs directly.Autologous GFP 2labeled BMSCs were seeded onto biodegradable polymer and implanted into porcine articular cartilage defects.7months later ,the repaired tissue was evaluated by con focal micro scope.RESU LTS :The con 2structed recombinant expre ssion vector RV 2GFP was identified by re striction dige stion.The transfection rate s of PT 67cells reached 20%～50%,which reached 100%after G 418screen 2ing ,bright green fluore scence could be seen under fluore scence micro scope.BMSCs could be transfected succe ssfully by the culture supernatant from in fected PT 67cells and GFP was ex 2pre ssed efficiently in a long 2term period.Con focal micro scope revealed that GFP 2labeled cells existed in many neocartilage la 2cunae after 7months.CONC L USIONS :The recombinant vector RV 2GFP can provide a simple ,sensitive and reliable tool to la 2bel BMSCs which can be used to study cytologic dynamic follow 2up in vivo.BMSCs can differentiate into chondrocyte s and play an important role in repairing articular cartilage defects.K eyw ords :recombinant retrovirus vector ;green fluore scentprotein;bone marrow stromal cells ;chondrogene 2sis摘要目的:实现绿色荧光蛋白(green fluorescent protein ,GFP )报告基因在骨髓基质细胞(BMSC )中的高效、稳定、持久表达,直接示踪BMSC 在关节软骨缺损内的分布及分化。
慢病毒介导GFP基因转染神经干细胞的实验研究
慢病毒介导GFP基因转染神经干细胞的实验研究发表时间：2012-08-13T16:44:08.513Z 来源：《中外健康文摘》2012年第19期供稿作者：张子衡张益民[导读] 将外源性基因转入神经干细胞,载体的选择是关键,常用的有非病毒性载体和病毒性载体。
张子衡张益民（汕头大学医学院第一附属医院神经外科广东汕头 515041）【中图分类号】R741【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）19-0053-04 【摘要】目的探讨以慢病毒（Lentivirus, LV）为载体，转染绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein, GFP）基因至神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)的方法，观察其转染效率。
方法应用包装细胞293T将三种质粒载体pGC-E1-GFP、pHelper1.0 和pHelper2.0经脂质体转染重组，构建成表达GFP的慢病毒载体（Lentiviral vector-GFP,LV-GFP）。
并从孕14天大鼠胚胎的脑组织分离出神经干细胞，采用无血清培养法，进行体外培养、扩增。
取经过5次传代神经干细胞，以1×105个细胞/500μl/孔接种于24孔板，分别按复感染指数（Multiplicities of infection,MOIs值）为0、1、5、10、15、20加入LV-GFP稀释液100μl,每一滴度加六孔,共六组。
48～72小时后于倒置荧光显微镜下观察各组GFP的表达效率，并在72小时后进行神经干细胞球进行计数，以观LV-GFP对NSCs增殖的影响。
并行流式细胞仪检测，得出各组NSCs 的 GFP阳性转染率。
结果除MOI值为0的对照组外，48～72小时后各孔均有GFP表达。
MOI值从0增至10，细胞的阳性表达率逐渐提高(P<0.05)，MOI值为10的组能获得>90%的转染率。
但MOI值从10增至20，形成的神经干细胞球数目却逐渐减少(P<0.05)。
绿色荧光蛋白在转基因动物研究中的应用
绿色荧光蛋白在转基因动物研究中的应用绿色荧光蛋白(GFP)是一种来自水母的蛋白质，具有独特的荧光性质，可以发出绿色荧光。
近年来，GFP被广泛应用于生物学研究中，特别是在转基因动物研究中得到了广泛应用。
利用GFP基因的表达，科学家可以追踪细胞、组织以及整个生物体系的运动和功能。
通过将GFP基因转入目标细胞或组织中，科学家可以用荧光显微镜观察其在生物中的位置和运动轨迹，繁殖情况以及基因表达水平等重要信息。
在转基因动物研究中，GFP的应用尤其重要。
通过将GFP基因转入小鼠、果蝇等模式动物中，科学家可以追踪这些动物的胚胎发育、器官生长、细胞分化以及疾病模型等过程。
此外，还可以利用GFP的荧光特性，观察细胞内各种蛋白质的表达情况，从而了解其在疾病发生发展中的作用，为药物开发提供参考。
总之，GFP在转基因动物研究中的应用，不仅能够促进科学家对于生物体系的认识和了解，还能够为疾病治疗提供新的思路和方法。
随着技术的进步，GFP的应用前景将会更加广阔。
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成纤维细胞生长因子的研究进展
成纤维细胞生长因子的研究进展纪孝伟;吴春玲【摘要】成纤维细胞生长因子(FGF)在机体内广泛分布,其系统由多个受体和配体组成,在组织、神经修复和血管再生中起到了重要作用,对多种细胞有促进DNA和细胞分裂的作用.FGF系统在脑内的作用主要是调控神经元、神经胶质细胞和血管内皮细胞的增殖、移行、分化和存活.随着分子生物学等技术的不断进步,人们对FGF的研究不断深入,FGF有望成为一种新的治疗手段,为疾病的治疗提供新思路.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2014(020)003【总页数】3页(P411-413)【关键词】成纤维细胞生长因子;神经修复;内脏发育【作者】纪孝伟;吴春玲【作者单位】山东中医药大学第二附属医院神经内科,济南,250001;山东大学附属济南市中心医院肾脏病/血液净化中心,济南,250013【正文语种】中文【中图分类】R741.02成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)是一种能调节细胞增殖、分化的多肽家族，其系统由多个受体和配体组成，在机体内的许多组织和器官内均有分布。
其中以碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和酸性成纤维生长因子的研究最为活跃。
FGF是一种多功能的非特异性活跃物质，对来源于中胚层和神经外胚层的多种细胞有促进DNA和细胞分裂的作用，并且可以延缓细胞的衰老。
该文就FGF的组成、分布、功能及其临床作用予以综述。
1 FGF系统的组成和分布人类FGF系统有22个配体和5个受体组成。
成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor，FGFR)属于酪氨酸激酶受体家族，在细胞外的第三个免疫球蛋白样区可以被剪切成不同的突变体。
在海马的CA2和CA3区FGFR1表达量最高，在皮质表达则相对较少。
与FGFR1的分布不同，FGFR2和FGFR3在海马星形细胞的表达量少[1]。
浅论腺病毒载体介导EGFP转染大鼠骨髓间质干细胞研究
浅论腺病毒载体介导EGFP转染大鼠骨髓间质干细胞研究作者：王兴忠，孟静，陈丽萍，吕汉琰, 朱伟，许文荣【摘要】目的：探讨腺病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因转染大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的生物学特性。
方法：骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓MSCs并采用流式细胞术进行鉴定。
利用脂质体法通过腺病毒转染获得EGFP修饰的大鼠骨髓MSCs。
结果：成功分离得到大鼠MSCs，腺病毒转染后大鼠骨髓MSCs过表达绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因，且转染后MSCs具有成骨分化潜能。
结论：通过腺病毒转染能获得EGFP标记的大鼠MSCs，为MSCs组织工程和基因治疗研究提供了依据。
【关键词】间质干细胞; 腺病毒载体; 基因治疗; 转染[Abstract] Objective: To investigate the biological characteristics of rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) transfected green fluorescent protein(GFP) gene by adenovirus vector. Methods: Rat bone marrow derived MSCs were isolated by adherent culture method. Flow cytometric analyses were used to identify cells which were transfected by recombinant adenovirus EGFP using lipofectamine2000. Results: Rat bone marrow derived MSCs were successfully isolated and efficiently express EGFP report gene by adenovirus vectors transfection. Conclusion: Rat bone marrow derived MSCs can be transfected by recombinant adenovirus EGFP, which may potentially be used as a target for tissue engineering and gene therapy.[Key words] mesenchymal stem cells; adenovirus vector; gene therapy; transfectionMSCs是一类存在于骨髓、脂肪组织、骨骼肌、肝、脐血、外周血等多种组织的多能干细胞，其中骨髓、脐带是最常用的MSCs体外分离培养的组织来源[1,2]。
GFP的简介和应用
GFP的简介和应用【摘要】源于多管水母属等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白（GFP），是一种极具应用潜力的标记物，有着极其广泛的应用前景。
本文就GFP的理化性质、荧光特性、改进以及它在科学研究中发挥的作用进行了综述。
【关键词】绿色荧光蛋白（GFP）、标记物、荧光特性、进展、改进、应用、干细胞移植【正文】一、GFP的简介1. GFP的理化性质，荧光特性及其改进1.1 GFP的理化性质从水母体内分离到的GFP基因，长达2.6kD，由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸。
GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。
Aequoria GFP分子量约27×103，一级结构为一个由238 个氨基酸残基组成的单链多肽；而Renilla GFP是分子量为54kD的同型二聚体。
两种GFP有不同的激发光谱，Aequoria GFP在395 nm具有最高光吸收峰，肩峰为473 nm；Renilla GFP在498 nm具有强烈的光吸收，肩峰为470 nm。
两种GFP含有相同的生色团，发射光谱基本相同（λmax= 508~ 509 nm）。
GFP性质极其稳定，易耐受高温处理，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。
其变性需在90℃或pH<4.0或pH>12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境，或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。
更重要的是，它们在很大的pH范围内的吸收、发射光谱也是相同的。
Renilla GFP的稳定性就更为显著。
它在上述一系列的变性条件下都很稳定，不易变性。
根据Sheen等的研究，GFP在受体内表达时，其稳定性并不亚于CAT 蛋白，因而可以得到持续时间较长的荧光。
1.2 GFP的荧光原理GFP的性质和发射光谱的稳定性是同其生色团结构的稳定性密不可分的。
GFP表达后折叠，在氧存在的条件下，使66位氨基酸残基的α、β键间脱氢。
细胞示踪技术与应用(GFP)
(green fluorescent protein ,GFP)
李京宝 2011.11.25
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主要内容
• GFP • GFP的研究历史 • GFP的应用
学习要点
• 基本特性 • 机遇与重视 • 开阔视野
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GFP
—— 基本性状
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简介
• 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称 GFP • 最早是由下村修等人在1962年在水母中发现。其 基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激 发下，会发出绿色荧光。
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美国生物化学家 美国国家科学院院士 美国国家医学院院士 美国艺术与科学院院士 圣地牙哥加利福尼亚大学生物化学及化学系教授。
1972年，哈佛大学化学及物理学最优等学士学位。 1977年，英国剑桥大学生理学博士学位。 1977年-1981年，剑桥大学研究员。
钱永健 Roger Yonchien Tsien （1952年2月1日－）
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马丁· 查尔菲（Martin Chalfie，1947年－），美国科学家 成长于美国芝加哥 1977年获得美国哈佛大学神经生物学博士学位 1982年起任美国哥伦比亚大学生物学教授。
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Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., and Prasher, D. C. (1994), “Green fluorescent protein as a marker for gene expression,” Science 263: 802–805.
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Thanks！
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gfp从下村修到钱永健nobelprizechemistry2008greenfluorescentproteingfposamushimomuramartinchalfieroger下村脩1928年8月27日有机化学家海洋生物学家1928年生于日本京都1960年获得日本名古屋大学有机化学博士学位美国woodshole海洋生物学实验室mbl波士顿大学医学院名誉退休教授10小海萤cypridinahilgendorfii1955nagoyauniversitylaboratoryprofyoshimasahirata
gfp标记蛋白作用 -回复
gfp标记蛋白作用-回复标题：GFP标记蛋白的应用与作用解析引言：蛋白质是生物体内许多生物学过程中的重要参与者。
为了研究蛋白质的功能和位置，科学家们发展了各种蛋白质标记技术。
其中一种被广泛应用的技术是利用绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)标记蛋白。
本文将详细介绍GFP标记蛋白的应用和作用，从GFP的发现、特点和应用领域等方面进行解析。
一、GFP的发现和特点GFP是灵长类动物Aequorea victoria水母中发现的一种蛋白质，其发现源于对水母发光现象的研究。
GFP具有以下特点：1. 高亮度：GFP能够自发发出可见光绿色荧光，其亮度可与荧光染料媲美，不需要外源激发光。
2. 稳定性：GFP结构稳定，对温度和pH变化很耐受，使其成为了在活细胞中长期观察的理想标记蛋白。
3. 磷酸化依赖性：GFP的荧光与周围环境的化学性质有关，其中最重要的因素是GFP分子的磷酸化状态。
二、GFP标记蛋白的应用1. 研究蛋白质定位和空间分布：将GFP与目标蛋白融合，通过显微镜观察GFP的荧光信号，可以直观地获得目标蛋白在细胞中的定位和空间分布信息。
2. 研究蛋白质表达水平和动力学：通过GFP标记蛋白，在不同发育阶段或条件下定量检测GFP荧光信号强度以及荧光稳定性，可以研究蛋白质的表达水平和动态变化过程。
3. 探究蛋白质相互作用：将不同蛋白质分别与GFP融合，观察GFP 信号的共定位或共定量变化，可以推测和验证蛋白质间的相互作用关系。
4. 跟踪细胞分裂和追踪细胞迁移：将GFP标记蛋白转染至细胞中，可以跟踪细胞的分裂过程以及追踪细胞在组织或器官中的迁移路径，帮助研究细胞生物学和发育过程。
三、GFP标记蛋白应用示例1. GFP标记蛋白在细胞器定位研究中的应用：通过将GFP与细胞器相关蛋白融合，研究者们成功地揭示了线粒体、液泡、高尔基体等细胞器的形态特征和空间位置。
2. GFP标记蛋白在蛋白质交运输研究中的应用：将GFP与转运蛋白融合，可以观察到转运蛋白在细胞内的运输路径和速率，揭示其在细胞内物质转运中的重要作用。
分子生物学技术在细胞信号转导研究中的应用
分子生物学技术在细胞信号转导研究中的应用细胞信号转导是细胞内外信息交换的重要过程。
在这个过程中，一些信号物质会与细胞膜上的受体相互作用，从而诱导信号通路的启动。
信号转导通路涉及到许多分子和细胞因子的相互作用，其中包括细胞内信号转导通路、细胞间信号分子、荷尔蒙、细胞外基质等。
而分子生物学技术的发展为我们更深入地了解信号转导通路提供了新的方法和手段。
第一种分子生物学技术是基础研究中常用的“GFP标记”，GFP全称绿色荧光蛋白，它是源自于鹿角菜的一种蛋白质，具有一定的发光性质。
在细胞中，可以将GFP和各种细胞因子进行结合，从而在实验中观察到它们的位置和分布。
例如，如果将GFP与细胞质钙调素相结合，就可以在细胞中观察到细胞内钙浓度的变化，进而了解钙信号的调节机制。
类似地，我们可以通过标记不同的信号分子，在细胞中观察它们的运动和相互作用，更加深入地了解细胞信号转导的机制。
第二种分子生物学技术是RNA干扰技术。
RNA干扰是一种通过siRNA和miRNA干扰对应mRNA从而影响基因表达的技术。
这种技术可以用于筛选对信号转导通路起作用的分子。
例如，我们可以通过siRNA干扰某种激酶的基因表达，观察对信号通路的影响，从而了解这种激酶对信号转导的作用。
此外，通过RNA干扰技术，我们也可以探索新的信号转导通路。
第三种分子生物学技术是蛋白质质谱技术。
蛋白质质谱是一种能够高通量地鉴定和定量蛋白质的技术，它几乎适用于所有生物系统。
通过该技术，可以鉴定出特定信号转导通路中出现过的所有蛋白质，以及它们之间的关系和相互作用。
例如，我们可以使用该技术研究某些信号转导通路中的调节因子，来了解这些因子对信号转导的调控作用。
第四种分子生物学技术是蛋白质芯片技术。
蛋白质芯片是一种高通量的分析方法，通常用于同时检测大量的蛋白质。
它可以用于研究蛋白质的细胞内定位和表达水平等，同时还可以用于筛选信号转导通路相关的蛋白质。
通过这种技术，我们可以快速地获取有关信号转导通路中大量蛋白质的信息。
EGFP和CM-Dil示踪骨髓间充质干细胞构建组织工程骨的体内研究
EGFP和CM-Dil示踪骨髓间充质干细胞构建组织工程骨的体内研究目的：应用增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）和CM-Dil标记技术，观察组织工程骨在体内形成过程中种子细胞的变化和转归。
方法：分别用EGFP慢病毒表达和CM-Dil染料的方法标记比格犬骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells, BMSCs），MTT法检测标记细胞的体外增殖能力。
BMSCs接种珊瑚支架体外成骨诱导7天后，将未标记组、EGFP组和CM-Dil 组分别植入裸鼠背部皮下，空白支架作为阴性对照。
术后4、8、12周取材，HE 染色观察成骨情况，EGFP组采用GFP免疫组化、CM-Dil组冰冻切片荧光显微镜下示踪BMSCs在体内的变化。
结果：两种标记技术能高效标记BMSCs，标记前后细胞的体外增殖无显著性差异（P>0.05）。
细胞-支架复合物植入体内12周后有新生骨形成，标记细胞数量随时间延长而逐渐减少，12周后仍显示有部分标记细胞存活。
结论：EGFP和CM-Dil可用于示踪组织工程种子细胞，通过示踪说明BMSCs在体内组织工程骨成骨过程中发挥了重要作用。
Abstract: Objective To observe the effect of BMSCs in fabricating tissue engineering bone in vivo using EGFP and CM-Dil labeling technology. Methods BMSCs isolated from Beagle Dogs were labeled using EGFP and CM-Dil separately and the proliferation abilities were analyzed by MTT assay. BMSCs were seeded onto the coral scaffolds and cultured in the osteogenic medium for 7 days.Then the BMSCs/Coral constructs were implanted into the nude mices subcutaneously.The constructs were divided into three groups:Unlabeled group,EGFP group,CM-Dil group.The specimens were collected respectively at 4,8 and 12 weeks after implantation and tissue engineered bone was evaluated by HE staining.The seeded BMSCs were traced by immunohistochemistry staining of GFP in the EGFP group and directly observed in the frozen section under the fluorescence microscope in the CM-Dil. Results BMSCs were labeled efficiently by both GFP and CM-Dil labeling technology and there was no statistical significance in BMSCs proliferation after labeling (P>0.05).The histological observation of three groups showed that there were engineered bone formed around the pores of the scaffolds after 12 weeks implantation. The labeled BMSCs were decreased gradually and could be detected up to 12 weeks in vivo. Conclusion EGFP and CM-Dil can be used to label and trace the seeded BMSCs in tissue engineered bone formation in vivo.Key words: EGFP; CM-Dil; BMSCs; lable; tissue engineering boneBMSCs是一类存在于骨髓中除造血干细胞以外的成体干细胞，其自我更新能力及多向分化潜能已被广泛认识，是组织工程研究领域种子细胞的理想来源[1-3]。
绿色荧光蛋白-重组慢病毒载体转染骨向诱导的骨髓间充质干细胞及鉴定
绿色荧光蛋白-重组慢病毒载体转染骨向诱导的骨髓间充质干细胞及鉴定梁学萍;张蕾;胡杨【摘要】关于组织工程骨构建领域种子细胞标记一直是研究热点之一，构建GFP－重组慢病毒载体感染成骨方向诱导骨髓间充质干细胞，具有重要的研究价值。
文章采用RT－PCR方法检测成骨基因骨桥蛋白和碱性磷酸酶、骨钙素、碱性成纤维细胞生长因子和collgen-Ⅰ表达，构建GFP－重组慢病毒载体，经基因测序和荧光倒置显微镜检测其表达。
RT－PCR检测结果显示，骨髓间充质干细胞成骨方向诱导培养成功，阶段性表达成骨基因骨桥蛋白和碱性磷酸酶、骨钙素、碱性成纤维细胞生长因子和collgen-Ⅰ。
基因测序结果证实GFP－重组慢病毒载体成功构建，荧光倒置显微镜检测成功转染成骨方向诱导培养骨髓间充质干细胞，并在该细胞中表达。
文章最后得出结论：GFP－重组慢病毒载体成功转染成骨方向诱导的骨髓间充质干细胞，GFP标记的骨髓间充质干细胞具备良好的成骨功能，用于组织工程骨构建。
%The method of labeled seed cells is one of hot research of the construction of tissue engineering bone field, construction of GFP recombinant lentiviral vector infected BMSCs induced into osteoblasts, and it has important research value.BMSCs were cultured by bone induced medium , expression of bone gene of alkaline phosphatase, osteocalcinand osteopontin , basic fibroblast growth factor and collgen-I detected by RT- PCR method. The construction of GFP recombinant lentiviral vector , gene sequencing and inverted fluorescence microscope detected its expression.Results of RT-PCR showed BMSCs successfully induced into osteoblasts , osteogenic gene of osteopontin and osteocalcin, alkalinephosphatase, basic fibroblast growth factor and collgen-I expressed at stage.Gene sequencing results confirmed that GFP recombinant lentiviral vector was successfully constructed, inverted fluorescence microscope detection, BMSCs induced into osteoblasts were successfully transfected by GFP recombinant lentiviral vector ,and the GFP expressed in the BMSCs.The GFP recombinant lentiviral vector successfully transfected BMSCs induced into osteoblasts ,GFP labeled BMSCs are good osteogenic function for the construction of tissue engineered bone.【期刊名称】《江苏科技信息》【年(卷),期】2015(000)015【总页数】6页(P65-70)【关键词】绿色荧光蛋白;慢病毒;骨髓间充质干细胞【作者】梁学萍;张蕾;胡杨【作者单位】新疆医科大学第一附属医院牙体牙髓科，新疆乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆乌鲁木齐 830054【正文语种】中文绿色荧光蛋白—重组慢病毒载体转染骨向诱导的骨髓间充质干细胞及鉴定梁学萍1，张蕾2，胡杨2*（1.新疆医科大学第一附属医院牙体牙髓科，新疆乌鲁木齐830054；2.新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆乌鲁木齐830054）摘要：关于组织工程骨构建领域种子细胞标记一直是研究热点之一，构建GFP－重组慢病毒载体感染成骨方向诱导骨髓间充质干细胞，具有重要的研究价值。
绿色荧光蛋白基因转染示踪比格犬体内骨髓间充质干细胞分化
绿色荧光蛋白基因转染示踪比格犬体内骨髓间充质干细胞分化张海峰;杜子婧;赵丹阳;韩修国;韩冬【摘要】Objective To observe differentiation and transformation of bone mesenchymal stem cells (BMSCs)labeled with green fluorescent protein (GFP)technology in bone tissue engineering.Methods Adenoviral delivery of GFP genes (Ad-GFP)transfected to canine BMSCs.The morphology of BMSCs,alkaline phosphatase (ALP)and alizarin red staining were observed with the help of invert light microscope,and the expression of GFP was scrutinized by using fluorescence microscope.Once succeeding,the centrifuged BMSCs were collected and mixed with beta-tricalcium phosphate (β-TCP),then they were transplanted under tibial periosteum.The beagles using the above way to construct tissue engineering bone were marked group A,which only wi thβ-TCP transplated into tibial periosteum were marked group B, and which withβ-TCP subcutaneously placed were marked group C.In the postoperative 2 weeks,histology and immunohistochemistry results were studied and the expression of GFP was observed by laser scanning confocal microscope.Results After induced differentiation in vitro, observing BMSCs found that ALP staining and alizarin red mineralization nodules staining were positive.Histology observation revealed that compared with group B,abundant bone formed and neovascularized significantly in group A,and bone formation did not exist in group C. Immunohistochemistry staining showed that type Ⅰ collagen and platelet endothelial cell adhesionmolecule-1 (CD31)were positive in group A, type Ⅰ collagen and CD31 were positive partly in group B rather than group C.The expression oftypeⅠcollagen and CD31 were analyzed in group A and group B by the way of semi-quantitative immunohistochemical staining.The value of type Ⅰ collagen and CD31 had significant differ ences between group A and group B.The expression of GFP was observed by laser scanning confocal microscope in group A not in group B nor group C.Conclusion BMSCs isthe important factor to accelerate the generation of tissue engineering bone instead of osteoblasts in surrounding.They could promote endothelial cell tube formation inside periosteum.%目的运用绿色荧光蛋白（GFP）标记技术，观察骨组织工程中种子细胞的变化和转归。
联合G418筛选构建GFP转基因骨髓基质干细胞系的实验研究
联合G418筛选构建GFP转基因骨髓基质干细胞系的实验研究王亮亮;孙婧;刘强和;邓铭;彭文丽【摘要】目的联合G418筛选构建绿色荧光蛋白(GFP)转基因SD大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)系,用于骨髓基质干细胞体外培养及向内耳神经细胞诱导分化的进一步研究.方法制备大鼠骨髓基质干细胞,选用脂质体Lipofectamine TM 2000转染方法将含有pcDNA3.1-GFP的重组质粒转染至大鼠骨髓基质干细胞中,荧光显微镜检测GFP蛋白表达,通过G418筛选法建立稳定、含pcDNA3.1-GFP的单克隆骨髓基质干细胞系.结果500μg/mL的G418压力筛选后,获得了具有G418抗性的绿色荧光蛋白(GFP)转基因SD大鼠骨髓基质干细胞系.结论成功地培育了G418抗性的GFP转基因大鼠骨髓基质干细胞系,为进行下一步体外特异微环境下的诱导分化提供实验基础.【期刊名称】《海南医学》【年(卷),期】2018(029)020【总页数】3页(P2813-2815)【关键词】G418;绿色荧光蛋白;转染;骨髓基质干细胞【作者】王亮亮;孙婧;刘强和;邓铭;彭文丽【作者单位】桂林医学院附属医院耳鼻喉头颈外科,广西桂林 541000;桂林医学院附属医院耳鼻喉头颈外科,广西桂林 541000;桂林医学院附属医院耳鼻喉头颈外科,广西桂林 541000;桂林医学院附属医院耳鼻喉头颈外科,广西桂林 541000;桂林医学院附属医院耳鼻喉头颈外科,广西桂林 541000【正文语种】中文【中图分类】R-332干细胞以其高分化潜能等优点成为近年来分子生物学研究领域中的热点，目前的许多研究发现，可以通过特定的诱导因素使其转化成为某一目标细胞，进而达到临床治疗疾病的目的。
而骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells，BMSCs)作为较早发现的干细胞家族成员，具有多向分化潜能、取材方便、对实验对象创伤小、细胞来源丰富等优势。
慢病毒负载GFP转染兔脂肪干细胞的效率及毒性评价
慢病毒负载GFP转染兔脂肪干细胞的效率及毒性评价李宏松;徐晨;邹俊【摘要】目的探讨慢病毒负载绿色荧光蛋白(GFP)对兔脂肪干细胞(rADSCs)转染的可行性及稳定性,为rADSCs组织工程化角膜上皮的研究提供可靠的体内外示踪方法.方法以慢病毒作为载体,采用不同感染复数(MOI)慢病毒将GFP基因导入rADSCs,荧光倒置显微镜下观察细胞转染情况,应用MTT法检测慢病毒转染对rADSCs细胞生长的影响,评价细胞毒性.结果当MOI值为50、100、500时,rADSCs均可被成功转染,120 h后转染效率均可达50％以上.当MOI值为50、100时,GFP-慢病毒对rADSCs的生长无明显影响,而MOI值为500时,细胞生长受到明显抑制.结论慢病毒负载GFP可成功导人rADSCs,为进一步对ADSCs组织工程化角膜上皮的研究奠定了良好的实验基础.%Objective To evaluate the transfection efficiency and cytotoxicity of lentivirus containing green fluorescence protein (GFP) (lentivirus-GFP) on rabbit adipose-derived stem cells (rADSCs), and establish a method of cell tracer marker in the study of reconstruction of tissue engineered corneal epithelium. Methods rADSCs were transfected with lentivirus-GFP at different multiplicity of infection ( MOI) . Cell transfection was observed under fluorescent microscope, and influence of lentivirus transfection on proliferation of rADSCs was detected by MTT. Results rADSCs were successfully transfected at MOI of 50, 100 and 500, and the transfection efficiency could reach more than 50% 120 h later. Lentivirus-GFP had no significant effect on proliferation of rADSCs at MOI of 50 and 100, while the proliferation of rADSCs was significantly inhibited at MOI of 500. Conclusion rADSCs are successfully transfectedwith lentivirus-GFP, which can be used in the study of reconstruction of tissue engineered corneal epithelium.【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2013(033)004【总页数】6页(P439-444)【关键词】脂肪干细胞;毒性评价;绿色荧光蛋白;转染;兔【作者】李宏松;徐晨;邹俊【作者单位】上海交通大学附属第六人民医院眼科,上海200233【正文语种】中文【中图分类】Q782良好的细胞示踪方法可以很好地反映所研究细胞在体内外的动向。
GFP在生命科学中的应用
绿色荧光蛋白（GFP）在生命科学中的应用生命科学学院2011级2011012911 姜悦绿色荧光蛋白(GFP)是海洋生物水母体内的一种发光蛋白，最早是从华盛顿维多利亚水母体内克隆得到的。
GFP本身具有发光功能的荧光基团，无需特殊的辅助因子或其他蛋白的参与。
在近几年的生命科学研究中，GFP已经成为跟踪活组织或活细胞内基因表达及蛋白质定位的标记物，这一方法日益成熟，成为基因转录调控、时相表达、蛋白质定位、转基因动物、细胞骨架等研究的有效手段。
GFP在组织中表达产生内在的荧光，从而可以标记一些正常的细胞学过程，再借助一些高分辨率的显微荧光光学仪器就可以监控这些动态过程。
一、GFP基因作为报告基因在生命科学中的应用GFP基因是一种标志基因，带有该基因的物种会发生荧光反应。
GFP基因往往与其他物种的功能基因一起植入实验物种的细胞，转基因得到的新物种如果出现荧光反应，则与GFP基因同时植入的其他物种的基因也应该存在于转基因物种的细胞内。
《海洋科学》2011年第35卷第9期报道的《杜氏盐藻叶绿体ATP合酶α亚单位基因启动子的克隆及初步功能分析》（谷辉辉，冯书营，潘卫东，李杰，薛乐勋）中就利用GFP基因作为一种报告基因。
目前, 虽然已经利用盐藻的核转化系统表达了一些外源基因，但是外源基因在细胞核转化时容易发生基因沉默、表达量低等现象，为此，研究者进行了转化盐藻叶绿体而非转化细胞核的尝试。
研究者采用DraI、EcoRV、PvuII、ScaI、SmaI 和StuI六种内切酶消化杜氏盐藻叶绿体基因组DNA，与相应DNA接头连接, 构建成无载体连接的盐藻叶绿体GenomeWalker DNA文库。
利用长距离PCR技术从该文库中克隆得到ATP合酶α亚单位基因上游序列1347bp。
启动子特征分析显示该序列具有一般启动子的保守序列特征，根据这些特征设计引物，扩增4个5′端系列缺失的启动子片段，并用绿色荧光蛋白基因作为报告基因，构建启动子5′端系列缺失重组质粒，以期鉴定不同启动子片段驱动报告基因转录的活性。
三种携带GFP慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞的效果
三种携带GFP慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞的效果肖渝;李彦林;王坤;李龙滕;闫祥甲;蒙旭晗【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2017(021)029【摘要】背景：研究不同慢病毒对同一骨髓来源间充质干细胞的转染效果，筛选合适的细胞转染工具。
目的：探究3种慢病毒对兔骨髓间充质干细胞转染效果的差异。
方法：选择2周龄日本大耳白兔，髂骨穿刺抽取骨髓液，采用密度梯度离心法提取骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞表面标志物表达。
分别用pTomo-GFP慢病毒、Ad-GFP慢病毒、lenti-GFP慢病毒转染骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测3种慢病毒的转染率。
CCK-8法检测转染前后细胞生长活力变化。
结果与结论：①培养出的细胞CD44阳性率为75.64%，CD34、CD45阳性率分别为6.14%、9.48%；②pTomo-GFP慢病毒转染后GFP表达率为2.64%、Ad-GFP慢病毒转染后GFP表达率为16.72%、lenti-GFP慢病毒转染后GFP表达率为45.24%；③各慢病毒对细胞生长存在一定影响。
pTomo-GFP、Ad-GFP在第1-8天对细胞生长潜伏期和对数生长期存在影响，可能对前期细胞活性造成一定干扰。
短期内lenti-GFP对细胞生长影响不大，但第12天时出现了细胞生长情况变化，考虑对细胞远期活力存在影响；④选用lenti-GFP慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞能够在保证细胞正常生长的情况下提供最大的转染效率，适用于兔骨髓间充质干细胞的示踪及基因转染等相关研究。
【总页数】6页(P4642-4647)【作者】肖渝;李彦林;王坤;李龙滕;闫祥甲;蒙旭晗【作者单位】[1]昆明医科大学第一附属医院运动医学科,云南省昆明市650000【正文语种】中文【中图分类】R394.2【相关文献】1.BM P-2和EGFP重组腺病毒体外转染兔骨髓间充质干细胞的研究 [J], 陈佳滨;李强;茹嘉;武成聪;宁寅宽;蔡伟良2.Ad-hBMP-2／GFP 转染兔骨髓间充质干细胞体外骨生成的实验研究 [J], 宁寅宽;李强;蔡伟良;武成聪;陈佳滨;石正松3.TGF-β1和 EGFP 体外电转染兔骨髓间充质干细胞的实验研究 [J], 文剑明;王锐英;高燕;胡译文;陶波;周文静4.BMP7和EGFP重组腺病毒体外转染兔骨髓间充质干细胞的研究 [J], 刘永亮;叶钢;易善红;方针强;张英晨5.三种携带GFP慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞的效果 [J], 肖渝;李彦林;王坤;李龙滕;闫祥甲;蒙旭晗因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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・论著・文章编号:1007-8738(2004)01-0027-04GFP 基因转染对骨髓基质细胞体内向软骨细胞分化的示踪作用周广东,王晓云,刘德莉,崔 磊,刘 伟,曹谊林3(上海第二医科大学附属第九人民医院整形外科上海市组织工程重点实验室,上海200011)收稿日期:2003-01-02; 修回日期:2003-03-24基金项目:国家高技术研究发展计划(863)资助(No.2002AA205021)国家重点基础研究发展规划(973)资助(No.G 19990543)作者简介:周广东(19722),男,山东陵县人,助理研究员,博士.T el :(021)6313834125192;Email :guangd ongzhou @3Corresponding authorIn vivo tracing of bone marrow stromalcell differentiating into chondrocytes by green fluorescent protein gene transfec 2tionZHOU Guang 2dong ,W A N G Xiao 2yun ,L IU De 2li ,CU I L ei ,L IU Wei ,CA O Yi 2li n 3Department of Plastic and Reconstructive Surgery of the 9th People ’s Hospital ,Shanghai Second Medical University ,Shanghai Tissue Engineering Laboratory ,Shanghai 200011,ChinaAbstractAIM :T o achieve highly efficient ,stable and long 2term expre ssion of green fluore scent protein (GFP )reporter gene in bone marrow stromal cells (BMSCs )and to trace directly the distribution and differentiation of BMSCs in articular cartilage defects.METH ODS :Recombinant RV 2GFP expre ssion vector was constructed and transfected into packaging cell PT67.A fter G 418screening and amplification ,cell clone s producing high level recombinant viruse s were obtained and in vitro expanded.The virus supernatant from in fected PT 67cell culture was used to in fect BMSCs directly.Autologous GFP 2labeled BMSCs were seeded onto biodegradable polymer and implanted into porcine articular cartilage defects.7months later ,the repaired tissue was evaluated by con focal micro scope.RESU LTS :The con 2structed recombinant expre ssion vector RV 2GFP was identified by re striction dige stion.The transfection rate s of PT 67cells reached 20%～50%,which reached 100%after G 418screen 2ing ,bright green fluore scence could be seen under fluore scence micro scope.BMSCs could be transfected succe ssfully by the culture supernatant from in fected PT 67cells and GFP was ex 2pre ssed efficiently in a long 2term period.Con focal micro scope revealed that GFP 2labeled cells existed in many neocartilage la 2cunae after 7months.CONC L USIONS :The recombinant vector RV 2GFP can provide a simple ,sensitive and reliable tool to la 2bel BMSCs which can be used to study cytologic dynamic follow 2up in vivo.BMSCs can differentiate into chondrocyte s and play an important role in repairing articular cartilage defects.K eyw ords :recombinant retrovirus vector ;green fluore scentprotein;bone marrow stromal cells ;chondrogene 2sis摘要目的:实现绿色荧光蛋白(green fluorescent protein ,GFP )报告基因在骨髓基质细胞(BMSC )中的高效、稳定、持久表达,直接示踪BMSC 在关节软骨缺损内的分布及分化。
方法:构建重组逆转录病毒表达载体RV 2GFP ,通过PT67包装细胞克隆、G 418筛选及扩增,获得大量含GFP 基因的假病毒液,并直接转染BMSC 。
将含有GFP 基因转染标记的BMSC 与生物可降解材料复合后,植入猪自体关节软骨缺损处,7个月后共聚焦显微镜检测修复组织中GFP 标记的BMSC 的分布及分化。
结果:经双酶切鉴定证实重组逆转录病毒表达载体RV 2GFP 构建成功,转染PT67细胞后可在荧光激发波长下,发出明亮的绿色荧光,转染率达20%～50%,经G 418筛选后可达100%。
筛选、扩增后,PT67细胞的上清培养液可成功地转染BMSC ,筛选后能稳定、持久、高效表达GFP 。
将标记的BMSC 植入关节软骨缺损7个月后,修复组织仍能高效表达GFP ,激光共聚焦显微镜下显示,多数新生软骨陷窝内有GFP 标记的细胞。
结论:构建的重组逆转录病毒GFP 载体,能持久标记骨髓基质细胞,用于细胞动态变化的研究及细胞转归的示踪,该方法简便、灵敏、可靠、直观。
标记的BMSC 可在关节软骨缺损内分化为成熟的软骨细胞,并在软骨缺损的修复中发挥重要作用。
关键词:重组逆转录病毒载体;绿色荧光蛋白;骨髓基质细胞;软骨形成中图分类号:Q753 文献标识码:A 许多研究证实骨髓基质细胞(bone marrow stro 2mal cells ,BMSC )经体外诱导可向软骨细胞分化,并表达软骨特异性的蛋白II 型胶原及聚集蛋白聚糖(aggrecan )[1,2]。
但BMSC 在体内成软骨的能力尚不肯定,其在皮下异位成软骨的能力极为有限,无法形成大块的成熟软骨组织,是其目前尚不能广泛用于软骨组织工程种子细胞的主要原因。
在BMSC 修复关节软骨缺损的研究中,虽然多数实验证实,BMSC可在关节内分化为成熟的软骨细胞,并修复关节软骨缺损[3,4],但在关节软骨缺损修复过程中,缺损下方松质骨中的BMSC会迁移入缺损区参与缺损的修复,缺损周围的软骨也存在着微弱的自发修复能力[5]。
在植入的BMSC、松质骨中迁移入的BMSC及周围软骨的自发修复中,哪一种对缺损修复发挥更为重要的作用?修复组织中新生软骨是否确实是由植入的BMSC所形成?这些问题目前均无直接的证据证实。
本研究中我们建立了一套完整的BMSC转GFP 基因标记的技术平台,实现了GFP在BMSC中的长期、稳定、高效表达。
该法可直接追踪植入的BMSC 在体内的分化与转归,为阐明BMSC在关节软骨缺损修复中的作用提供了直接证据,也为组织工程种子细胞的标记提供了一种简便、灵敏、可靠而又直观的方法。
1 材料和方法1.1 材料 p EC2EGFP(6.7kb,GFP全长2.3kb,荧光增强型),由中科院细胞所丛笑倩教授惠赠。
逆转录病毒载体(pLNCX2,6.1kb)及PT67包装细胞,购自美国Clotech公司。
TGFβ1与地塞米松分别购自Intergen公司与Sigma公司。
其他转染试剂及细胞培养试剂购自G ibco公司。
幼年家猪由川沙养殖厂提供。
1.2 方法1.2.1 重组GFP逆转录病毒载体的构建 按刘德莉等[6]的报导,将p EC2EGFP(6.7kb)经Hi n dⅢ+ N otⅠ双酶切、胶分离、回收及纯化,可得到2.3kb的GFP基因片段。
将其定向插入已经相应酶切(Hin dⅢ+ N otⅠ)的逆转录病毒载体,再转染DH5α感受态菌后,经克隆、筛选、扩增、提纯及酶切鉴定,即可构建8.4kb的重组RV2GFP载体。
1.2.2 包装细胞转染 收获2×105个生长状态良好的PT67包装细胞,重悬于2mL含100mL/L小牛血清的DM EM培养液中,再接种到35mm培养皿中,置于37℃、50mL/L CO2培养箱中培养18～24h。
待细胞贴壁生长达50%～80%融合时,弃去培养液,用无血清培养基洗涤细胞1次,小心滴加含Lipofec2 tamin(20μL)的质粒DNA(2～5μg)的无血清培养基1mL于细胞上,轻轻摇匀,置37℃、50mL/L CO2培养箱中培养24h后更换普通培养液。
待细胞近融合时,用含400mg/L的G418培养液筛选。
抗性克隆初步形成后,在荧光显微镜下观察其绿色荧光的强度。
将抗性克隆移出传代,继续用含G418培养基筛选,扩增至全部形成抗性细胞克隆。
1.2.3 重组GFP2RV液的制备 将抗性PT67细胞克隆,以含200mL/L小牛血清的DM EM培养液培养传代,收集含重组GFP2RV的PT67细胞上清培养液,以0.45μm无菌滤膜过滤去除细胞碎片。