呼吸联检产品介绍-南昌-张国贞
【CN109762942A】一种快速检测呼吸道合胞病毒的含内参双重等温核酸扩增方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910190398.2(22)申请日 2019.03.13(71)申请人 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所地址 102206 北京市昌平区昌百路155号(72)发明人 马学军 申辛欣 王智宏 应清界 李鑫娜 齐菊菊 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限公司 11002代理人 王文君 陈征(51)Int.Cl.C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/6844(2018.01)C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01)(54)发明名称一种快速检测呼吸道合胞病毒的含内参双重等温核酸扩增方法(57)摘要本发明提供了一种快速检测呼吸道合胞病毒的含内参双重等温核酸扩增方法，属于等温核酸扩增技术领域。
本发明首先通过对呼吸道合胞病毒(RSV)基因测序和比对，设计了用于检测RSV的特异性引物对和探针，并设计了内参探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-4所示，在此基础上建立了含内参的双重等温核酸扩增体系，进一步构建了用于检测呼吸道合胞病毒的试剂盒。
本发明方法在等温条件下进行，5-30min内可实现同时对呼吸道合胞病毒和内参DNA的扩增，灵敏度高、特异性好、内参的加入排除了假阴性和无效结果，更适合应用于有大量样品的检测，便于临床上的应用，该方法适用于对呼吸道合胞病毒的快速检测。
权利要求书2页 说明书8页序列表2页 附图6页CN 109762942 A 2019.05.17C N 109762942A1.一种用于检测呼吸道合胞病毒的靶序列，其具有SEQ ID NO.5所示的序列或其特异性片段。
2.权利要求1所述的靶序列在采用等温核酸扩增技术检测呼吸道合胞病毒中的应用。
3.适用于等温核酸扩增技术检测呼吸道合胞病毒的引物探针组合，其特征在于，含有一对特异性引物对和一条靶探针，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述靶探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
呼吸道九联检
关于开展呼吸道病原体九联检的通知为满足临床要求，给临床和病患提供更好的检验服务，检验科开展了呼吸道九项病原体的检测，在免疫项目中开呼吸道九联检（收费375元）即可，医保项目，抽血当日即可出报告。
抽血：血清2-3ml（红盖试管）。
呼吸道九项病原体的临床意义采用西班牙VIRCELL公司生产的间接免疫荧光法检测试剂，同时检测人血清中呼吸道感染主要病原体的IgM抗体，可检测的病原体包含：1、嗜肺军团菌 2、肺炎支原体 3、Q热立克次体 4、肺炎衣原体 5、腺病毒 6、呼吸道合包病毒 7、甲型流感病毒 8、乙型流感病毒 9、副流感病毒1、2、3型。
1、嗜肺军团菌人最易感染的是嗜肺军团菌血清I型，非典型性肺炎常伴随有全身症状，10%的肺炎是由嗜肺军团菌血清I型引起的。
在血清学诊断中，间接免疫荧光法是唯一的标准技术。
临床上军团菌感染主要有两种表现形：肺炎型和庞蒂亚克热型。
前驱症状：乏力、头痛、全身肌肉酸痛，于1～2日内突然发热，可达40℃以上，多呈稽留热。
病程早期即可出现多系统受累症状，为本病的突出特点。
绝大多数患者有咳嗽，起初为干咳，半数患者转成非脓性粘稠痰或略带脓性痰，痰中常含少量血丝，个别可咯血。
少数患者有胸痛，呼吸困难较为多见。
肺部可闻及细湿罗音。
继之可出现明显肺实变体征。
约25%有恶心、呕吐及腹泻等消化道症状，有的腹泻为唯一首发症状。
神经症状多见于极期，有时非常突出，包括不同程度意识障碍、肌张力增强或阵颤、步态不稳等，可有暂时性肢体软瘫; 个别可有腹泻、清水样便。
或者失眠、眩晕、记忆力减退、意识朦胧、项强、震颤等神经系统表现.2、肺炎支原体肺炎支原体引起的肺炎在儿童和青少年中最为常见，肺炎支原体可在呼吸道黏膜上皮潜伏，部分患者无明显症状；但大部分患者为显性感染。
3岁以下儿童以上呼吸道感染多见，成人以肺炎表现为主。
发病初期有咽痛、头痛、发热、乏力、肌肉酸痛、食欲减退、恶心、呕吐等症状。
发热一般为中等热度，2~3天后出现明显的呼吸道症状，突出表现为阵发性刺激性咳嗽，以夜间为重，咳少量黏痰或黏液脓性痰，有时痰中带血，也可有呼吸困难、胸痛。
七项呼吸道病毒检测试剂盒(鉴定)使用说明书
七项呼吸道病毒检测试剂盒（鉴定）使用说明书【产品名称】通用名称：七项呼吸道病毒检测试剂盒英文名称：D3 Ultra DFA Respiratory Virus Screen & ID Kit【包装规格】鉴定试剂：80人份/盒【预期用途】用于临床定性检测7种呼吸道病毒：甲型（A型）流感病毒，乙型（B型）流感病毒，呼吸道合胞病毒，腺病毒，副流感病毒1、2和3型。
【检验原理】荧光素（FITC）标记的单克隆抗体与病毒抗原结合，形成稳定的抗原-抗体复合物，在荧光显微镜下观察，呈现特异性绿色荧光。
【主要组成成份】组份名称规格主要成分1 DFA染色试剂鉴定试剂流感A试剂：2 mL每试剂瓶为一项与病毒抗原相对应的荧光单克隆抗体流感B试剂：2 mL腺病毒试剂：2 mL呼吸道合胞病毒试剂：2 mL副流感1试剂：2 mL副流感2试剂：2 mL副流感3试剂：2 mL2 40X浓缩洗液25 mL PBS3 固定液15 mL 甘油4 阳性质控板5块包被病毒抗原【储存条件及有效期】2ºC-8ºC避光保存18个月。
【适用仪器】荧光显微镜，激发波长490 nm，发射波长520 nm。
【样本要求】鼻咽部取样后保存于生理盐水中，应在24小时内送检。
【检验方法】1、取样：用鼻咽拭子从病人的鼻咽部取样或者使用鼻腔灌洗液，将鼻咽拭子放入储存管中（含有生理盐水）。
2、样本准备步骤：①将样本充分震荡混匀约10-15秒。
②在400-600xg转速下离心5-10分钟。
③弃上清。
④在沉淀中加2-3 mL PBS缓冲液（不能使用试剂盒中的浓缩洗液），充分震荡混匀约10-15秒。
⑤在400-600xg转速下离心5-10分钟。
⑥吸走上清和黏液层，小心不要吸到沉淀。
⑦重复步骤4到6，直至黏液层被完全去除。
⑧在沉淀中加0.5-1 mL的PBS缓冲液。
⑨用移液器反复吹吸来重悬细胞沉淀，形成一个略混浊的悬液。
3、直接样本测试步骤：①在8孔板上的孔内滴加25 µL的细胞悬浊液，每样本需滴加七孔。
呼吸功能测试仪在疫情防控中的作用
呼吸功能测试仪在疫情防控中的作用随着新型冠状病毒疫情的暴发，呼吸系统受到严重威胁，呼吸功能测试仪成为了疫情防控中不可或缺的工具。
该仪器通过评估人们的呼吸功能和肺部状况，能够为早期发现和追踪疾病提供重要依据。
在本文中，我们将探讨呼吸功能测试仪在疫情防控中的作用。
首先，呼吸功能测试仪具有早期筛查疾病的能力。
在疫情爆发初期，呼吸功能测试仪可以用于评估人们的肺功能情况。
它通过测量一系列指标，如肺活量、呼气流量和肺顺应性等，来检测呼吸系统的健康状况。
这些指标能够反映病毒感染对呼吸系统的影响程度，从而帮助医务人员尽早发现可能的感染者。
通过早期筛查，可以迅速隔离和治疗患者，以控制疫情的扩散。
其次，呼吸功能测试仪可以用于监测疾病的变化和治疗效果。
疫情期间，部分患者可能会经历呼吸系统功能的损害。
呼吸功能测试仪能够定期或持续监测患者的肺功能指标，以评估疾病的发展情况和治疗效果。
通过对数据的分析和比较，医务人员可以制定个性化的治疗方案，并及时调整治疗措施。
同时，呼吸功能测试仪还可以提供临床研究所需的数据支持，有助于深入了解疾病的发病机制和病程特点。
此外，呼吸功能测试仪还可以用于康复训练和术后恢复。
对于康复期患者，呼吸功能测试仪能够定量评估呼吸系统的康复程度，指导康复训练的进度和效果。
通过量化的数据，康复师可以制定个性化的康复方案，提高康复效果。
对于手术后的患者，呼吸功能测试仪可以帮助监测术后肺功能的恢复情况，及时发现并处理术后并发症。
这对于患者的康复和生活质量的提高至关重要。
另外，呼吸功能测试仪的广泛应用还可以促进医学科研的发展。
通过收集大量的呼吸功能数据，研究人员可以进行深入的数据挖掘和分析，探索呼吸系统疾病的病理机制和新的治疗方法。
此外，通过对呼吸功能测试仪的技术改进和创新，可以不断提高该仪器的精确性和可靠性，为未来的临床应用提供更好的支持。
总结起来，呼吸功能测试仪在疫情防控中发挥着重要的作用。
它通过早期筛查、监测疾病的变化和治疗效果、康复训练和术后恢复等方面的应用，提供了重要的辅助诊断和治疗支持。
呼吸系统感染21联检检测试剂盒标准操作规程
s呼吸系统21联检检测试剂盒标准操作规程１目的明确呼吸系统21联检检测试剂盒检测的操作规程，指导检验人员正确进行基因芯片检测。
2 适用范围2.1 适用于进行呼吸系统21联检检测试剂盒检测的检验人员。
2.2 适合仪器：常规基因扩增仪、恒温杂交箱。
2.3 方法原理：采用PCR和DNA杂交相结合的DNA芯片技术。
2.4 样品要求：泌尿生殖道样本。
3 职责实验操作人员应严格按操作规程进行实验。
4 试剂来源《呼吸系统21联检检测试剂盒》（昆明寰基生物芯片开发有限公司）。
5 质控物阴性对照来源于试剂盒6 检验方法6.1 仪器和耗材6.1.1 无菌操作台；6.1.2 基因扩增（PCR）仪（适用0.2ml PCR薄壁管）；6.1.3 取样器（0.5-10μl、40-200μl、200-1000μl）；6.1.4 台式离心机（转速可达12,000rpm）；6.1.5 恒温培养箱（可恒温42℃）或可调42℃的保温台6.1.6 水浴恒温振荡器（可恒温25℃）；6.1.7 载玻片架及玻片洗脱容器2个；6.1.8 芯片激光扫描仪(Axon GenePix4000B)；6.1.9 PCR扩增所需一次性耗材。
6.2 检测前准备6.2.1 芯片洗脱液配制（若10%SDS出现白色絮状沉淀，请于42℃条件加热至溶液透明后再使用）6.2.1.1 在芯片洗脱容器中按照蒸馏水（或纯化水）: 20×SSC: 10%SDS =100:5:1 配制洗脱液Ⅰ，洗脱液配制总体积应满足浸没芯片；6.2.1.2 在芯片洗脱容器中按照蒸馏水（或纯化水）: 20×SSC: 10%SDS =400:1:4 配制洗脱液Ⅱ，洗脱液配制总体积应满足浸没芯片；6.2.1.3 洗脱液一次配制可连续使用15天，每个试剂盒中提供的洗脱液在一个月内用完。
6.3 样本处理1.用移液器将20μl Protreinase K加入一个干净的1.5ml离心管中。
呼吸功能监测仪器-
二、膜片偏位式压力计：通过相应于被测压力的感应元件
的膜片位移，把位移信号转换成电信号输出，并作指示和
记录。
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气道压监测仪器
三、压力表：是用以指示气体压力的仪表，常用的有两种类型。 1．波纹管压力表 只适用于低压系统的测量，精确度为±0.1％。 2．波顿管型压力表 波顿管型压力表的规格很多，测压范围很
广。
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呼吸功能监测仪器包括
。
• 呼吸监测 呼吸频率、节律、幅度；
潮气量、分钟通气量、气道压力
• 血氧饱和度 SaO2 通过氧饱和度探头可持续监测病人血氧饱和情况
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频率、节律、波形。
随呼气、吸气胸腔电阻发生周期性变化，通过心电 图导联线传至监护仪上经放大，微机处理后可换算 成呼吸频率，电阻的变化以波形在屏幕上显示，也 有报警系统，导线应置在呼吸运动最大的部位以能 监测最大的电阻变化。
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压差式流量计
利用在一定形状的流通管道中气流的压力降落与流速的依从 关系测定流量。
流量传感器：实现气体流速与压差的一次变换，根据流经该
变换器的气流速度大小不同，变换器两端感出相应的压差信号。
压差传感器：将பைடு நூலகம்流量成一定比例关系的压差信号转换成
一定的电信号，经处理后以数字或曲线图形显示。
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气流通过时推动叶轮或涡轮转动，叶轮式采用光电
调制原理，通过光电效应，涡轮式采用磁电调制原
理，通过磁电效应，把叶轮或涡轮的机械转动信号
转换成电信号输出。
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由于叶轮的运动惯性和转轴与轴承间摩擦力矩等因 素，会影响传感器的精度,此种误差部分可通过电子 线路予以补偿。
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灵敏度和特异性
病原体
嗜肺军团菌 肺炎支原体
样本数量
82 62
灵敏度
94.4% 96.8%
特异性
98.4% 100.0%
立克次体
肺炎衣原体 腺病毒 呼吸道合胞病毒 甲型流感病毒 乙型流感病毒 副流感病毒
74
61 74 97 46 40 36
100.0%
100.0% 85.7% 93.8% 94.1% 100.0% 100.0%
副 流 感 病 毒
NEGATIVE NEGATI VE
POSITIVE
NEGATIV E
第四部分 性能优势
间接免疫荧光法，特异性好，灵敏度高
直接荧光灵敏度10-15
间接免疫荧光法灵敏度10-17
检测IgM，近期感染的有效标志
抗原多次刺激的抗体产生规律
严格对比试实验 确保产品质量
病原体
腺病毒 立克次体
抗原抗体检测
IgG IgM
患者不同就诊时间
采样标准化及难易程度对比图
抗原检测
咽拭子 抗体检测
痰
第三部分 试剂盒知识
九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测 试剂盒
本试剂盒的设计理念
多种病原同时联合检测，节省时间、便于 快速诊断；为临床呼吸道病原鉴别诊断提 供导向性依据。
试剂盒组成及用途
组分
载玻片
成分和用途
检测的物理载体，覆有聚四氟乙烯并有针对检测物 的特异性抗原，包装袋内有一袋硅胶以防潮。
用于证明试剂盒及试验的有效性，含有人血清及防 阴阳性对照 腐剂。
吸附剂
羊抗人 IgG 抗血清用来吸附人 IgG 避免干扰 IgM 检测。
荧光素标记的抗人免疫球蛋白结合物，含有伊文思 蓝（对比染色）和蛋白稳定剂。和抗原抗体复合物 反应，并显色。
结合物
封闭介质
甘油缓冲液，便于观察。
磷酸盐缓冲 用于洗涤步骤，从反应介质中除去未结合的免疫球 液(PBS) 蛋白和结合物。
检测原理
试验步骤
检测结果显示
噬 肺 军 团 菌
POSITIVE WEAK WEAK
肺 炎 支 原 体
NEGATIVE
POSITIVE
NEGATIVE
Q 热 立 克 次 氏 体
12 20
无交 叉反 应或 干扰
肺炎衣 原体
20
交叉反应和干扰实验
病原体 腺病毒 呼吸道合胞 病毒 甲型流感病 毒 乙型流感病 毒 副流感病毒 干扰物质 RSV、甲型和乙型流感病毒和 副流感病毒 腺病毒、甲型和乙型流感病毒 和副流感病毒或根据病毒分类 （麻疹） RSV、乙型流感病毒、腺病毒 和副流感病毒 RSV、甲型流感病毒、腺病毒 和副流感病毒 RSV、甲型和乙型流感病毒和 腺病毒 样本例数 8 结果
方法
ELISA IFA
厂家
Virotech Biomerieux
衣原体 甲型流感病毒
乙型流感病毒 嗜肺军团菌 支原体 副流感病毒 呼吸道合胞病毒
IFA ELISA
ELISA IFA ELISA ELISA ELISA
FOCUS Virotech
Virotech MarDX VIRCELL Virotech Virotech
10 8 8 8
无交 叉反 应或 干扰
其他干扰
对25份类风湿因子阳性血清进行了2种病毒和2 种细菌抗原IgG和 IgM 抗体的检测。对另外两 份血清进行了每种抗原IgG 和IgM抗体的检测。 在IgM检测中，用抗IgG抗体对血清进行了吸附 处理。结果显示，吸附剂可以有效避免类风湿 因子的干扰。 经验证，吸附剂也可以有效地避免IgG抗体过 量造成的假阴性。
形态清晰，容易判定，准确性好
南京市儿童医院阳性率统计
日期 6.01 6.15 6.29 嗜肺 肺炎 Q热立 混合 军 支 克 标本 阳性 感 团 原 次 量 量 染 菌 体 体 26 25 15 644 10 10 0 201 47 1 2 1 3 1 25 82 1 6 8 9 5 1 1
甲型 乙型 呼吸 流 流 道 感 感 衣原 腺病 合 病 病 副流 体 毒 胞 毒 毒 感
5、项目进入江苏省医保，可以为更多病人服务
肺炎支原体 Q热立克次体
腺病毒
呼吸道合胞病毒 流感病毒
肺炎衣原体
副流感病毒
CAP临床症状
临床症状不典型，差异大 1.非典型肺炎 干咳为主，少痰或无痰，肺外症状较常见明显，尤其
军团菌感染，表现相对较重，多脏器受累明显。可有 高热、耳鸣、相对缓脉、血尿、腹痛、腹泻、肝酶升 高、电解质紊乱、精神神经症状等
九项呼吸道感染病原体IgM抗体 检测试剂盒介绍
客服中心：张国贞
内容纲要
CAP概况 实验室检测方法 试剂盒知识 试剂优势
第一部分 CAP概况
各病原体在CAP中感染率(国内)
病原菌 肺炎链球菌 肺炎支原体 流感嗜血杆菌 肺炎衣原体 军团菌 病毒类 混合感染（两种或以上） 其他及不明原因
97.6%
98.0% 97.0% 100.0% 96.4% 96.4% 96.3%
交叉反应和干扰实验
病原体 嗜肺军 团菌 肺炎支 原体 立克次 体 干扰物质 肺炎支原体、肺炎衣原体和Q热立克次体、 革兰氏阴性细菌（布鲁氏菌，沙门氏菌） 和抗核抗体 嗜肺军团菌、肺炎衣原体和Q热立克次体 肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌、 同种属的细菌（发疹伤寒等的病原体）和 抗核抗体 嗜肺军团菌、Q热立克次体和肺炎支原体， 同种属的细菌（发疹伤寒等的病原体）和 抗核抗体 样本 例数 20 结果
a
感染率（%） 27 15 12 7 4.8 8.5 17 13
在养老院获得的肺炎
数据来源： 《各国社区获得性肺炎指南对非典型病原体的重视情况》 《肺炎的诊断与治疗研究进展》 《重视非典型病原体在CAP致病中的作用》 《要重视非典型病原体在小儿呼吸道疾病中的致病作用》等
主要的非典型病原体
嗜肺军团菌
1 2 2 72 2 21 15 1 16 1
阳性 率 （ %） 32.2
7.30
3.88
12.7
0.16
1
1.24
11.2
3.30
2.30
2.50
其他方面优势
1、西班牙VIRCELL公司原装进口产品 2、国内第一家拿到医疗器械注册证,并获得CE认 证 3、一卡九项，范围更广，不仅可以检测五项病毒， 而且可以检测肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺 军团菌、Q热立克次体 4、标本为血清标本，容易采集、容易保存
2. 病毒 干咳为主，少痰或无痰、呼吸困难，低氧血症
第二部分 实验室检测方法
非典型病原体的检测断方法
临床症状： 相似难以辨别； 影像学检查: 特异性差； 病原的分离培养： 培养时间长； 操作繁琐； 技术难度大；
非典型病原体的诊断方法
分子生物学检测：核酸检测、PCR；
血清学检测:ELISA、IFA等；
POSITIVE WEAK WEAK NEGATIVE
肺 炎 衣 原 体
POSITIVE
NEGATIVE
检测结果显示
腺 病 毒
POSITIVE WEAK WEAK
NEGATIVE
POSITIVE
NEGATIVE
呼 吸 道 合 胞 病 毒
流 感 病 毒
POSI POSITIVE TIVE
WEAK
WEAK