GUS染色

GUS染色检测
实验原理
适宜的反应条件下，β- 葡萄糖苷酸酶（GUS）可将X－Gluc水解成蓝色物质，因此具有GUS 活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。

gus基因是目前常用的一种报告基因，是β－D－葡萄糖苷酸酶(gus)基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶 (GUS)能催化裂解一系列的β－葡萄糖苷酸，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc）分解为蓝色的物质,也可以将4-甲基-伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酯(4-MUG)分解为蓝色物质。

其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。

gus基因的最大优点是它能测定外源基因表达的具体细胞和组织部位，这是其它报告基因所不能及的。

染色液配制
1）X－Gluc母液：X-Gluc，用N-N-二甲基酰胺(DMF)或DMSO配成20mM的贮存液，分装成每管100µL，保存于-20℃。

2）X－Gluc基液（50mM PBS， pH7.0）。

配制方法：
50mM NaH2PO40.78g/100ml；
50mM Na2HPO4 1.79g/100ml共同溶解；
Na2EDTA （10mM，372mg），
Triton-100（0.1％，100μl）,
K3 [Fe(CN) 6] （铁氰化钾）（0.5mM，16.5mg）
K4 [Fe(CN) 6] （亚铁氰化钾）（0.5mM，21.1mg）
染色液：50μl X-Gluc母液＋450μl基液
需要试剂：
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc）；
N-N-二甲基甲酰胺(DMF) ； NaH2PO4； Na2HPO4 ；
Na2-EDTA ；Triton-100； K3 [Fe(CN) 6] （铁氰化钾）； K4 [Fe(CN) 6] （亚铁氰化钾）
染色方法：
1.将准备好的试材浸泡在染液，于25—37℃保温1小时至过夜。

2.叶片等绿色材料转入70%乙醇中脱色2—3次，至阴性对照材料呈白色。

3.肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为Gus表达位点。

注意事项
用于染色的植物材料的制备方法要因涉及的特定组织和器官的不同而异。

例如，拟南芥的根、花和叶片以及烟草幼苗的根就可以不作任何预处理而直接染色。

但是像烟草和马铃薯这些植物的茎和叶就必须在染色前切成薄片（1-3mm）。

当操作大的组织和样品时，可以选用真空渗入法来帮助底物和酶渗入细胞。