RD TNF-α ELISA试剂盒说明书

RD TNF-αELISA检测试剂盒说明书（MTA00B）
技术提示
1.当混合或冲悬蛋白质溶液时，避免产生气泡。

2.为了避免交叉污染，每个标准品，样品以及相关试剂加完后要更换枪头。

此外，每种试
剂要有单独的储液槽。

3.为了达到最佳效果，将试剂和样品等滴加到每个孔的中心位置。

4.为了保证准确的结果，在孵育步骤中，有必要对酶标板进行适当地密封。

5.底物溶液在加入到酶标板之前应为无色。

要保持底物溶液避光。

底物溶液应由无色渐渐
变为蓝色。

6.终止液应与底物溶液相同的加样顺序加到酶标板孔里。

加入终止液后，酶标孔中的颜色
应由蓝色变为黄色。

其他配套物品
1.酶标仪能够在450 nm处测量吸光度，校正波长设为540 nm或570 nm。

2.移液枪和移液器
3.去离子水
4.试剂瓶
5.用于稀释标准品的EP管
注意事项
1.终止液为酸性溶液，注意防护。

2.本试剂盒中的某些成分含有防腐剂，可能会引起皮肤过敏反应。

避免吸入。

3.显色剂B可能引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。

避免吸入。

4.佩戴好口罩和手套，实验服。

实验完成后要仔细洗手。

5.关于样本，细胞培养上清收集后存放在-20℃以下。

避免反复冻融。

试剂准备：
1.使用前将所有试剂放于室温。

2.小鼠TNF-αControl：使用1mL去离子水冲悬对照，充分混匀。

3.洗涤液：如果浓缩液中已形成晶体，加热至室温，轻轻搅拌，直到晶体完全溶解。

可
配制满足一个酶标板的洗涤液。

如：将20毫升洗涤液浓缩液加到480毫升去离子水或蒸馏水中，配制500毫升洗涤液。

4.底物溶液：底物显色试剂A和B应在使用15分钟内按等体积混合。

避光放置。

每个酶
标孔需要100 μL混匀后的AB混合物。

5.小鼠TNF-α标准品：参照瓶上的冲悬体积进行冲悬。

用去离子水或蒸馏水冲悬小鼠TNF-
α标准。

原液浓度为7000 pg/mL。

轻轻混匀，室温放置至少5分钟，然后再进行稀释。

先在1号管中加入900ul Calibrator稀释液（RD5K），2-7号加入200ul Calibrator稀释液。

准备一个8号管，加入适量Calibrator稀释液作为Blank（0 pg/ml）。

随后，1号管中加入100ul standard原液。

充分混匀后开始进行梯度稀释。

吸取200ul到下一管。

每个管子充分混匀后进行再下一步稀释。

实验步骤：
使用前将所有试剂和样品置于室温下。

建议所有的标准品、对照品和样品都要重复检测
1.按照上文指示，准备试剂、样品和标准稀释物。

2.从板框中取出多余的微孔板条，将其放入含有干燥剂的箔袋中，并重新密封。

3.每孔加50 μL稀释剂RD1-63。

4.每孔加50 μL标准品、对照品或样品。

用提供的密封膜覆盖。

轻轻拍打板框搅拌1分钟
（微孔板振荡器震荡1min）。

室温孵育2小时。

记录好加样顺序。

5.拍掉孔中液体，洗涤，重复这个过程四次，总共洗涤五次。

使用喷瓶、分配器或自动清
洗器将400 μL的洗涤液灌满每孔进行清洗。

每一步都要完全去除孔内液体。

在最后一次清洗后，通过抽吸或拍板除去任何剩余的洗涤液。

把酶标板倒过来，用干净的纸巾吸
干。

6.每孔加入100ul小鼠TNF-α偶联物。

用新的封板膜覆盖，室温孵育2h。

7.重复步骤5的洗涤步骤。

8.避光！每孔加100 μL底物溶液。

室温避光孵育30分钟。

（底物显色试剂A和B按等
体积混合应在15分钟内使用。

避光放置。

）
9.每孔加终止液100 μL。

轻拍酶标板（微孔板振荡器），确保充分混匀。

10.使用设置为450 nm的酶标仪，在30分钟内测定每孔的光密度。

如果波长校正可用，则
设置为540 nm或570 nm。

如果波长校正不可用，从读数450nm减去读数在540 nm或570 nm的吸光值。

这种减法将纠正板上的光学缺陷。

直接在450nm读数没有校正可能造成结果偏高而不准确。