木质纤维素的发酵研究

Abstract
With the advent of energy crisis, the global environmental pollution is increasingly serious, we need to seek new sources of energy to replace oil. Biological fuel ethanol and butanol as a new type of biological energy were to be attention and research. In the past, the research on biological fuel ethanol and butanol on the starch, honey and other food crops to fermentation. With the advent of the world food crisis,We need to choose renewable resource as an object of fermentation to ease food crisis. Lignocellulose is the most abundant renewable resources in the world, After pretreatment, hydrolysis of lignocellulose, generation of reducing sugars that can be utilized by microbial fermentation, in order to produce ethanol and butanol. So it can ease the energy crisis and food crisis,it can make use of lignocellulose resource.
This topic uses lignocellulose (smashed straw) as raw materials. The content was that analysed the composition of the raw material, and the discussion cellulose enzyme hydrolysis conditions, it choose appropriate hydrolysis conditions, and then it proceed microbial fermentation. The topic selected yeasts and acetone butanol carboxylic acid bacteria for ethanol and butanol fermentation.Through detoxification treatment increase the fermentation product.It mainly consists of the following parts.
Part 1, To analyze the composition of the raw material composition. Lignocellulose is mainly composed of cellulose, hemicellulose and lignin of three parts, pretreatment method is different, material is different, the content of these three components are also different. Ultrafine comminution of rice which contains cellulose of 24.8%, hemicellulose contains 21%, and acid detergent lignin contains 10.9%.
Part 2, To explore the optimal hydrolysis conditions of Cellulase. The single factor experiment was conducted to research the influence of substrate concentration, temperature, pH, and enzyme-substrate on enzymatic hydrolysis,so as to confirm the best condition for single factor experiment. We get a result by choosing orthogonal experiment, combined with the impact of the subsequent fermentation, the optimum hydrolysis conditions is temperature of 50 ℃, pH 5, and substrate concentration was 10%, and the hydrolysis time was 24h,and the ratio of enzyme to substrate was 6%.
Part 3, The fermentation of fuel ethanol. It conditions a result through the single factor
experiments of yeast cells fermentation,The best conditions of yeast cells fermentation was that temperature is 30, inoculation quantity is 9mL, the growth of yeast pH is 5, fermentation time is 48 hours.To increase the concentration of reducing sugars by concentration, the fermentation results was that inhibitor concentration increased in the concentrated solution, which it effects of microbial growth, so it can hindered the yeast fermentation,Although the sugar utilization increased by 10%, and the ethanol yield was down 18.7%.The maximum yield of ethanol was 2.17g through detoxification treatment, the theoretical yield was 2.4g, the yield reached 90%, in which the best effect was activated carbon.
Part 4, It researched butanol fermentation. Acetone butanol carboxylic acid bacteria is strict anaerobic microbes, it needs to manufactue anaerobic environment by filling nitrogen. Directly to butanol fermentation, butanol yield is only 4.7 g/L, ABE total volume was 8.14 g/L, butyl alcohol conversion rate is 12%, sugar total solvent conversion rate was 21.9%. After detoxification treatment, solvent butanol yield and total solvent yield were improved. When used the method of 0.1% sodium sulfite, butanol yield was 6.11 g/L, ABE total volume was 9.24 g/L, butyl alcohol conversion rate increased to 17%, total sugar fluxing agent conversion rate was 25.7%. Activated carbon processing, butanol production was 7.86 g/L, total solvent was 14.12 g/L, butyl alcohol sugar conversion rate increased to 19.9%, sugar total solvent conversion rate was 30.8%.
The rate of sugar use can reach 90% in ethanol fermentation, The rate of sugar use can reach73% in butanol fermentation, biological ethanol fermentation on the utilization rate of lignocellulose was high.
Key Words: Cellulose;Hydrolysis;Ethanol fermentation;Butanol fermentation
目 录
摘要 (I)
ABSTRACT (III)
1引言 (1)
1.1国内外的燃料发展概况 (1)
1.1.1国内外燃料乙醇发展概况 (1)
1.1.2国内外丁醇发展概况 (2)
1.2木质纤维素的预处理方法 (3)
1.2.1物理法 (4)
1.2.2化学法 (5)
1.2.3生物法 (6)
1.3木质纤维素的水解 (6)
1.3.1稀酸水解 (6)
1.3.2浓酸水解 (7)
1.3.3酶水解 (8)
1.4原料预处理过程中抑制物的形成 (9)
1.4.1弱酸类 (10)
1.4.2呋喃醛类化合物 (11)
1.4.3酚类化合物 (11)
1.5木质纤维素水解液中的抑制物以及脱毒方法 (11)
1.6纤维素的糖化和发酵 (12)
1.6.1同步糖化发酵工艺（SSF） (12)
1.6.2分步糖化发酵工艺（SHF） (13)
1.6.4同步糖化共发酵工艺（SSCF） (13)
1.6.5固定化细胞发酵工艺（CBP） (14)
1.7丁醇发酵 (14)
1.7.1丁醇的性质及应用 (14)
1.7.2生产丁醇的菌种及其改良 (15)
1.7.3丙酮丁醇羧酸菌的代谢机理 (16)
1.7.4发酵工艺的研究进展 (17)
1.8研究的目的、意义和技术路线 (18)
1.8.1研究目的和意义 (18)
1.8.2技术路线 (19)
2纤维素原材料的分析 (20)
2.1材料与方法 (21)
2.1.1试剂与仪器 (21)
2.1.2试剂的配制 (22)
2.1.3 Van Soest法测定纤维素 (23)
2.1.4凯氏定氮测定氮含量 (24)
2.1.5原子吸收测定离子元素 (24)
2.1.6水分、灰分的测定 (24)
2.2结果与分析 (24)
2.2.1纤维素测定结果 (24)
2.2.2其他成分测定结果 (25)
2.2.3主要成分含量表 (25)
2.3结论 (25)
3纤维素水解条件的探讨 (27)
3.1材料与方法 (27)
3.1.1试剂与仪器 (27)
3.1.2试剂配制 (27)
3.2试验方法 (28)
3.2.1还原糖的测定方法 (28)
3.2.2还原糖的标准曲线制作 (28)
3.2.3还原糖的测定 (28)
3.3结果与分析 (28)
3.3.2 木质纤维素水解液中色素浓度对糖测定结果的影响 (30)
3.3.3温度对酶解过程的影响 (30)
3.3.4 pH对酶解过程的影响 (31)
3.3.5 底物浓度对酶解过程的影响 (31)
3.3.6 酶底比对酶解过程的影响 (32)
3.3.8 正交实验结果 (34)
3.4结论 (35)
4燃料乙醇发酵 (36)
4.1材料与方法 (37)
4.1.1试剂与仪器 (37)
4.1.2菌种的制备 (37)
4.1.3发酵材料 (38)
4.1.4发酵液的制备 (38)
4.1.5DNS法测还原糖 (38)
4.1.6气相色谱法测定乙醇 (38)
4.1.7脱毒方法 (39)
4.2结果与分析 (39)
4.2.1乙醇标准曲线 (39)
4.2.2温度对酵母发酵的影响 (39)
4.2.3pH对酵母发酵的影响 (40)
4.2.4接种量对酵母发酵的影响 (41)
4.2.5发酵时间的影响 (41)
4.2.6发酵结果 (42)
4.2.7脱毒处理后发酵的结果 (43)
4.3结论 (44)
5丁醇发酵 (45)
5.1材料与方法 (46)
5.1.1试剂与仪器 (46)
5.1.2菌种制备 (46)
5.1.3种子液的制备 (46)
5.1.4发酵材料 (47)
5.1.5维生素混合液 (47)
5.1.6丁醇发酵方法 (47)
5.1.7还原糖测定法 (47)
5.1.8ABE溶剂的标准曲线 (47)
5.2结果与分析 (48)
5.2.1丙酮、丁醇、乙醇的标准曲线 (48)
5.2.2丁醇直接发酵结果 (49)
5.2.3脱毒处理后丁醇发酵结果 (50)
5.3结论 (50)
参考文献 (52)
攻读硕士学位期间发表论文及科研成果 (60)
致谢 (61)
1引言
随着社会的发展和经济的增长，能源的需求量越来越大，而世界上大部分国家消耗的能源来自化石能源，化石能源是不可再生资源，早晚有枯竭的时候，而且会导致NO X、SO2等有害气体以及CO2、甲烷等温室气体排放，所以对环境友好的可再生资源的开发显得日益重要。

能源问题已经成为全社会关注的问题，因此需要寻求新的能源来缓解能源危机[1]。

燃料乙醇和丁醇作为新型的、无污染的、可再生的新能源被许多国家关注和接受。

燃料乙醇属于优质的液体燃料，不仅可以直接代替汽油、柴油等石油燃料，也是一种工业化的民用燃料或内燃机燃料，被称为最具发展潜力的石油替代燃料[2]。

丁醇不但能作为工业的重要原料，也能作为液体燃料。

丁醇是四碳化合物，其燃烧释放的热值比乙醇更接近于石油，因此丁醇适合作为液体燃料。

燃料乙醇的生产主要是以糖类和淀粉类的粮食作为原料，随着新一轮世界粮食危机的到来，以粮食来生产燃料乙醇已经称为一种问题。

全世界每年由光合作用产生的木质纤维素含量高达1550亿吨，被利用的仅为2%，大部分木质纤维素都没有被利用，可利用空间很大，木质纤维素是最廉价、最丰富的可再生资源[3]。

我国的纤维素原料也十分丰富，仅农作物秸秆和皮克每年能产生约7亿吨，主要是三大秸秆资源，玉米秸(35%)、小麦秸(21%)和稻草(19%)[4]。

用于丁醇发酵的丙酮丁醇羧酸菌可以利用许多种碳水化合物，不仅能够利用几糖、戊糖，还能利用淀粉、木聚糖等，而以木质纤维素为发酵底物的还比较少，但丙酮丁醇羧酸菌不能直接利用纤维素作为丁醇发酵底物，纤维素水解后生成葡萄糖和木糖，所以利用秸秆等生产丁醇具有广阔的前景。

木质纤维素的生物燃料加工的基本流程是：原料的预处理，纤维素的酶解，糖的微生物发酵。

1.1国内外的燃料发展概况
1.1.1国内外燃料乙醇发展概况
跨入21世纪后，石油的价格攀升为发展新燃料提供了动力和空间，全球的生物能源大概有800亿升，主要的生产国有巴西、美国、加拿大以及欧盟，占总量的90%以上，生物能源的增长已经成为一种必然的趋势，联合国粮农组织预测,全球的生物能源总量将在2015年达到1200亿升[5-6]。

燃料乙醇的使用开始于巴西国家，1973出现第一次世界石油危机，巴西为代替价格
昂贵的进口石油，利用本国丰富的甘蔗资源开始生产燃料乙醇，燃料乙醇计划实施几十年来，巴西的燃料乙醇总产量已超过汽油消耗的1/3，是世界上唯一不使用纯汽油作为燃料的国家，巴西的燃料1999年巴西燃料乙醇的产量约1300万KL，除自用外还有少量出口，2008年巴西的乙醇产量创历史新高，达到264.5亿升[7]。

美国在2005颁布的“新能源法案”使得美国的燃料乙醇发展迅速，成为世界上最大的用谷物生产燃料乙醇的国家，同时也提出了将在2014年12月31日以后禁止在汽油中使用MTBE这种化工产品，在政府的支持倡导下，美国的燃料乙醇从2001年至2005年翻一翻，2007年产量到257.89亿升，生产主要以玉米为原料[8]。

世界上第一座准商业级的纤维乙醇生产装置于2004年在加拿大的渥太华建立，该装置可每天处理40吨的生物质原料，经过酶催化将木质纤维素变成葡萄糖，用于发酵生产乙醇，每年可生产0.3万吨乙醇[9]。

Abengoa生物能源公司在西班牙建设了世界上第一家真正商业化的生物乙醇工厂，该工厂每天可消耗70吨的生物质原料，生产能力为0.5万吨/年，在利用该厂的基础设施上，Abengoa生物能源公司又在附近建设了一座生产能力达19.5万吨／年的乙醇生产厂，Abengoa生物能源公司是世界上第二大乙醇生产商[10]。

我国生产燃料乙醇起步比较晚，但是发展的比较快，其中设备先进的燃料乙醇项目有黑龙江华润乙醇有限公司(现中粮公司)、吉林燃料乙醇有限责任公司、安徽丰原生物化学股份有限公司和河南天冠集团，这四家燃料乙醇定点厂总生产能力达到102万吨／年[11]。

2007年12月22日，中粮集团在广西合浦工业园区正式投产建设年产20万吨燃料乙醇项目，这是我国迄今为止唯一投入生产的非粮燃料乙醇项目。

2008年，我国燃料乙醇总产量居世界第三位，达到19.6亿升，其主要生产原料是陈粮和木薯等。

预计到2020年，我国生物燃料将占到全部交通燃料消耗量的15%左右，建立了具有较强国际竞争力的生物燃料产业 [12]。

1.1.2国内外丁醇发展概况
目前丁醇在全世界的产量超过200万吨，丁醇在代替燃料方面比乙醇具有更好的性能[13]，首先丁醇含有的热量比乙醇高25%，与汽油接近；其次丁醇的燃点比乙醇高，更安全；再次丁醇比乙醇更好的与汽油和柴油混合；最后丁醇的腐蚀性比较小，易于运输，可以直接运用于汽车。

因此丁醇是一种极具有潜力的新型燃料，利用秸秆等木质纤维素原料发酵生产丁醇具有广阔的应用前景[14-15]。

丙酮-丁醇的发酵历史比较长，第一次世界大战期间，由于军火需要丙酮，因此丙酮-丁醇发酵成为当时最大的发酵产业，19世纪20年代，开始萎靡，第二次世界大战时，丁醇为军用战机提供燃料由带动了丁醇的发展。

随着战争的结束，石油工业的发展，丙
酮-丁醇发酵开始遭到淘汰，近年来随着石油消耗，资源短缺，环境污染，全球都在寻找新的能源来缓解。

丁醇作为燃料的优势注定了丁醇发酵产业的发展，使之成为仅次于燃料乙醇的第二大生物质燃料发酵[16]。

我国从1945底就开始生产丁醇，1958年后我国各省都开始以玉米、山芋、糖蜜、大米等原料生产丁醇。

如河南天冠燃料乙醇有限公司、华北制药集团有限责任公司都重新开始了对丙酮、丁醇的发酵研究。

华北制药集团有限责任公司在2008年4月23日已通过《华北制药集团有限责任公司非粮发酵制造生物丁醇高技术产业化示范工程项目》的报批备案，项目建成后将形成年产10万t生物丁醇的规模，总投资7.5亿元，建设期限为2008年3月1日至2010年9月1日[17]。

1914年英国建立了第一座丙酮发酵工厂，当时主要以丙酮为产物，第一次世界大战后，杜邦公司开始开发丁醇，1945年，美国开始开发糖蜜发酵丙酮、丁醇的项目。

2006年6月杜邦公司与英国石油公司、英国糖业公司合作开发燃料丁醇项目，协议计划于2007年将新一代生物燃料丁醇推向市场，掀起了丁醇研究的新一轮高潮[18]。

1.2木质纤维素的预处理方法
在木质纤维素中木质素紧紧包裹着纤维素和半纤维素，形成复杂的网状结构，因此水解比较困难，对原料进行预处理可以破坏纤维素分子的保护层和结晶结构，降低木质素的聚合度，提高木质纤维素的多孔性．增加酶与底物的接触面积，从而提高酶解的效率。

木质素预处理的原理[19]如图1.1所示： 一般的预处理
图1.1木质纤维素原料预处理示意图
Fig1.1 Pretreatment of lignocellulosic materials processing schematic diagram
可以水解半纤维素、木质素、降低纤维素的结晶度并增加孔隙度，同时会产生影响后续微生物发酵的抑制物。

预处理必须满足的条件：（1）有利于提高糖的产量并有助于水解；（2）避免产生对水解和发酵过程有抑制作用的副产物；（3）减少碳水化合物的损失和降解；（4）具有经济性[20-21]。

常见的预处理方法有化学法、物理法、物理化学法和生物法。

1.2.1物理法
物理法包括机械粉碎，蒸汽爆破，高温热解，微波或者超声波，高能电子辐射等。

这些方法都能降低结晶度，提高水解效率[22]。

1.2.1.1机械粉碎法
机械粉碎主要包括干法粉碎、湿法粉碎、振动球磨碾磨以及压缩碾磨，通过机械削切和研磨分别将木质纤维处理成粒径为l0-30mm和0.2-2.0mm的颗粒。

可有效降低木质纤维素的结晶度和消化效率[23],但是能耗大，成本比较高，一般不采用这种方法。

1.2.1.2蒸汽爆破法
蒸汽爆破法是目前应用最广泛地预处理方法，通过高压饱和蒸汽溶解的木质纤维素瞬间降压，破坏纤维素的结构，使半纤维素降解，纤维素溶解性增加，木质素转化。

低温长时和高温短时处理都可增加半纤维素的溶解率。

物料粒径、反应时间、蒸汽温度等是影响蒸汽爆破预处理的主要因素。

高温短时停留(270℃，l min)和低温长时停留(190℃，l0 min)都有利于半纤维素溶解以及水解。

蒸汽爆破法过程中会生成后续酶水解和发酵的抑制物，因此需用水洗掉这些副产物。

1.2.1.3微波、超声波、高能电子辐射
微波处理主要是使分子间的氢键发生变化，可提高纤维素的反应活性和可及性，能够得到较高浓度的糖化液，且所需时间短，操作简便，但费用高难于实施工业化应用。

超声波主要能够打开纤维素的结晶区，能够分解木质素大分子，提高纤维素的化学反应性能，同时会降解半纤维素，使纤维素的表面积下降，不利于酶水解。

高能电子辐射可降低纤维素的聚合度，分子的分布特性改变，会影响纤维素的晶体结构，使其活性增加，有利于酶水解。

由于这几种方法虽然操作简单，时间短，但是设备投资费用比较高，难于工业化。

1.2.1.4热解
热解是液态的热水进行预处理，是指200℃-230℃的高压水与原料混合处理15min，高温可使木质纤维素中的半缩醛键断裂，提高酶的水解效率。

热水预处理对原料的粒径没多大要求，也不需要加酸或碱，减少了后续处理的成本和无污染问题，且半纤维素转
化为糖的收率很高，可达到88%-98%。

但是容易产生糠醛类的微生物发酵抑制物。

1.2.2化学法
化学法是用酸、碱或有机溶剂处理木质纤维素的方法，主要是破坏其结晶结构，使其溶解并讲解生成多种产物，如葡萄糖、纤维二糖、纤维糊精和葡聚糖等。

1.2.2.1酸预处理法
常用的酸有盐酸、硫酸、硝酸、磷酸，酸处理应用最广泛地是稀硫酸处理法，其浓度是0.5%-1.0%，条件比较温和，木质素原料的颗粒大小为1mm左右，与稀酸混合均匀，加热到190℃，时间比较短，为几分钟。

经稀酸处理后纤维素的平均聚合度会降低，提高水解率。

稀酸处理后可形成的木糖在高温下会进一步降解生成糠醛。

六碳糖则会降解形成5-羟甲基糠醛，两者会生成甲酸。

由于木糖的降解会影响糖的得率，也会抑制后续的发酵，需要采用过饱和的氢氧化钙或者离子交换来进行脱毒处理，另外稀酸处理还需要耐腐蚀的材料设备。

脱毒也要消耗大量的化学试剂，同时由于酸碱中和，也会增加盐类的成分和含量，影响发酵。

浓酸水解虽然可以有效的水解纤维素，但是具有毒性和腐蚀性，对材料的要求比较严格，并且还需要进行酸回收试验，因此不怎么采用此种方法。

浓磷酸是纤维素的一种溶剂，反应时的温度也比较低，也可作为催化剂，而且没有抑制作用。

1.2.2.2碱预处理法
碱预处理法的机理是木质素能够溶解在碱溶液中，随着木质素的去除，物料的渗透性就会增加。

经过碱处理后，物料的表面积会增加，结晶度和聚合度降低，木质素的结构被破坏。

碱预处理的效果取决于木质素含量的多少，当木质素含量达到20%时，碱处理对后续的酶水解率影响不大，常用的碱性溶液有NaOH、Ca(OH)2、KOH和氨等。

稀NaOH预处理主要是使纤维素润胀，增加内表面积，使木质素与碳水化合物之间的结构链分离，破坏木质素的结构，是目前使用最广泛地方法[24]。

deVrije等用碱在70℃预处理芒属再进行酶水解，木质素去除率达77%、纤维素水解率超过95%、半纤维素水解率44%[25]。

氨也可去除木质素，用氨处理的优点是条件比较温和，设备简单，对纤维素和半纤维素的破坏小，也不会产生后续发酵的抑制物，缺点是成本比较高。

虽然碱预处理的效果比较好，但在处理过程中，会有部分半纤维素损失，所需碱量比较大，还存在中和、回收洗涤等一系列问题，不适合大规模的生产。

1.2.2.3有机溶剂法
有机溶剂可破坏纤维素和半纤维素之间的链接键，引起纤维素的润胀，常用的有机
溶剂有丙酮、甲醇、乙醇、三甘醇等，乙酸或水杨酸等有机酸在有机溶剂处理中也有催化剂的作用，但是有机溶剂易腐蚀和有毒，且污染环境，需要回收。

1.2.3生物法
由于生物法是利用白腐菌、褐腐菌等真菌降解木质素和半纤维素等，对环境无污染，降解效率高，周期短，可再生，成本低等特点，被认为是最有前途的处理方法。

主要是利用真菌产生的木质素分解酶系来降解木质纤维素。

陈合等[26]采用黄孢原毛平革菌同体发酵去除秸秆中的部分木质素。

再添加外源纤维素酶、木聚糖酶降解纤维素和半纤维素。

经过25d发酵降解以及6d的酶解，使秸杆中的纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别达到60.4%、33.0%和67.0%。

1.3木质纤维素的水解
木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，三种成分的质量分数占到80%-90%左右。

纤维素性质比较稳定，只有在特殊情况下才能被显著的水解。

主要是酸水解工艺和酶水解工艺，其中酸水解又分为稀酸水解和浓酸水解[27]。

1.3.1稀酸水解
稀酸水解是指用10%以内的酸作为催化剂，水解纤维素和半纤维素的过程。

稀酸水解的反应条件比较高，温度一般在100-240℃，压力高于10个大气压的条件下进行的。

稀酸水解的原理是纤维素分子中的β-1,4糖苷键断裂释放出氢离子，实现纤维素长链的连续降解，进而分解成最小单元的葡萄糖[28]。

稀酸水解主要以无机酸为主，常用的有盐酸、硫酸和磷酸。

影响稀酸水解的主要因素有原料的粉碎程度、固液比、温度、时间以及酸的种类和浓度等。

其主要优点在于半纤维素水解的糖量比较大、反应进程快、催化剂的成本低、适合连续的生产，酸液可以不用回收等，但是需要的温度和压力比较高，能耗多，对设备的要求比较苛刻，糖的转化率相对比较低，一般为50%左右，副产物比较多，会影响后续的发酵工作[29-30]。

纤维素类的稀酸水解多采用两步工艺，第一步用低浓度的稀酸和的低温，将半纤维素水解，主要生成戊糖，第二步用较高的酸浓度和温度水解纤维素，主要生成葡萄糖。

这两步工艺可以分开收集纤维素和半纤维素的水解产物，提高了糖的转化率，增加了产物浓度，也降低了后续的乙醇发酵的能耗和装置费用，同时也方便两种产物的单独使用[31]。

90年代以来，极低浓度酸水解、高压热水法因环境友好、对反应器的材料要求低而受到关注。

极低浓度酸水解指用0.1%以下的酸进行水解，但是要求温度较高，通常
在200℃以上。

其优点在于对设备的腐蚀性比较小，中和发酵液产生的盐比较低，对环境的污染比较小。

高压热水法指完全以液态的水来水解半纤维素，通常可以作为二步水解法的预处理，其原理是高温高压下水分子分解成氢离子和氢氧根离子，因此具备酸碱催化功能，可以使半纤维素水解，优点是发酵抑制物的含量低，成本低，木糖的回收率高[32]。

1.3.2浓酸水解
浓酸水解的原理是较低温度下，结晶纤维素溶于42%的盐酸、72%的硫酸或77%-83%的磷酸溶液中，转化成含几个葡萄单元的低聚糖[33]。

浓酸水解中最常用的是浓硫酸水解，目前美国的Arkenol公司，Masada resource group 和TVA对这方面有研究。

Arkenol公司的浓酸水解流程示意图如图1.2所示[34]。

图1.2Arkenol公司浓酸水解流程图
Fig1.2 Concentrated acid hydrolysis of Arkenol company
采用两级浓酸水解工艺，经离子交换法将水解得到的糖和酸的混合液分为净化糖液和酸液，糖液中含有的少量酸用石灰石中和，生成的沉淀可在沉淀槽和离心机里分离，分离得到的稀硫酸经过处理可以回到水解工艺中再次利用。

Arkenol
公司的该工艺可以得到12-15%浓度的糖液，纤维素的转化率为70%，甚至可达到80%，
酸的回收率也有97%[35]。

TVA的水解工艺是：将玉米废弃物与10%硫酸混合，在第一个反应器中以100℃加热2-6h处理半纤维素，残渣在水中多次浸泡并弄干，收集半纤维素水解产物；残渣烘干后在30%-40%浓酸中浸泡1-4h，作为纤维素水解的预步骤；残渣干燥后放在第二个容器中，使酸的浓度增大到70%，100℃下加热l-4h，过滤得到糖和酸的混合液。

然后将该溶液循环到第一个反应器中水解，从中回收第二步水解的糖[36]。

浓盐酸水解木质纤维素主要采用盐酸气催化水解，其工艺步骤为：将原材料磨碎，然后用少量3%-5%的硫酸处理，目的是去除半纤维素，水洗干燥，用38%的盐酸浸泡，然后在浓度为40%的盐酸中水解（通入盐酸蒸汽达到），蒸馏回收盐酸。

用水逆向抽提含有少量盐酸的糖液，得到糖液的浓度约为40%。

在该工艺中水解温度低，且酸也容易回收，但糖化率比较低。

盐酸水解工艺的重大缺陷就是设备易腐蚀，针对设备腐蚀问题，目前主要采用耐酸高分子材料作为衬底。

浓酸水解的反应条件一般是100℃以内，常压下水解2-10h，其糖的转化率比较高，能够达到90%以上，但是反应速度比较慢，对设备的腐蚀比较严重，酸液回收成本高，而且对环境的污染比较严重。

1.3.3酶水解[37-43]
纤维素酶是将木质纤维素水解成葡萄糖单体的一类酶的总称，一般包括三种，即内切型β-葡聚糖酶（EG或C X），外切型β-葡聚糖酶（CBH或C1）和纤维二糖酶（CB 或GE），一般认为，纤维素的水解要靠这三种酶的协同作用才能完成。

但是具体的各组分如何作用，持有不同看法，目前公认的有两种，一种是协同降解，如图1.3所示。

图1.3纤维素酶对纤维素的协同降解作用
Fig1.3The model of cellulose hydrolysis by cellulose enzymes
内切型葡聚糖酶主要是随机分解纤维素分子内部β-1,4糖苷键，产物是纤维素糊精。

C X虽然能够水解部分降解的纤维素，但不能单独作用于结晶纤维素。

外切型葡聚糖酶能够结合C X产生的非还原性末端上水解产生的纤维二糖。

C1同内切葡聚糖酶协同作用时，结晶纤维素可完全水解，但单独作用的活力较低。

纤维二糖酶能水解短链的纤维寡糖和纤维二糖。

水解速度会随着寡糖中葡萄糖单元含量的增加而下降。

酶水解纤维素时，C X在非结晶区就能单独完成，C X和C1的协同作用才能水解结晶区。

因此，水解纤维素的过程中C1和C X的比值对酶活力有显著影响，而CB组分的加入会大大增强协同作用。

第二种观点是首先由CBH水解，生成可溶性的纤维糊精或二糖，然后再由EG作用于纤维糊精，生成纤维二糖，再由CB将二糖分解为两个葡萄糖。

如图1.4所示。

在酶水解中，纤维素酶不可逆的吸附在纤维素的孔隙中，会使纤维素酶发生钝化，使其活性逐渐降低，造成水解速度下降。

非离子型表面活性剂的添加能增加酶的水解速度，提高纤维素的转化率。

2003年，Alkasrawi测试了非离子型表面活性剂Tween-20对云杉酶水解的影响，添加Tween-20的质量浓度为2.5g/L，结果乙醇产率提高了8%，水解速率提高33%，而酶用量下降了50%[44]。

图1.4纤维素酶水解纤维素的可能途径
Fig1.4The possible pathway of cellulose hydrolysis by cellulose enzymes
1.4原料预处理过程中抑制物的形成
木质纤维素的结构与组成比较复杂，需要对原料进行预处理步骤，目前研究的预处理方法主要有机械粉碎法，酸碱处理法，生物法等。

各种不同的预处理方法都会产生抑。