酶的固定化

3.扩散限制效应
酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产 生了扩散阻力：
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外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过
程中的一种扩散限制效应，发生在固定化颗粒周围的液膜
层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅 拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。
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内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到
缺点：
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固定化时，酶活力有损失； 增加了生产的成本，工厂初始投资大； 只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物， 与完整的菌体相比不适于多酶反应，特别是需要辅 胞内酶必须经过酶的分离手续。
对大分子底物不适宜；
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助因子的反应；
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三、影响固定化酶性质的因素
分配效应 空间障碍效应 扩散抑制效应
在具体选择时，一般应遵循以下几个原则：
（1）必须注意维持酶的构象, 特别是活性中心的构象。
（2）酶与载体必须有一定的结合程度。
（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。 （4）固定化酶应有最小的空间位阻。 （5）固定化酶应有最大的稳定性。 （6）固定化酶的成本适中。
1.吸附法
吸附法（Adsorption） 是通过载体表面和酶分子 表面间的次级键相互作用 而达到固定目的，是固定 化中最简单的方法。只需 将酶液与具有活泼表面的 吸附剂接触，再经洗涤除 去未吸附的酶便能制得固 定化酶。
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1.分配效应
由于载体和底物的性质 差异引起了微环境和宏观 环境之间的性质不同。微 环境是在固定化酶附近的 局部环境，而将主体溶液 称为宏观环境。由这种不 同造成的底物、产物和各 种效应物在两个环境之间 的不同分配，被称为分配 效应。
2.空间障碍效应
固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体 的空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部 位造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易于底物或 效应物接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作 用,所造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间 障碍效应。
酶活性部位时的一种扩散阻力，它与催化反应同时进行。
载体小而弯曲的细孔是产生内扩散阻力的原因。因 此使用低分子量底物，小的粒径、载体孔尽可能大而直且 互相连通，或将酶固定在载体表面都可以降低这种内扩散 阻力。
四、酶的固定化方法
主要可分为四类：吸附法、包埋法、共价键结合法和交 联法等。吸附法和共价键结合法又可统称为载体结合法。
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4、交联法
交联法（Cross-linking） 是使用双功能或多功能试 剂使酶分子之间相互交联 呈网状结构的固定化方法。
5.四种固定化酶制备方法的特点小结
物理吸附 制备 结合力 酶活力 底物专一性 再生 固定化费用 包埋法 共价结合 法 共价交联 法
易
易 强 高 无变化
难
强
难
强弱Βιβλιοθήκη 高 无变化 可能酶的固定化及应用研究已得到长足进展，开发新型
固定化技术、改进传统固定化方法和注重天然高分子载 体改性是酶固定化研究的主要趋势，生物学及生物工程、 医学及生命科学乃是固定化酶应用的重要场合，适于化 学化工及环境科学领域应用的固定化酶具有生态环境材
料的鲜明特征、应给予足够重视，打破部门限制，减少
低层次重复、建立基础研究、技术研究及应用研究三位 一体的协作机制，将是众多固定化酶研究成果转化为高 新技术产业的重要保证，这也是社会经济可持续发展的 客观要求。
酶的固定化
Enzyme Immobilization
固定化酶定义
固定化酶(Immobilized enzyme)，是指在一定的空间 范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶，而且反应 后的酶可以回收重复使用。
一、固定化技术的发展简史
1953年，Grubhofev和Schleith首先开始了酶固定化 研究，并第一次实现了酶的固定化。 1960年，日本的千畑一郎开始了氨基酰化酶固定化研究，开 始了将固定酶应用在工业上的第一步。 1969年，千畑一郎成功地将氨基酰化酶反应用于DL-AA的光 学分析，实现了酶连续反应的工业化。这是世界上固定化 酶用于工业的开端。 1973年，千畑一郎再次在工业上成功地固定化大肠杆菌细胞， 成功实现了L-天冬氨酸连续生产
2.包埋法
包埋法（Entrapment）
是将酶包埋在高聚物的细 微凝胶网格中或高分子半 透膜内的固定化方法。前 者又称为凝胶包埋法，酶 被包埋成网格型；后者又 称为微胶囊包埋法，酶被 包埋成微胶囊型。
3.共价结合（偶联）法
共价结合法(Covalent binding）是目前研究中 最为活跃的方法。它的原 理是酶蛋白分子上的功能 基团和固相支持物表面上 的反应基团之间形成共价 键，因而将酶固定在支持 物上（借助共价键将酶的 非活性必需侧链基团和载 体的功能基团进行偶连）。
1986年，我国科学家利用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸 酶和葡萄糖氧化酶等相继获得成功。
二、固定化酶的优缺点
优点：
有一定的机械强度且稳定性好，催化剂与系统分相。
固定化酶在使用前可充分洗涤，不带进杂质，在反应中
酶与产物自然分开，所以产物易提纯，收率也高。 酶与细胞经过固定化以后，稳定性大为提高，可较长期 使用与储藏，并可以再生。 能反复使用，可大大降低生产成本；同时也为实现生产 的管道化、连续化与自动化提供了可能
中
中
有变化 有变化
高
不可能 不可能 不可能 中 中
低
五、小结
目前，固定化技术已经取得了许多重要成果，充分发 挥了固定化酶和固定化细胞在改革工艺和降低成本方面的 巨大潜力。但从目前的发展状况来看，尽管酶种类繁多，
但已经固定化的酶却相对有限，采用固定化酶技术大规模
生产的企业尚属少数，真正在工业上使用的固定化酶还仅 限于葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等为数 不多的十几个酶种，故仍需大力研究开发使更多的固定化 酶和细胞能适用于工业规模生产。