质粒提取的原理操作步骤各溶液的作用

质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。

各类质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情形下可持续稳固地处于染色体外的游离状态，但在必然条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞割裂传递到后代。

质粒已成为目前最经常使用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可取得大量纯化的质粒DNA分子。

目前已有许多方式可用于质粒DNA的提取，本实验采纳碱裂解法提取质粒DNA。

碱裂解法是一种应用最为普遍的制备质粒DNA的方式，其大体原理为：当菌体在NaOH和 SDS 溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方式一般是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。

例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平稳离心、离子互换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方式，但这些方式相对昂贵或费时。

关于小量制备的质粒DNA，通过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可知足细菌转化、DNA 片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中经常使用。

一、试剂预备
1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH ，10mM EDTA(pH ）。

1M Tris-HCl<!--[if !supportAnnotations]--><!--[endif]--> (pH ）， EDTA（pH ）10ml，葡萄糖，加ddH2O至500ml。

在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。

任何生物化学反映，第一要操纵好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。

50 mM 葡萄糖最大的益处只是悬浮后的大肠杆菌可不能快速沉积到管子的底部。

因此，若是溶液I中缺了葡萄糖其实对证粒的抽提本身而言，几乎没有任何阻碍。

因此说溶液I中葡萄糖是可缺的。

EDTA呢？大伙儿明白EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的要紧作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。

在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非确实是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。

若是不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只若是在不太长的时刻里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。

若是哪天你手上正好缺了溶液I，可不能够抽提质粒呢？实话告知你，只要用等体积的水，或LB培育基来悬浮菌体就能够够了。

NaOH也使DNA变性，但只是个副产物，在溶液3加入后其中的醋酸和NaOH中和，质粒
DNA恢复活性
2. 溶液Ⅱ： NaOH，1% SDS。

2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。

利用前临时配置<!--[if !supportAnnotations]--><!--[endif]--> 。

这是用新鲜的 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后利用的。

要新从浓NaOH稀释制备的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。

很多人不明白其实破细胞的主若是碱，而不是SDS，因此才叫碱法抽提。

事实上NaOH是最正确的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌仍是哺乳动物细胞，碰着了碱都会几乎在刹时就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相转变所致使。

用了不新鲜的 N NaOH，即即是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨能够自己试一下），自然就难高效率抽提取得质粒。

若是只用SDS固然也能抽提取得少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点罢了。

很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确明白得一些书上的有关DNA变性复性的描述所致使。

有人不由要问，既然是NaOH溶解的细胞，那什么缘故要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。

这一步要记住两点：第一，时刻不能太长，千万不要这时去接，因为在如此的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必需温柔混合（象对待女小孩一样），不然基因组DNA也会断裂。

基因组 DNA的断裂会带来麻烦。

3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 。

5M KAc 300ml，冰醋酸，加ddH2O至500ml。

4℃保留备用。

溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部份人却不明白这沉淀的本质。

最容易产生的误解是，当SDS碰着酸性后发生的沉淀。

若是你如此疑心，往1%的 SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就明白不是这么回事了。

大量沉淀的显现，显然与SDS的加入有关系。

若是在溶液II中不加SDS会如何呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。

既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会可不能是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发觉SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。

因此高浓度的盐致使了SDS的沉淀。

但如果是你加入的不是NaCl而是KCl，你会发觉沉淀的量要多的多。

这实际上是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）碰到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。

如此看来，溶液III加入后的沉淀事实上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。

大伙儿明白SDS专门喜爱和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部份蛋白质沉淀了，
让<!--[if !supportAnnotations]--><!--[endif]--> 人快乐的是大肠杆菌的基因组DNA 也一路被共沉淀了。

那个进程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并非与DNA分子结合。

那么2 M的醋酸又是什么缘故而加的呢？是为了中和NaOH，因为长时刻的碱性条件会打断DNA，因此要中和之。

基因组DNA一旦发生断裂，只若是50－100 kb大小的片断，就没有方法再被PDS共沉淀了。

因此碱处置的时刻要短，而且不得猛烈振荡，不然最后取得的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳能够观看到一条浓浓的总DNA条带。

很多人误以为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误解，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。

NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性实际上是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。

溶液 III 加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。

4. TE：10mM Tris-HCl(pH ，1mM EDTA(pH 。

1M Tris-HCl（pH ）1ml， EDTA（pH ），加ddH2O至100ml。

15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保留备用。

5.苯酚/氯仿 /异戊醇（25：24：1）
不要以为PDS沉淀的形成绩可以将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能取得质量稳定的质粒DNA，不然时刻一长就会因为混入的DNase而发生降解。

那个地址用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，那个地址做个全面的介绍。

酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，可是水饱和酚的比重略比水重，碰着高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，无益于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后能够增加比重，使得酚/氯仿始终在基层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有专门大的互溶性，若是单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反映（比如限制性酶切反映），因此若是单独用酚抽提后必然要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚那么少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而没必要担忧酶切等反映不能正常进行。

至于异戊醇的添加，其作用主若是为了让离心后上基层的界面加倍清楚，也方便了水相的回收。

6.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）
回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就能够够将质粒DNA沉淀出来。

这时若是放到－20℃，时刻一长反而会致使大量盐的沉淀，这点不同于一般的DNA酒精沉淀回收，因此不要过度警惕了。

高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。

若是感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几回，每次在室温放置一个小时以上，并
用tip将沉淀打坏，就能够取得好的样品。

取得的质粒样品一样用含 RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的.
7. 5×TBE：Tris 碱54g，硼酸，EDTA-Na2·2H2O ，加ddH2O 至1000ml。

15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保留备用。

8．溴化乙锭（EB）：10mg/ml
A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，滚水加热15min，分装后贮存于-20℃。

10. 6×loading buffer（上样缓冲液）：%溴酚蓝，%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。

11. 1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml ×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度μg/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。

缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min 以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液×TBE），即可上样。

二、操作步骤
1. 挑取LB固体培育基上生长的单菌落，接种于 LB（含相应抗生素）液体培育基中，37℃、250g振荡培育留宿（约12-14hr）。

2.取培育物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH ，10mM EDTA(pH ））中，猛烈振荡，使菌体分散混匀，（且不至于沉淀）。

4. 加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，倒置数次混匀（不要猛烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液慢慢变清）。

5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ（醋酸甲AcK），将管温和倒置数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。

溶液Ⅲ为中和溶液，现在质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。

6.加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g × 10min。

没有效PDS沉淀干净的蛋白质置于基层
7.警惕移出上清于一新微量离心管中，加入倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4℃离心12000g×15min。

1.什么缘故用无水乙醇沉淀DNA？
用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最经常使用的沉淀DNA的方式。

乙醇的优势是能够任意比和水相混溶，
乙醇与核酸可不能起任何化学反映，对DNA很平安，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳固存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。

一样实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。

因此也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价钱远远比95％乙醇昂贵）。

可是加95％的乙醇使整体积增大，而DNA在溶液中有必然程度的溶解，因此DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会阻碍收得率。

折中的做法是第一次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要利用无水乙醇。

也能够用倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。

一样在室温下放置15－30分钟即可。

2.在用乙醇沉淀DNA时，什么缘故必然要加NaAc或NaCl至最终浓度达～L？
在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加必然浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于相互聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部份DNA形成DNA钠盐而聚合，如此就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其成效也不行。

在沉淀的DNA中，由于过量的盐杂质存在，阻碍DNA的酶切等反映，必需要进行洗涤或重沉淀
预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。

9. 沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保留备用。

三、质粒DNA的电泳检测
观看琼脂凝胶中DNA的最简单方式是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。

该物质含有一个能够嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，那个基团的固定位置及其与碱基的紧密接近，致使染料与DNA结归并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。

DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身那么在302nm和366nm有光吸收。

这两种情形下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处从头发射出来。

因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即能够检测到少量的DNA。

取制备的质粒DNA 1-2μl，加适当loading buffer混匀上样,采纳 1-5V/cm的电压，使DNA 分子从负极向正极移动至适合位置，掏出凝胶置紫外灯下检测，摄片。

四、注意事项
本裂解法小量制备质粒 DNA重复性好，一样无麻烦。

假设所提取质粒 DNA不能被限制性内切酶切割，可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题
碱法小量制备重组质粒什么缘故用无水乙醇沉淀DNA？
此为实验中最经常使用的沉淀方式。

乙醇的优势是低度极性，能够以任意比例和水相混容，乙醇与核酸可不能起任何化学反映，对DNA很平安，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液时以水合状态稳固存在的DNA，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。

一样实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA 相混合。

其乙醇的最终含量占67%左右。

因此也可改用95%乙醇来代替无水乙醇（因无水乙醇价钱更贵），但加95%乙醇使整体积增大，而 DNA在溶液中总有必然程度的溶解，因此DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，会阻碍收得率。

折衷的做法是第一次沉淀DNA是可用95%乙醇代替无水乙醇，最后的沉淀步骤要利用无水乙醇。

也能够用异丙醇选择性沉淀DNA，一样在室温下放置15~30min 即可。

利用乙醇在低温条件下沉淀DNA，分子运动大大减少，DNA易于聚合而沉淀，且温度越低，DNA沉淀得越快。

碱法小量制备重组质粒，什么缘故将DNA保留于TE缓冲液中？
在基因操作实验中，选择缓冲液的要紧原那么是考虑DNA的稳固性及缓冲液成份不产生干扰作用。

磷酸盐缓冲系统（pKa2=）、硼酸系统（pKal=）等尽管也都符合细胞内环境的生理范围（pH），能够作为DNA的保留液，但在转化实验时，磷酸根将与Ca2+产生沉淀；在DNA酶反映时，不同的煤对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高盐离子浓度，有哦那么要求低盐离子浓度，采纳-HCL （pKa=）的缓冲系统，由于缓冲对时+/，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保留DNA时，多数采纳-HCL系统，而TE缓冲液中的更能稳固DNA的活性。

操作要领：
一、该实验成功的标志是把染色体DNA，蛋白质与RNA去除干净。

取得必然收得率的质粒DNA。

去掉染色体DNA最为重要，也较困难。

因为在全数提取进程中，
只有一次机遇去除染色体DNA，其关键步骤是加入溶液Ⅱ与溶液Ⅲ时，操纵变性与复性操作机会，既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性；又要使染色体DNA不断裂成小片段而能与质粒DNA相分离。

这就要求试剂与溶菌液充分摇匀。

摇动时使劲适当。

一样加入后要注意不能过度使劲振荡，但又必需让它反映充分。

二、当加入溶液Ⅱ5min后，假设没有看到溶液变稠时，实验不能再继续做下去了。

3、配置试剂时，要用重蒸水配置外，其器皿必需严格清洗，最后要用重蒸水冲洗三次，凡能够进行灭菌的试剂与用具都要通太高压蒸汽灭菌，避免其他杂质或酶对DNA的降解，对Ep管、Tip头与非玻璃等只能湿热灭菌，然后放置在50℃温箱中烘干利用。

4、用乙醇沉淀DNA时，要观看水相与乙醇之间没有分层现象以后，才可放在冰箱中去沉淀DNA。

质粒提取中每一步的作用
溶液一：重悬菌体，提供缓冲环境。

溶液二：氢氧化钠和SDS裂解菌体细胞壁、在细胞膜上穿孔，释放细胞内的质粒。

溶液三：中和氢氧化钠、SDS中的钠被钾替换，吸附菌体产生沉淀。

复杂的说：
让咱们先来看看溶液I的作用。

任何生物化学反映，第一要操纵好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然只是的了。

那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？提及来难以想象，加了葡萄糖后最大的益处只是悬浮后的大肠杆菌可不能快速沉积到管子的底部。

因此，若是溶液I中缺了葡萄糖其实对证粒的抽提本身而言，几乎没有任何阻碍。

因此说溶液I中葡萄糖是可缺的。

那么EDTA呢？大伙儿明白EDTA是Ca2+ 和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的要紧作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。

在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非确实是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。

若是不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只若是在不太长的时刻里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有
EDTA。

若是哪天你手上正好缺了溶液I，可不能够抽提质粒呢？实话告知你，只要用等体积的水，或LB培育基来悬浮菌体就能够够了。

有一点不能忘的是，菌体必然要悬浮均匀，不能有结块。

轮到溶液II了。

这是用新鲜的 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后利用的。

要新从浓NaOH稀释制备的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。

很多人不明白其实破细胞的主若是碱，而不是SDS，因此才叫碱法抽提。

事实上NaOH是最正确的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌仍是哺乳动物细胞，碰着了碱都会几乎在刹时就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相转变所致使。

用了不新鲜的 N NaOH，即即是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨能够自己试一下），自然就难高效率抽提取得质粒。

若是只用SDS固然也能抽提取得少量质粒，因为SDS 也是碱性的，只是弱了点罢了。

很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确明白得一些书上的有关DNA变性复性的描述所致使。

有人不由要问，既然是NaOH溶解的细胞，那什么缘故要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。

这一步要记住两点：第一，时刻不能太长，万万不要这时去接，因为在如此的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必需温柔混合（象对待女小孩一样），不然基因组DNA也会断裂。

基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。

每一个人都明白，溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部份人却不明白这沉淀的本质。

最容易产生的误解是，当SDS碰着酸性后发生的沉淀。

若是你如此疑心，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就明白不是这么回事了。

大量沉淀的显现，显然与SDS的加入有关系。

若是在溶液II中不加SDS会如何呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。

既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会可不能是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发觉SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。

因此高浓度的盐致使了SDS 的沉淀。

但如果是你加入的不是NaCl而是KCl，你会发觉沉淀的量要多的多。

这实际上是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。

如此看来，溶液III加入后的沉淀事实上是钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。

大伙儿明白SDS专门喜爱和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所
产生的大量沉淀自然就将绝大部份蛋白质沉淀了，让人快乐的是大肠杆菌的基因组DNA也一路被共沉淀了。

那个进程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS
给共沉淀了，尽管SDS并非与DNA分子结合。

那么2 M的醋酸又是什么缘故而加的呢？是为
了中和NaOH，因为长时刻的碱性条件会打断DNA，因此要中和之。

基因组DNA一旦发生断裂，只若是50－100 kb大小的片断，就没有方法再被PDS共沉淀了。

因此碱处置的时刻要短，而且不得猛烈振荡，不然最后取得的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳能够观看到一条浓浓的总DNA条带。

很多人误以为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误解，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。

NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性实际上是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。

溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。

不要以为PDS沉淀的形成绩可以将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，
因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能取得质量稳固的质粒DNA，不然时刻一长就会因为混入的DNase而发生降解。

那个地址用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，那个地址做个全面的介绍。

酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，可是水饱和酚的比重略比水重，碰着高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，无益于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后能够增加比重，使得酚/氯仿始终在基层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有专门大的互溶性，若是单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反映（比如限制性酶切反映），应此若是单独用酚抽提后必然要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚那么少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而没必要担忧酶切等反映不能正常进行。

至于异戊醇的添加，其作用主若是为了让离心后上基层的界面加倍清楚，也方便了水相的回收。

回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就能够够将质粒DNA沉淀出来。

这时若是放到－20℃，时刻一长反而会致使大量盐的沉淀，这点不同于一般的DNA酒精沉淀回收，因此不要过度警惕了。

高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。

若是感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几回，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打坏，就能够取得好的样品。

取得的质粒样品一样用含RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA 会干扰电泳结果的。

琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情形下你能看到三条
带，但万万不要以为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。

碱法抽提取得质粒样品中不含线性DNA，不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。

其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，别离是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一路）。

若是你不警惕在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。

超级偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA序列致使了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。

那个地址暂不深究。

想说的，终于说完了。

谢谢你的耐心。

留下一个试探题，什么缘故真核生物的基因组DNA不能用碱法抽提？
碱法小量制备重组质粒中NaOH-SDS液的作用原理是什么
NaOH：核酸在pH值为5~9的溶液中是最稳固的，但pH大于12或小于3时，就会引发双键之间氢键的解离而变性。

在溶液Ⅱ中的NaOH浓度为，加入提取液时，该系统的pH就会高达，因此促使染色体DNA与质粒DNA的变性。

：为阴离子表面活性剂，要紧功能有：溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，从而破坏细胞膜；解聚细胞中的蛋白质结合为复合物，使蛋白变性沉淀下来，但能抑制核糖核酸没的作用，因此在以后的提取进程中，必需把它去除干净，以防用RNase 去除RNA时受到干扰
SDS碱裂解法提取质粒DNA中加酚氯仿的作用是什么？
酚是强烈的蛋白质变性剂，能有效使蛋白质变性而除去，氯仿有强烈的脂溶性，去除脂类杂质，本身酚：氯仿：异戊醇=25：24：1的要紧作用是抽提蛋白质
质粒DNA的分离、纯化和鉴定
第一节概述。