橘核中柠檬苦素的提取与含量测定

橘核中柠檬苦素的提取与含量测定
王巍静;许海丹;姜燕清
【摘要】A high performance liquid chromatographic (HPLC) method was developed for determination of li-monin in citrus seeds. The sample was extracted using ultrasonic extraction technology. The detection of limonin was carried out by HPLC using Agilent Eclipse XDB-C18 (250 mm × 4. 6 mm, 5 μm) column as separation column , a mixture of acetonitrile and water mixed in the ratio of 65 to 35 (by volume) as mobile phase. The UV detecting wavelength was set at 210 nm. The results indicated that the value of peak area was linearly correlated to the mass concentration of limonin in the range of (20 ~ 160) μg/mL, r = 0.999 9. The average recovery was 101. 5% , RSD was 1. 37% (n =6). It is conclused this method is simple, rapid and reliable.%建立了高效液相色谱测定橘核中柠檬苦素含量的方法.采用超声法从橘核中提取柠檬苦素,以Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm)为分析柱,乙腈—水(65∶35,v/v)溶液为流动相,用紫外检测器在波长210 nm处进行测定.结果表明,柠檬苦素的质量浓度在(20 ～160) μg/mL 范围内与峰面积呈良好的线性关系,相关系数r=0.999 9.方法的平均加样回收率为101.5％,RSD=1.37％(n=6).该法简便、准确、可靠,能为橘核中柠檬苦素的测定及开发利用提供参考.
【期刊名称】《科学技术与工程》
【年(卷),期】2013(013)002
【总页数】3页(P439-441)
【关键词】高效液相色谱;橘核;柠檬苦素;超声提取
【作者】王巍静;许海丹;姜燕清
【作者单位】台州学院医药化工学院,临海317000;台州学院医药化工学院,临海317000;台州学院医药化工学院,临海317000
【正文语种】中文
【中图分类】R284.1
橘核为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥成熟种子，主产于江西、浙江、福建、四川等地，有理气、散结、止痛的功效，用于疝气疼痛、睾丸肿痛、乳痈乳癖［1，2］。

研究表明，橘核中主要活性成分为柠檬苦素及其类似物，该类物质具有抗肿瘤、镇痛抗炎、抗焦虑镇静、防虫杀虫、抗氧化等药理作用［3］。

迄今已从植物体中发现了300多种柠檬苦素类化合物，其中50多种是从柑橘属植物中分离出来［4］。

本文研究高效液相色谱测定橘核中柠檬苦素含量的方法，可为开发橘核药用价值及质量控制提供一定依据。

1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);UV—2450PC型紫外分光光度计(日本岛津公司);SB—5200D型超声波清洗机(宁波江南仪器厂)。

橘核购于临海方一仁药店中药部;柠檬苦素标准品(批号:110800—200404)购自中国药品生物制品检定所;试验用水为超纯水，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.2 实验方法
1.2.1 样品溶液的制备
橘核经干燥、粉碎过60目筛，于索氏提取器中以石油醚脱脂至无色。

取脱脂后橘核粉末，加入70%乙醇，料液比1∶30，50℃下超声提取2次，30 min/次。

抽滤，合并滤液浓缩至干，用甲醇溶解并定容至25 mL，摇匀后经0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。

1.2.2 标准品溶液的制备
取柠檬苦素标准品适量，精密称定，用乙腈溶解并定容至25 mL，得浓度为0.2 mg/mL的柠檬苦素标准溶液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。

1.2.3 色谱条件
采用反相高效液相色谱法，Agilent Eclipse XDB-C18 色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈—水(65∶35，v/v)，流速为 1.0 mL/min，柱温为室温，进样量5 μL，检测波长为210 nm。

2 结果与讨论
2.1 超声提取溶剂的筛选
取5份橘核粉末于烧瓶中，分别加入乙醇、乙腈、甲醇、丙酮和乙酸乙酯按实验
方法进行提取。

结果表明，提取率高低次序为:乙醇＞甲醇＞丙酮＞乙腈＞乙酸乙酯。

并且乙醇在安全性、经济成本方面性能更优，因此，乙醇是较为理想的提取溶剂。

进一步比较不同浓度乙醇—水溶液(50%～100%)的提取效果，提取率随着乙醇浓
度的升高先增大后减小，以70%乙醇的提取效果最理想。

所以，最终选用70%乙醇超声提取。

2.2 HPLC分析条件的确定
2.2.1 检测波长的选择
标准品和样品溶液的吸收光谱如图1所示，可知它们的最大吸收波长均在210 nm 附近，故210 nm为检测波长。

图1 标准品溶液与样品溶液的吸收光谱
2.2.2 操作条件的选择
分析柠檬苦素的流动相体系主要有:乙腈-水-磷酸缓冲液、乙腈-四氢呋喃-水、乙腈-水、乙腈-甲醇-水、甲醇-水等［5—9］。

根据预试验结果，乙腈-水为流动相时，基线较稳定，峰形较好，且有一定的分离度。

在保证分离度大于1.5的情况下，我们调整流动相配比(40∶60～80∶20)、流速(0.6～1.2 mL/min)、进样量(3～15
μL)等参数摸索合适的操作条件。

考虑到峰形的对称稳定以及保留时间等因素，最
后选择流动相配比为:乙腈∶水=65∶35，流速为1.0 mL/min，进样量5 μL。

HPLC谱图如图2所示。

2.3 柠檬苦素标准曲线的绘制
分别取柠檬苦素标准溶液1、2、4、6、8 mL于10 mL容量瓶中，乙腈定容，在相同条件下测定。

以峰面积(A)对浓度(C)作线性回归，得标准曲线回归方程为
A=3.971 5C －2.329 5，r=0.999 9，浓度在(20～160)μg/mL范围内线性关系良好。

2.4 精密度试验
图2 标准品溶液与样品溶液的色谱图
取同一标准品溶液，连续进样5次，测定峰面积，RSD为0.68%，表明本方法精
密度较好。

2.5 稳定性试验
取同一样品溶液，分别在0、1、2、4、6、8 h 进样5 μL，按照峰面积计算RSD
为1.31%，结果表明样品溶液至少在8 h内稳定。

2.6 重复性试验及柠檬苦素含量测定
取同一批次处理的橘核粉末5份，按样品溶液的制备方法平行制备，测定峰面积
并计算，得柠檬苦素平均含量为7.24 mg/g，RSD=0.84%。

2.7 加样回收率试验
取已知含量的样品溶液6份，分别加入标准品溶液0.10、0.25、0.40 mL(各两份)，测定柠檬苦素含量。

求得平均回收率为101.5%，RSD=1.37%。

3 结论
本文考察了不同溶剂对橘核中柠檬苦素含量的影响，得出70%乙醇为最佳提取剂。

进一步优化了高效液相色谱法测定柠檬苦素的分析条件。

所建立的方法简便快捷、准确可靠，为橘核的资源利用和质量评价提供了良好的依据。

参考文献
【相关文献】
1 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部.北京:中国医药科技出版社，2010:356
2 万福根，邓仁华，黄贵平，等.中药橘核的研究进展.中国药业，2011;20(17):76—77
3 朱峰.红橘种子资源化利用的研究.重庆:西南大学硕士学位论文，2009:6—8
4 郭育铭，郑旭煦，殷钟意，等.柠檬苦素类似物的研究进展.重庆工商大学学报(自然科学版)，2008;25(6):638—641，653
5 Tian Q，Miller E G，Jayaprakasha G K，et al.An improved HPLC method for the analysis of citrus limonoids in culture media.Journal of Chromatography B，2007;846(1—2):385—390
6 Abbasi S，Zandi P，Mirbagheri E.Quantitation of limonin in Iranian orange juice concentrates using high-performance liquild chromatography and spectrophotometric methods.European Food Research＆Technology，2005;221(1—2):202—207
7 彭腾，邱建平，李鸿翔，等.川产柑橘属不同品种成熟果皮中柠檬苦素的含量测定.成都中医药大
学学报，2010;33(3):69—71
8 何中燕，裴瑾，莫书蓉，等.不同橘核炮制品中柠檬苦素和诺米林的测定.中成药，
2011;33(10):1761—1764
9 王辉，徐环昕，寇正福，等.吸附树脂分离纯化柚核中的柠檬苦素.离子交换与吸附，
2010;26(3):256—263。