自固化磷酸钙人工骨松质骨颗粒作骨髓间充质干细胞载体修复家兔股骨头缺血性坏死的实验探究

Ｂ
ｔａｋｅ
ｔｈｅ
ｕｔｏａｌｌｅｒｇｉｃ
ｃａｎｃｅｌｌａｔｅｄ ｂｏｎｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ
ｍａｔｅｒｉａｌ．Ｔｈｅ
８ ｗｅｅｋｓ ａｆｔｅｒ ａｎｄ
ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｗｅｒｅ
ｏｐｅｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ
２，４，６ ｗｅｒｅ
ＢＭＳＣｓ
ｉｓｏｌａｔｅｄ，ｃｕｌｔｕｒｅｄ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ ｗｈｏｌｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ
摘 要
目的：骨髓间充质干细胞体外分离、培养和扩增技 术在实验阶段已经成熟并且在临床部分已经开始应用， 但是尚未能找到其合适的载体，不便于临床的实际应用。 为提高骨髓间充质干细胞在临床应用的疗效，实验拟比 自固化磷酸钙人工骨松质骨颗粒和自体松质骨作为载体 对实验性家兔股骨头缺血性坏死的修复作用。 方法：１．实验前准备及实验动物的分组：实验动物 提前一周饲养以适应环境及观察确定无疾病。术前一天 禁食水。２４只成年新西兰大耳白兔，随机分为Ａ、Ｂ两 组，每组１２只，Ａ组为白固化磷酸钙人工骨（Ｃａｌｃｉｕｍ
ａｖａｓｃｕｌａｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｍｏｒａｌ ｈｅａｄ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ＣＣＰＣ ａｎｄ ａｕｔｏａｌｌｅｒｇｉｃ ｃａｎｃｅｌｌａｔｅｄ ｂｏｎｅ
ａｓ
ｓｕｐｐｏｒｔ ｍａｔｅｒｉａｌ． ａｎｄ
Ｍｅｔｈｏｄｓ：１．Ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｉｍａｌｓ：Ｂｒｅｅｄ ａｌｌ ａｎｉｍａｌｓ ｏｆ ｐｒｅｐａｒｅ ｆｏｒ
中文摘要
的高密度区，骨小梁结构完整。４周标本，钻孔区高密 度部分密度略减，钻孔区以外密度有所增加，骨小梁结 构完整。６周标本，内植ＣＣＰＣ部分密度仍略高，出现 骨小梁，钻孔区界限模糊，钻孔缺损区以外密度有所增 加，骨小梁紊乱，８周标本，内植ＣＣＰＣ部分密度基本 正常，出现骨小梁，钻孔区界限进一步模糊。钻孔缺损 区以外密度有所增加，骨小梁紊乱，出现软骨下囊性变。 Ｂ组２周标本钻孔区密度减低，钻孔区以外密度有所增 加，骨小梁结构完整。４周标本，钻孔区密度增高但仍 低于正常，钻孔区以外密度有所增加，骨小梁结构完整。 ６周标本，钻孔区可见稀疏骨小梁，钻孔区以外密度增 加，骨小梁紊乱，出现软骨下囊性变。８周标本，钻孔 区密度基本正常，出现骨小梁，钻孔区界限模糊。钻孔 区以外密度有所增加，骨小梁紊乱，出现软骨下囊性变。 从总体上看，Ａ组缺损区因植入完整的ＣＣＰＣ，故密度 逐渐降低最后出现正常骨小梁结构。Ｂ组缺损区植入明 胶海绵混合白体松质骨颗粒，密度由开始降低后升高， 最后出现正常骨小梁结构。２．股骨头的组织检查：Ａ组 术后２周时，钻孔缺损区内有大量的成骨细胞，缺损区 边缘有较多的类骨质和新生骨小梁。４周时缺损区内有 大量骨小梁形成及类骨质填充。６周时缺损区内可见比 较成熟的骨小梁，并出现骨髓组织。在８周时缺损区内 骨小梁趋于成熟，并有大量骨髓组织形成。Ｂ组实验动 物的股骨头标本术后２周时，钻孔边缘形成较多新生骨 组织，新生骨内侧有一个成骨细胞聚集层，而钻孔区中 心充满了炎症细胞。４周时，钻空区新生骨小梁增多，
■‘
ＩＩｅａｎ Ｉｌｌ ｒａｂＤｉｔ
ＢＭＳＣｓ
ｔａｋｅ ＣＣＰＣ
ｓｕｐｐｏｒｔ ｍｏｒｔｉｅｒａｌ
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
ｏｂｊ ｅｃｔｉｖｅ：Ｔｈｅ ＢＭＳＣｓ ｗｅｒｅ ｌｓｏｌａｔｅｄ，ｃｕｌｔｕｒｅｄ ａｎｄ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ ｓｋｉｌｌｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｇｒａｄｅ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｎｄ ｈａｖｅ
２４ ｈｏｕｒｓ．２４ ａｄｕｌｔ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｒａｂｂｉｔｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ ｒａｎｄｏｍｌｙ．１ ２ ｒａｂｂｉｔｓ ｏｆ Ｇｒｏｕｐ Ａ ｔａｋｅ ｔｈｅ ＣＣＰＣ
ａｓ
ｓｕｐｐｏｒｔ
ｍａｔｅｒｉａｌ．１ ２
ｒａｂｂｉｔｓ
ａｓ
ｏｆ Ｇｒｏｕｐ ｓｕｐｐｏｒｔ ａｎｄ
中文摘要
但并不在全部区域，部分标本在钻孔中央形成少量骨组 织，部分标本无骨组织形成。６周时现象与４周的情况 接近，只是骨小梁稍加成熟，有骨髓组织出现。钻孔区 有血管出现。８周时乍ｄｉ：ｆＬ边缘区充满分布不均匀的骨小 梁组织和骨髓组织。 统计学分析：在术后８周时，两组实验动物股骨头钻 孔缺损区内，骨小梁的面积百分比值分别为，Ａ组为
ｔｈｅ
ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅ，ｆｅｍｏｒａｌ ｈｅａｄ ｗｅｒｅ ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｉｑｕｅｆｉｄｅｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｆｏｒ ３ ｍｉｎｕｔｅｓ．Ｂｏｒｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂａｃｋ ｏｆ
ｃｏｌｌｕｍ ｆｅｍｏｒｉｓ ｉｎｔｏ ｆｅｍｏｒａｌ ｈｅａｄ
ｔｏ
ｒｅａｃｈ
０．８０４６５０＋０．００２２６８
ｌ，Ｂ组为０．８０１ ２６７＋０．００４０３７３，经过
统计学分析表明，具备方差齐性，总体无差别，两两比 较Ｐ＝０．８４２＞０．０５，无统计学意义。 结论：１．ＢＭＳＣｓ复合ＣＣＰＣ有很好的成骨作用，无 细胞诱导因子亦可良好成骨；２．ＢＭＳＣｓ复合ＣＣＰＣ修复 股骨头坏死效果等同于其复合白体松质骨；３．ＣＣＰＣ可 以作为ＢＭＳＣｓ良好的支架材料。
ＤＭＥＭ，ｐｕｔ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ，ｔｈｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ
Ｘ
ｇｏ ｄｏｗｎ ｔｏ ｐｏｓｔｅｒｉｔｙ ｉｓ １
１ ００．Ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍａｋｅ
ｉｎｔｏ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ，ｇｒｏｕｐ Ａ ｉｓ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｉｎｔｏ ＣＣＰＣ，ｇｒｏｕｐ Ｂ ｉｓ ｉｎｔｏ ｇｅｌａｔｉｎ ｓｐｏｎｇｅ．Ｔｈｅｎ ｐｕｔ ｔｈｅｍ ｉｎｔｏ ｃｅｌ ｌ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ ｆｏｒ ２４ ｈｏｕｒｓ，ｉｎ ｔｈｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ Ａ
ｏｆ
Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｂａｃｋ—ｌａｔｅｒａｌ ｉｎｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｉｐ， ａｎｄ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｈｅ ｒｏｕｎｄ
ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｍｏｒａｌ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ，ｎｏｔ
ｈｉｐ ｄｉｓｌｏｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ
ｐｒｏｔｅｃｔ
ｃｕｔ
ｌｉｇａｍｅｎｔ，ｎｏｔ
５
英文摘要
ｄｒａｗ－ｏｆｆ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｉｌｉａｃ ｓｐｉｎｅ ｏｆ ｒａｂｂｉｔｓ ｂｅｆｏｒｅ １ ｗｅｅｋ ｏｆ ｔｈｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｗｅｒｅ ｐｌａｎｔ ｉｎｔｏ ６－ｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｍｒｅ ｐｌａｔｅ，ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｌｕｉｄ ｉｓ ２０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
Ｃｅｍｅｎｔ，ＣＰＣ）松质骨颗粒（ｃｃｐｃ）联合骨髓
ｍａｒｒｏｗ
间充质干细胞（ｂｏｎｅ
ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ
ｓｔｅｍ
ｃｅｌｌｓ，ＢＭＳＣｓ）移植组，Ｂ组为自体松质骨联合ＢＭＳＣｓ 移植组。两组于术后２，４，６，８周各处死３只实验动物。 ２．ＢＭＳＣｓ获取培养及复合载体：术前１周从成年新西兰 大耳白兔髂后上嵴处抽取骨髓，种植于６孔细胞培养板 内，培养液为含２０％胎牛血清ＤＭＥＭ液，放入细胞培 养箱内培养，传代密度为ｌ×１０６／ｃｍ２。第３代细胞培养至 传代密度时制成细胞悬液，Ａ组分别浸润每个 ４ｍｍｘ４ｍｍｘ４ｍｍ大小ＣＣＰＣ，放入细胞培养箱内培养，
ｏｐｅｒａｔｉｏｎ
ａ
ｗｅｅｋ
ｅａｒｌｙ
ｔｏ
ｍａｋｅ ｔｈｅｍ
ａｄａｐｔ
ｔｏ
ｔｈｅ
ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｍａｋｅ ａｌｌ ｔｈｅ ａｎｉｍａｌｓ ｄｉｓｅａｓｅ．ｆｒｅｅ．Ａ１ｌ ｔｈｅ ａｎｉｍａｌｓ ｗａｉｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｅａｔｉｎｇ ａｎｄ ｄｒｉｎｋｉｎｇ
ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｉｌｌ ｏｆ ａｕｔｏａｌｌｅｒｇｉｃ ｃａｎｃｅｌｌａｔｅｄｙｅｉｎｇ：Ｃｕｔ ｔｈｅ ｆｅｍｏｒａｌ ｈｅａｄ
ａｔ
ｔｈｅ
ｂａｓｅｍｅｎｔ ｗｈｉｃｈ ｂｅ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｌ Ｏ％ｆｏｒｍａｌｉｎ，ｍａｒｋｅｄ，
现阶段对股骨头坏死的发病机理仍不清楚研究都以各种原因所致血管病变为着眼点重点讨论各种原因对血管的损害对发病机理争议较大因而产生了许多理论包括显微骨折与骨质疏松学说脂肪栓塞学说微血管损伤学说血管内凝血及骨坏死学说骨内压增高理论以及免疫反应在股骨头坏死发病机理中的作用1
中文摘要
自固化磷酸钙人工骨松质骨颗粒作骨髓间充质 干细胞载体修复家兔股骨头缺血性坏死的实验 研究
ｔｏ
ｔｈｅ ｂａｓｅ ｏｆ
ａｒｔｈｒｏｄｉａｌ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ａｆｔｅｒ ｉｔ ｒｅｗａｒｍｍｉｎｇ，ｗｉｔｈ ｂｒｏａｃｈ ｗｈｉｃｈ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｉｓ ３．５ｍｍ，ｔｈｅｎ ｔｈｅ
ｇｒｏｕｐ Ａ ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ
ｔｈｅ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＣＰＣ ａｎｄ ＢＭＳＣｓ，ｔｈｅ ｇｒｏｕｐ Ｂ ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ
ｃｏｍｍｅｎｃｅｄ ｕｓｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ．Ｔｈｅｒｅ ｉｓ ｎｏｔ ｓｕｉｔａｂｌｅ
ｓｕｐｐｏｒｔ ｍａｔｅｒｉａｌ．Ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｃｕｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｉｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｔｏ
ＢＭＳＣｓ，
ｃｏｍｐａｒｅ ｔｈｅ ｃｕｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒａｂｂｉｔｓ
ｐｕｔ ｔｈｅ ＣＣＰＣ ｉｎｔｏ ｔｈｅ
ｆｅｍｏｒａｌ ｈｅａｄ ｄｅｆｅｃｔ ａｒｅａ，Ｇｒｏｕｐ Ｂ
ｐｕｔ ｔｈｅ ｇｅｌａｔｉｎ ｓｐｏｎｇｅ ｗｈｉｃｈ ａｄｍｉｘｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｕｔｏａｌｌｅｒｇｉｃ
ｃａｎｃｅｌｌａｔｅｄ ｂｏｎｅ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｆｅｍｏｒａｌ ｈｅａｄ ｄｅｆｅｃｔ
ａｒｅａ．
３．
Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ：ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｆｅｍｏｒａｌ ｈｅａｄ ｏｆ ａｌｌ ａｎｉｍａｌｓ ｗｉｌｌ ｂｅ ｏｐｅｒａｔｅｄ．Ｐｒｏｎｅ
ｔｏ
ｐｏｓｉｔｉｏｎ，４０ｍｇ／ｋｇ
ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ．
ｐｅｎｔｏｔｈａｌ
ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ
ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ
中文摘要
２４小时后手术植入实验动物股骨头钻孔处；Ｂ组则分别 浸润分成和ＣＣＰＣ一样大小的明胶海绵颗粒，放入细胞 培养箱内培养２４小时后，手术将松质骨颗粒和载有 ＢＭＳＣｓ的明胶海绵均匀混合并植入实验动物股骨头钻 孔处。３．实验动物模型制备及手术方法：所有动物双侧 股骨头都参加实验。取俯卧位，４０ｍｇ／ｋｇ硫喷妥钠腹腔 注射麻醉。常规消毒，铺单。髋关节后侧切口，显露股 骨头，不切断圆韧带，髋关节不脱位，保护周围组织， 用液氮棉团连续冷冻股骨头３分钟造成股骨头坏死模 型。自然复温后从股骨颈内后侧向股骨头内钻孔，用直 径３．５ｍｍ钻头向股骨头内钻入４ｍｍ，到达关节软骨下。 Ａ组钻孔后植入复合ＢＭＳＣｓ的ＣＣＰＣ，关闭伤口。Ｂ组 钻孔后植入复合ＢＭＳＣｓ的明胶海绵混合自体松质骨颗 粒，关闭伤口。４．ＨＥ染色：取出１０％福尔马林中保存的 股骨头标本，从股骨颈基底锯断，将标本做标记后放入 ８％甲酸溶液中换液三次，共脱钙两周。脱水、透明、浸 蜡、修块，做５ｐｍ切片，水浴，铺片，烤片。然后行 ＨＥ染色：熔蜡，酒精梯度水化，亚甲兰染色，酸化， 返兰，伊红染色，再酒精梯度脱水，透明。然后光学树 脂封片。５．Ｘ线及组织学观察：Ｘ射线观察钻孔区骨密 度及骨小梁的变化情况。苏木精．伊红染色切片，光镜观 察钻孔区细胞及骨小梁的变化情况。６．统计学方法：采 用ＳＰＳＳ １１．５统计学软件，对缺损区新生骨小梁图像， 进行面积百分比均值的ｔ检验分析。 结果：１．股骨头Ｘ线检查：Ａ组２周标本，钻孔区 可见股骨头中部植入复合ＢＭＳＣｓ的ＣＣＰＣ部位有明显
６
英文摘要
ａｎｄ ｐｕｔ ｔｈｅｍ ｉｎｔｏ ８％ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｒｅｅ ｔｉｍｅｓ
ｔｏ
ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ，ｗｈｉｃｈ
ｎｅｅｄ
ｔｗｏ
ｗｅｅｋｓ．Ｄｅｗａｔｅｒｉｎｇ． ｓｌｉｃｅ
Ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ． ５
关键词：股骨头缺血性坏死；自体松质骨颗粒；自 固化磷酸钙人工骨松质骨颗粒；自体；骨髓间充质干细 胞；支架材料，家兔
英文摘要
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ
■ ｌ
Ｏｉｌ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｅａｒｌｙ
● ｌ ｌ
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ＡｖａＳＣＵｌａｒ ｗｉｔｈ
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ｎｅｃｒｏｓｌｓ ０Ｉ
Ｉｅｍｏｒａｌ
ａｓ
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