肌酸激酶同工酶质量法的优势及其性能评价研究

磷酸肌酸激酶主要存在于骨骼肌、心肌和脑组织
中,其同工酶(CKMB)是心肌损伤的特异而敏感的指
标,曾认为是诊断心肌梗死和心肌炎的金指标[1]。

目前实验室CKMB的检测方法常为酶法(免疫抑制法),此
方法容易出现结果与临床不符的情况。

CKMB质量
法,其原理是利用单克隆抗体技术和化学发光或荧光
免疫的方法直接检测CKMB的质量浓度,所以可以
从根本上解决酶法的不足。

胶乳免疫比浊法在临床上
测试不需要特殊仪器设备,其检测方法具有简便、无
污染且测试速度快等优点。

本研究对北京九强胶乳免疫比浊法测定的肌酸激酶同工酶的试剂盒进行性能评价,以验证该产品的可靠性和临床适用性。

1材料与方法
1.1仪器及试剂
1.1.1仪器东芝公司生产的TBA2000FR全自动生化分析仪。

1.1.2试剂、校准品和质控品方法学评价所用试剂、校准品和质控品均由北京九强生物科技股份有限公司提供,质控品1和质控品2(批号:19-0114),质量
肌酸激酶同工酶质量法的优势及其性能评价研究
陈绮婷李琳
广州中医药大学顺德医院(佛山市顺德区中医院)检验科,广东佛山528300
[摘要]目的对北京九强生物技术有限公司肌酸激酶同工酶CKMB测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)进行性能评价。

方法自2019年5~12月期间采用东芝2000FR全自动生化分析仪,检测肌酸激酶同工酶的准确度、精密度、线性范围、空白检测限、最大稀释倍数、临床可报告范围、参考范围进行实验性能验证。

统计学方法采用直线相关回归分析。

结果北京九强CKMB试剂盒的准确度验证中测定值与定值的相对偏差分别为0.62%、-2.89%,批内精密度CV分别为1.29%、0.67%,批间精密度CV分别为1.53%、1.14%。

线性范围为0.00~218.36ng/mL,临床可报告范围为0.12~1642.56ng/mL,随机抽取的20例健康体检样本的测定结果95%在参考值范围(0.00~5.00ng/mL)内。

结论该试剂盒的胶乳免疫比浊法测定肌酸激酶同工酶性能符合要求,可满足临床测试要求。

[关键词]肌酸激酶同工酶;质量法;试剂性能评价;胶乳免疫比浊法;准确度;精密度;线性范围;参考范围
[中图分类号]R446.1[文献标识码]B[文章编号]1673-9701(2020)29-0137-04
Study of the advantages and performance evaluation of creatine kinase isoenzyme mass method
CHEN Qiting LI Lin
Department of Clinical Laboratory,Shunde Hospital Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,TCM Hospital in Shunde District of Foshan City,Foshan528300,China
[Abstract]Objective To evaluate the performance of CKMB Mass Assay Kit(latex immunoturbidimetry)of Beijing Strong Biotechnologies,Inc(BSBE).Methods From May to December2019,Toshiba2000FR full-automatic biochemical analyzer was used to test the accuracy,precision,linear range,dilution multiple,blank and detection limit,maximum valid dilute double,clinical reportable range and reference range of creatine kinase isoenzyme for experimental perfor⁃mance verification.In terms of statistical method,linear correlation and regression analysis was adopted.Results In the accuracy verification of CKMB Mass Assay Kit of BSBE,the relative deviation of the measured value and the fixed value was respectively0.62%and-2.89%,the intra-batch precision(CV)was respectively1.29%and0.67%,and the inter-batch precision(CV)was respectively1.53%and1.14%.The linear range was from0.00to218.36ng/mL,and the clini⁃cal reportable range was from0.12to1,642.56ng/mL.95%of the measured results of20randomly selected health checkup samples were within the reference value range(0.00-5.00ng/mL).Conclusion The latex immunoturbidimetry of the assay kit meets the requirements for creatine kinase isoenzyme determination and it can meet the requirements of clinical test.
[Key words]Creatine kinase isoenzyme;Mass method;Evaluation of reagent performance;Latex immunoturbidimetry; Accuracy;Precision;Linear range;Reference range
法所用试剂(批号:19-0114),校准品(批号:19-0114)。

1.2检测原理
样本中的肌酸激酶同工酶(CKMB)与超敏化的抗肌酸激酶同工酶(CKMB)抗体胶乳颗粒试剂反应,形成免疫复合物,在660nm波长处检测其吸光度的变化,其变化程度与样本中的肌酸激酶同工酶(CKMB)浓度呈正比。

1.3检测参数
样本体积为10μL,试剂1(R1)为150μL,试剂2(R2)为50μL,采用两点终点法,反应方向为向上反应,主波长为660nm,无副波长,反应温度为37℃,读点时间:22点/33点。

1.4方法
1.4.1准确度重复测定高低质控样本,检测4次,计算其相对偏差。

当相对偏差≤10%时,说明该试剂有良好的准确度。

1.4.2精密度根据CLSI EP5-A2[2]要求,选择高低浓度样本进行批内精密度和批间精密度的测定。

批内精密度:取高、低值两个水平的患者混合血清各1支重复检测20次,计算均值与标准差,求得变异系数;批间精密度:取高、低值两个水平的质控各1支,分成5份,每天测4次,连续测5d,计算均值与标准差,求得变异系数。

1.4.3线性范围根据CLSI EP6-A[3]要求,取接近检测上限的血清标本(H)与去离子水(L),按照浓度梯度H、4H1L、3H2L、2H3L、1H4L、L等距稀释,每个浓度梯度测定2次,以实测均值为Y,理论值为X,求出线性回归方程,并计算Pearson相关系数r值,判定要求:R2≥0.975,0.97≤A≤1.03。

1.4.4空白检测限连续检测去离子水10次,计算均值及标准差,以均值+3×SD对应的浓度为试剂空白检测限。

1.4.5最大稀释倍数选取分析范围内高浓度标本,要求外观清澈,无溶血,无黄疸,无脂血。

用原厂技术资料申明的稀释液进行2、4、8、16倍稀释。

将检测结果与稀释后的预期值进行比较,计算稀释回收。

稀释回收率=(实测值/预期值)×100%。

结果评价标准:稀释测定结果与理论结果的差异应<±1/2CLIA'88允许变异(如果CLIA'88上未规定按照10%的标准处理)。

1.4.6临床可报告范围空白检测限~分析测量范围上限(已验证的线性范围上限×最大稀释倍数)。

1.4.7参考范围随机选择2019年5月26日广州中医药大学顺德医院健康体检的20份标本进行检测。

其中男、女各10例,年龄分布合适。

根据NCCLS C28-A2[4]要求,如果20个参考个体中不超过2个标本的检测值在验证的参考限之外,厂商或提供参考区间的实验室报告的95%参考区间可以接受。

如果出现3个以上超出界限,再选择20个标本进行验证,若少于或等于2个检测值超过原始参考值,则可接受,若还有
3个超出参考限,需要重新检查各种条件,决定是否建立自己的参考区间。

1.5统计学分析
采用Microsoft excel2013办公软件进行数据的统计分析。

2结果
2.1准确度实验评价结果
高低值2个浓度质控品的相对偏差分别为0.62%、-2.89%,两个相对偏差均符合要求。

见表1。

表1北京九强CK-MB mass准确度实验评价结果
2.2精密度评价实验结果
根据WS/T420-2013(临床实验室对商品定量试剂盒分析性能的验证)[5]的要求,低、高值混合标本的批内精密度CV分别为1.29%、0.67%,其CV未超过1/4TEa(TEa=30%)即7.5%允许偏差范围,见表2。

低、高水平质控品的批间精密度CV分别为1.53%、1.14%,其CV也未超过1/3TEa(TEa=30%)即10%的允许偏差范围,见表3。

表2北京九强CK-MB mass批内精密度实验评价结果
表3北京九强CK-MB mass批间精密度实验评价结果
2.3线性范围实验结果
肌酸激酶同工酶的实测值与理论值无明显离群值,该试剂实测值与理论值的线性回归方程为Y= 1.0087X-0.1157,R2=0.9992。

CKMB在0.00~218.36ng/mL 范围内呈线性,与制造商给定的线性范围的0.00~ 180ng/mL相比,该试剂具有较宽的线性范围,见表4、图1。

水平1
水平2
4
4
9.70
29.09
9.64
29.95
0.62
-2.89项目测定次数均值(ng/mL)靶值(ng/mL)相对偏差(%)
低值混合标本
高值混合标本
23.28
51.10
0.30
0.34
1.29
0.67
项目均值(ng/mL)标准差(ng/mL)相对偏差(%)
低值质控
高值质控
17.69
39.42
0.27
0.45
1.53
1.14
项目均值(ng/mL)标准差(ng/mL)相对偏差(%)
表4北京九强CK-MB mass 线性范围验证结果(ng/mL)图1北京九强CKMB mass 线性范围实验结果
2.4空白检测限实验结果以水空白为样品检测10次后得出空白检测限为
0.12ng/mL。

见表5。

表5北京九强CK-MB mass 空白检测限验证结果
2.5最大稀释倍数实验结果
将检测值为205.32ng/mL 的样本进行2、4、8、16倍稀释,将检测结果与稀释后的预期值进行比较,计算回收率和相对偏差。

当稀释16倍时相对偏差为-10.60%,大于10%的标准,所以稀释16倍不可接受,
因此该项目的最大稀释倍数为8倍。

表6北京九强CK-MB mass 最大稀释倍数及结果评价2.6临床可报告范围实验结果由表5~6可知,该试剂的临床可报告范围为
0.12~1642.56ng/mL。

2.7参考范围评价实验结果
通过对上述20份样本进行检测,测定结果中有
19个结果均在参考区间(0.00~5.00ng/mL)内,有95%的符合率,证明厂家提供的参考区间仍适用。

3讨论
CK 在人体内存在三种类型,分别为CKMM、
CKBB 和CKMB,CKMM 主要存在于骨骼肌和心肌,CKBB 主要存在于大脑,CKMB 主要存在于心肌,心肌
损伤严重时释放入血。

因此,CKMB 是诊断急性心肌梗死的重要指标[6-7]。

肌酸激酶同工酶(CKMB)在心肌损伤的酶学检测
中具有重要意义,其具有较高的特异度,且受到临床的广泛关注。

目前,CKMB 的检测方法包括免疫抑制法、电泳法、酶质量法等,其中以免疫抑制法最为常用,其原理是应用单克隆抗体与CK 中的M 亚基结合抑制CKMM(主要在骨骼肌中)及CKMB 中M 亚基活性的特点,再通过速率法进行CK 活性测定。

但由于生理性、病理性等因素的影响,常使CKMB 出现活性
假性升高,干扰临床对心肌损伤的诊断[8]。

如CK-BB、肌激酶(MK)、巨CK-1、免疫球蛋白结合CK(macro CK)、线粒体CK(mit CK)均能造成血中CKMB 活性测定结果的误差,所以临床上经常看到CKMB>CK 的化验结果,可见CKMB 活性的测定有一定的局限性[9]。

一般血清CKMB 活性大于CK 在恶性肿瘤、急性脑血管病、小儿肺炎、小儿轮状病毒性肠炎、带状疱疹、有机磷中毒等疾病中存在[10],只有避免此类结果的出现才能更好地迅速诊断疾病,减少对临床造成的干扰。

本实验使用的质量法试剂盒是建立在单克隆抗体直接识别CKMB 抗体的实验原理上的,抗体的特异性决定其不受CKMM、CKBB、巨CK-1以及线粒体CK 的干扰,同时避免了蛋白失活造成的误差,诊断特异性较抗体酶抑制法有显著的提高[11]。

有研究表明,加入干扰物(CK-MMXK-BB)前后CKMB 质量未见明显变化,说明其不受非典型CK、巨CK-1和CKBB 等多因素的影响[12]。

其次,由于酶的活力具有一定的衰减性[13],活性的检测结果相对来说会存在一定的偏差。

但CKMB 质量不受酶老化的影响,其检测特异性高于CKMB 活性[14]。

同时也有研究表明CKMB 质量检测优于CKMB 活性检测,特别是对AMI 患者和有较明显感染的心肌缺血患者的诊断[15]。

因此,CKMB 质量法的诊断效能会大于CKMB 活性的诊断效能,CKMB 质量法
检测结果可作为心肌炎特异和可靠的诊断依据[16]。

因此对于诊断心肌梗死[17]、心肌炎[18]等患者来说,CKMB
质量法优于常规的酶法。

本研究以CLSI EP 系列文件及WS/T 420-2013《临床实验室对商品定量试剂盒分析性能的验证》推荐方案为指导,对北京九强生物公司开发的胶乳免疫比浊法肌酸激酶同工酶检测试剂盒进行准确度、精密度、线性、最大稀释倍数、临床可报告范围、参考区间等试
原倍2倍4倍8倍16倍
205.32108.1252.7025.5111.47205.32102.6651.3325.6612.83100.0094.6897.33100.58110.600.005.322.67
-0.58-10.60可接受可接受可接受可接受不可接受
稀释倍数平均值
(ng/mL)理论值
(ng/mL)回收率(%)
相对偏差(%)评价结果H 4H 1L 3H 2L 2H 3L 1H 4L L
218.36174.69131.0287.3443.670.00
217.85174.27130.9790.3342.640.00
218.87164.77130.0088.1642.310.00
218.36169.52130.4989.2542.480.00
稀释倍数理论值测定值1测定值2测定均值0.012
0.035
0.12
均值(ng/mL)水空白SD 检测限=均值+3×SD
剂关键性能指标的验证,以判断该试剂盒的临床应用价值。

研究结果显示,此试剂的胶乳免疫比浊法检测
CKMB的各浓度校准品的均值与定值的相对偏差均小于±10%允许范围,其准确度高;各水平的批内精密度CV<7.5%,批间精密度CV<10%,其精密度好;其检测线性范围宽,空白检测限低,且最大稀释倍数验证(8倍及以下)其相对偏差小于允许偏差范围±10%,所设定的参考区间适用。

综上所述,该胶乳免疫比浊法测定肌酸激酶同工酶试剂盒的各项检测性能均符合检测要求,可满足临床测试要求,可为临床相关疾病的诊断与治疗提供参考标准。

[参考文献]
[1]中华医学会儿科学分会心血管组.病毒性心肌炎诊断
标准[J].中华儿科杂志,2000,38(2):75. [2]National Committee for Clinical Laboratory Standards. Evaluation of precision performance of quantitative mea⁃surement methods[S].Approved Guideline-Second Edition. Wayne,PA:EP5-A2,NCCLS,1999:43-64. [3]National Committee for Clinical Laboratory Standards. Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures:A statistical approach;approved guideline[S]. Wayne,PA:EP6-A,NCCLS,2003.
[4]National Committee for Clinical Laboratory Standards. How to define and determine reference intervals in the clinical laboratory[S].Wayne,PA:CA28-A2,NCCLS,2000: 24-25.
[5]杨振华,申子喻,陈宝荣,等.WS/T420-2013《临床实验
室对商品定量试剂盒分析性能的验证》[S].中华人民共和国卫生标准,2013.
[6]Gerhardt W,Ljungdahl L.Rational diagnostic strategy in diagnosis of ischemic myocardial injury.S-troponin T and S-CK MB(mass)time series using individual base line values[J].Scand J Clin Lab Invest,1993,53(Sup215):
47-59.
[7]Adams JE,Seheehtman KB,Landt Y,et parable detection of aeute myoeardial infaretion by cereatine ki nase MB isoenzyme and cardiac troponin I[J].Clin Chem, 1994,40(7Pt1):1291-1295.
[8]赵雪松,王德强.肌酸激酶同工酶用于心肌损伤诊断的
研究进展[J].医疗装备,2018,31(12):200-201. [9]王虹,刘石,邢艳琳,等.肌酸激酶同工酶质量判定肌
病心肌损害的局限性[J].中国危重病急救医学,2011, 23(12):723-726.
[10]朱文秀,杨桂英.血清肌酸激酶同工酶活性大于肌酸激
酶的病例分析[J].国际检验医学杂志,2017,38(1): 104-105.
[11]Apple F,Preese L.Creatine kinase MB:Detection of myo⁃cardial infarction and monitoring reperfusion[J].Journal of Clinical Immunoassay,1994,17(1):24-29. [12]Hawkins RC,Tan parison of the diagnostic utili⁃ty of CK,CKMB(activity and mass),troponin T and tro⁃ponin I in patients with suspected acute myocardial infar⁃tion[J].Singapore Med J,1999,40(11):680-684. [13]蒋翔,曹伟锋,江剑辉,等.干血片标本放置时间对葡
萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的影响[J].广东医学,2009,30 (9):1225-1228.
[14]Roth HJ,Leithftuser RM,Doppelmayr H,et al.Cardiospeci⁃ficity of the3rd generation cardiac troponin T assay dur⁃ing and after a216km ultra-endurance marathon run in Death Valley[J].Clin Res Cardiol,2007,96(6):359-364.
[15]李月影.血清肌酸激酶同工酶MB质量和活性检测临
床应用的比较[J].中外医疗,2011,30(13):73. [16]冯广满,张保红,冼土生,等.肌酸激酶同工酶质量检
测在心肌炎诊断中的优化应用方案[J].检验医学与临床, 2012,9(21):2707-2708.
[17]巴小强.血清超敏C反应蛋白及肌酸激酶同工酶水平
对急性心肌梗死的诊断价值[J].临床合理用药杂志,2018, 11(11C):119-120.
[18]谭宝玲.心血管病急诊患者心肌标志物升高的临床意
义[J].中国医学创新,2012,9(9):36-37.
(收稿日期:2020-05-28)。