生物化学蛋白质化学物大分子分离纯化主要方法

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5.正相色谱与反相色谱
正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极 性，因此，在这种层析过程中非极性分子或极性 小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱 中流出来。
反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极 性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小 的分子移动的速度快而先从柱中流出。
样品在层析时的移动速度可用迁移率Rf值表示：
样品原点到斑点中心的距离
Rf= ——————————————
样品原点到溶剂前沿的距离
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(一) 层析相关概念
1.固定相：
固定相是层析的一个基质。它可以是固体 物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等）， 也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维 素上的溶液），这些基质能与待分离的化 合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。 它对层析的效果起着关键的作用。
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二、层析法分类（按分离原理分类 ）
分配层析 吸附层析 凝胶过滤（分子筛层析） 离子交换层析 亲和层析 聚焦层析
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层析法分类（按装置分类 ）
纸层析 薄膜层析 柱层析
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洗脱液
样品 填充物 玻璃柱
分部收集
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各类层析的原理和载体
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沉淀法
盐析法、有机溶剂沉淀法、重金属盐
沉淀法、生物碱或酸类沉淀法、加热 变性沉淀法
分
离子交换层析 吸附层析
离
层析法
凝胶过滤（分子筛）
纯
亲和层析
化Biblioteka Baidu
等电聚集层析
方
电学法
电泳法
法
等电聚焦
离心法
透析
膜分离技术 超滤
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纯度鉴定 分子量测定
层析法：凝胶过滤; 高效液相色谱法(HPLC) 电泳法：PAGE、梯度凝胶电泳、等电聚焦电泳等 免疫化学法：专一的沉淀线
①被分离物质本身的性质；
②固定相和流动相的性质；
③层析柱的温度。
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4.分辨率（或分离度）
分辨率一般定义为：相邻两个峰的分开
程度。用Rs来表示。Rs值越大，两种组分 分离的越好。当Rs = 1时，两组分具有较好 的分离，互相沾染约2%，即每种组分的纯 度约为98%。当Rs=1.5时，两组分基本完 全分开，每种组分的纯度可达到99.8%。如 果两种组分的浓度相差较大时，尤其要求 较高的分辨率。
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2.流动相：
在层析过程中，推动固定相上待分离的 物质朝着一个方向移动的液体、气体或超 临界体等，都称为流动相。柱层析中一般 称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它 也是层析分离中的重要影响因素之一。
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3.分配系数及迁移率（或比移值）： 分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定 相和流动相中含量（浓度）的比值，常用K来表 示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。
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数值越大，表明基质对该物质的亲合力越强。 应当注意，同一种基质对不同种类分子的 操作容量是不相同的，这主要是由于分子 大小（空间效应）、带电荷的多少、溶剂 的性质等多种因素的影响。因此，实际操 作时，加入的样品量要尽量少些，特别是 生物大分子，样品的加入量更要进行控制， 否则用层析办法不能得到有效的分离。
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透析工作图
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半透膜原理
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层析技术（chromatography）p148
一、层析技术一般原理 二、层析技术分类及应用
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一、层析技术原理
层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析，其系统通 常由互不相溶的两个相组成：一是固定相（固体或吸附在固体 上的液体），一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合 物中各组分理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性 、分子亲和力、溶解度等）的差异，使各组分不同程度地分布 在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度 移动而最终被分离。
类别
分离原理
吸附层析
化学、物理吸附
分配层析
两溶剂相中的溶解效应
凝胶层析
分子筛效应的排阻效应
离子交换层析 离子基团的交换反应
亲和层析 聚焦层析
分离物与配体之间有 特殊亲和力 等电点和离子交换作用
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基质或载体
硅胶、氧化铝 、羟基磷酸
纤维素、硅藻土 、硅胶
sepharose 、sephadex
SDS- PAGE电泳法：测定亚基数 超速离心：成分均一 其它：如, 结晶法……
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透析
定义：利用半透膜把大小分子分开的方法。
操作
蛋白质溶液置半透膜袋中，置流动溶剂 （如蒸馏水）中，使小分子杂质（如无机盐、 单糖、双糖、AA、小肽等透出）蛋白质留于 袋中而得到分离。
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K=Cs/Cm
Cs: 固定相中的浓度，Cm: 流动相中的浓度。 迁移率（或比移值）是指：在一定条件下，在相同 的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相 本身移动的距离之比值。常用Rf来表示。
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相对迁移率：是指在一定条件下，在相同时 间内，某一组分在固定相中移动的距离与 某一标准物质在固定相中移动的距离之比 值。它可以小于等于1，也可以大于1。用 Rx来表示。分配系数主要与下列因素有关：
生物大分子分离纯化主要方法
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生物大分子分离纯化的一般步骤
层析法
电泳法
生物组织→无细胞提取液→粗产品→
→结晶 超离心法
超滤
│←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│
•材料选择与处理 •细胞破碎（机械破 碎、溶涨和自溶、 酶解、化学处理）
•盐析（硫酸铵盐析） •等点电沉淀 •有机溶剂沉淀 •透析
离子交换树脂 、纤维素、
葡聚糖
带配基的sepharose
或sephadex
多缓冲交换剂（与带有多种电
荷基团的配体相偶联的
sepharose 6B）
一般来说，分离纯化极性大的分子（带电离子等） 采用正相色谱（或正相柱），而分离纯化极性小 的有机分子（有机酸、醇、酚等）多采用反相色 谱（或反相柱）
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6. 操作容量（或交换容量）
在一定条件下，某种组分与基质（固定相） 反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容 量，我们称为操作容量（或交换容量）。 它的单位是毫摩尔（或毫克）/克（基质） 或毫摩尔（或毫克）/毫升（基质）