生物化学蛋白质化学物大分子分离纯化主要方法
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它在细胞内发挥着重要的功能。
由于蛋白质的复杂性和多样性，研究人员通常需要从复杂的混合物中分离和纯化蛋白质。
蛋白质的分离纯化是生物化学和生物技术领域中非常重要的一项工作，它为我们深入研究蛋白质的结构和功能提供了必要的条件。
蛋白质的分离纯化可以通过多种不同的方法实现，这些方法包括离心法、凝胶过滤法、电泳法、层析法等。
在选择合适的方法时，研究人员需要考虑到蛋白质的特性以及实验的要求。
离心法是最常用的分离方法之一，在离心过程中，通过调整离心力和离心时间，可以实现不同密度的蛋白质的分层。
这种方法适用于分离大分子量的蛋白质。
凝胶过滤法是利用孔径不同的凝胶将蛋白质分离开来。
通常使用的凝胶有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，这些凝胶具有不同的孔径，可以根据蛋白质的分子量选择合适的凝胶进行分离。
电泳法是基于蛋白质的电荷和分子量差异而进行分离的方法。
最常用的电泳方法是SDS-PAGE电泳，通过使用SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行解性和蛋白质间的形成复合物，使得蛋白质在电泳过程中仅仅受到电场力的影响，从而实现蛋白质的分离。
层析法是一种利用物质在载体上的分配和吸附性质进行分离的方法。
常见的层析方法有凝胶层析、亲和层析、离子交换层析等。
凝胶层析是通过利用载体颗粒的孔径进行分离，亲和层析是将特定配体固定在载体上，与目标蛋白质结合，从而实现分离，而离子交换层析是利用载体表面电荷与目标蛋白质的电荷相互作用进行分离。
在进行蛋白质的分离纯化时，需要注意以下几个关键步骤。
首先是样品制备，通常样品要经过细胞破碎、蛋白质提取等步骤，使得目标蛋白质从复杂的混合物中提取出来。
其次是样品的处理，包括去除杂质、调整蛋白质的溶液环境等。
然后是选择合适的分离方法，根据蛋白质的特性和实验要求来确定最适合的方法。
最后是纯化过程中的监测和分析，通过使用各种蛋白质分析方法，如SDS-PAGE、Western blot等，来确定目标蛋白质的纯化程度和鉴定其存在。
生物样品中生物大分子的分离纯化
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（六） 生物大分子的抽提
✓ “抽提”是将经过预处理或破碎了的细胞或组织置于一 定条件下和溶剂中，使被提取的生物大分子以溶解状态 充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不 丢失生物活性的过程。
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组织与细胞破碎
1、机械破碎法
✓ 研磨：这种方法比较柔和，适宜实验室使用； ✓ 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法。利用高速
旋转的叶片产生的剪切力将组织细胞破碎。处理材料量较大 时，经常使用。 ✓ 匀浆器：匀浆器用来破碎那些比较柔软，易于分散的组织细 胞。科研上若材料处理量少，可使用匀浆器。
生物大分子的 分离纯化和鉴定
生物分子（Biomolecule）泛指生物体特有的各类分子， 是自然存在于生物体中的分子的总称，是组成生命 的基本单位。
包括
小分子（如脂类、激素、维生素等） 生物大分子（蛋白质、核酸、糖复合物等）
什么是生物大分子？
生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分 的各种分子量达到上万或更多的有机分子，结构具 有一定的规律性，大多是由基本结构单位按一定顺 序和方式连接而形成的多聚体。
常见的生物大分子包括蛋白质(包括酶)、核酸、 多聚糖等。
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生物大分子分离纯化的特殊性
1. 生物材料的组成复杂，种类极多；分离纯化方法千 差万别，没有一种标准方法可通用于各种生物大 分子的分离制备。
2. 许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离 纯化的步骤多，流程长。
生物化学实验原理和方法
生物化学实验原理和方法
生物化学实验是研究生物体内化学反应的实验方法，主要用于研究生物体内分子结构、代谢途径、蛋白质结构和功能等方面的问题。
生物化学实验的基本原理是利用生物体内的生物分子（如蛋白质、核酸、酶等）进行化学反应或与其他物质相互作用，从而检测、分离或定量这些分子。
生物化学实验主要包括以下几个方面的原则和方法：
1. 分离与纯化：将某一特定生物分子从其他组分中分离出来，获得纯净的样品。
常用方法包括离心、电泳、柱层析、过滤等。
2. 分析与测定：对生物分子的含量、结构和性质进行定量或定性的研究。
常用方法包括分光光度法、荧光法、比色法、拉曼光谱等。
3. 酶反应：酶是生物体内催化生物化学反应的一类蛋白质，其活性与底物浓度、温度、pH值等因素有关。
通过测定底物转化率来研究酶的活性。
常见的酶反应方法有酶解反应、酶促进反应等。
4. 蛋白质分析：蛋白质是生物体内最为重要的分子之一，可以通过电泳、质谱、Western blot等方法进行分析，从而了解蛋白质的结构、含量和功能。
5. 核酸分析：核酸是生物体内遗传信息的主要载体，可以通过PCR、凝胶电泳、
Southern blot等方法进行分析，用于检测基因的突变、限制性片段长度多态性等。
以上是一些常用的生物化学实验原理和方法，实际的生物化学实验会根据具体的研究目的和问题而选择适合的方法和技术。
生化分离与分析的实验技术
生化分离与分析的实验技术生化分离与分析，是指对复杂的生物体或某个生物组织中的分子或化学物质进行分离、提取、纯化和鉴定的过程。
分析化学中的分离和定量方法主要是采用物理和化学方法，而生化技术则依靠生物化学和分子生物学等多个学科的综合应用，以分离和鉴定生物体内代谢物、大分子化合物、酶、蛋白质、细胞等物质。
生化分离技术包括电泳、色谱、相转移等，分析技术包括质谱分析、核磁共振分析、光谱分析等。
生物医学的许多研究都要求对复杂的生物体或其组织中的某些分子或化学物质进行分离、提取、纯化和鉴定，从而为治疗某些疾病和疾病的诊断提供依据。
电泳技术是目前最常用的生化分离技术之一，通过直流电场和各种形式的凝胶中蛋白质、核酸和碳水化合物的电泳分离，不仅可以分析分子量大小，还可以确定它们的化学性质。
不同种类的凝胶（聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等）结合不同的分离手段（水平凝胶电泳、垂直凝胶电泳等）可以突显不同的生物学特性，为生物医学研究提供了基础。
色谱技术是一种自动化的分离技术，根据物质在特定固相材料上的不同亲和性，可将物质分为各个组分，一般用于化合物和蛋白质的分离和纯化。
水相与有机相的组合使用，可有效地降低样品的复杂度。
现在已经广泛应用于代谢产物、生物大分子的分离和分析中，其中最为常见的是高效液相色谱技术（HPLC）。
相转移或者液相液相萃取（LLE）是从有机溶液或水溶液中提纯物质的常用方法。
它通常涉及相对互不相容的溶剂对溶液的添加和倾倒，通过可控制的酸、碱、盐等添加而将目标物至于有机溶剂的一层中，防止其溶入水相。
这是许多蛋白质，抗生素和生物分子分离和纯化过程中的一个重要步骤。
质谱是分析和鉴定化合物结构和化学反应的技术，通过通过分析离子在加速电场中运动的质量和质量-电荷比，以评估化合物结构。
因此，它是新药物在药理学领域中的发展所必需的技术。
质谱技术已经广泛用于发现新药物、生物标识物和蛋白质翻译后修饰等方面的研究。
在定量上，核磁共振（NMR）和光谱学（UV/Vis，荧光等）是最常用的技术之一。
分离纯化的方法
分离纯化的方法分离纯化是化学、生物学和生物化学领域中一个非常重要的步骤，它用于从混合物中分离出所需的化合物或生物分子，并去除杂质。
在实验室中，科研人员经常需要使用各种方法对混合物进行分离纯化，以便进行后续的实验或应用。
本文将介绍几种常见的分离纯化方法，包括过滤、结晶、色谱和电泳等。
首先，过滤是一种常见的分离纯化方法，它利用不同大小的孔径来分离固体颗粒和溶液。
通过选择合适的滤膜或过滤纸，可以将溶液中的固体颗粒或大分子物质过滤掉，从而得到较为纯净的溶液。
过滤是一种简单易行的方法，广泛应用于实验室中。
其次，结晶是一种常用的固体分离纯化方法。
当溶液中的溶质浓度超过其溶解度时，溶质会结晶沉淀出来，从而实现分离纯化的目的。
通过适当的溶剂选择和控制结晶条件，可以得到纯度较高的晶体产物。
另外，色谱技术是一种高效的分离纯化方法，它根据化合物在固定相和流动相之间的分配系数来实现分离。
常见的色谱方法包括薄层色谱、柱层析色谱和高效液相色谱等，它们可以根据化合物的性质和分子大小选择合适的分离方法，从而得到高纯度的化合物。
最后，电泳是一种常用的生物分子分离纯化方法，它根据生物分子在电场中的迁移速度差异来实现分离。
电泳可以根据分子的电荷、大小和形状进行选择性分离，常用于蛋白质、核酸和多肽等生物分子的分离纯化。
综上所述，分离纯化是化学、生物学和生物化学领域中非常重要的实验步骤，它涉及到多种方法和技术。
通过选择合适的分离纯化方法，可以有效地从混合物中分离出所需的化合物或生物分子，并得到高纯度的产物，为后续的实验和应用奠定基础。
在实际操作中，科研人员应根据实验要求和样品特性选择合适的分离纯化方法，以确保实验顺利进行并取得理想的结果。
【生物化学】第八章 蛋白质的分离纯化
㈤、凝胶过滤层析技术
⒈ 基原理
概念（排阻层析，分子筛层析）： 当生物大分子通过装有凝胶颗粒 的层析柱时，根据它们分子大小 不同而进行分离的技术。 原理：凝胶颗粒内部具有多孔网 状结构，被分离的混合物流过层 析柱时，比凝胶孔径大的分子不 能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之 间的空隙向下移动，并最先被洗 脱出来； 比网孔小的分子能不同程度的自 由出入凝胶孔内外，在柱内经过 的路程较长移动速度较慢，最后 被洗脱出来。
⒊ 分配纸层析
纤维素吸附的水是固定相，展层用的有 机溶剂是流动相
层析时混合氨基酸在这两相中不断分配， 使他们分布在滤纸的不同位置上。
此项技术可用于氨基酸成分的定量定性 测定。
⒊ 分配纸层析
操作：点样→展层→显 色用茚三酮显色时，得到 一个滤纸层析谱。 定义：原点到氨基酸停 留点的距离与原点至溶剂 前沿之比称为Rf值。 只要把溶剂系统、温度、 滤纸型号等条件确定，则 每一种氨基酸的Rf值是一 个确定值。
⒊ 分析型超速离心机
XL-A分析型超速离 心机 主要技术指标： 检测波长范围 200nm800nm 转子最大转速 40000RPM
什么是酶的活性中心？ 三维结构上比较接近的少数特异的氨基酸残基参与底物的 结合与催化作用，这一与酶活力直接相关的区域称酶的活 性部位。 在很多酶的活性中心均有His残基参与，原因是什么? 酶蛋白分子中组氨酸侧链咪唑基pK值为6.0-7.0，在生理条 件下，一半解离，一半不解离，因此既可以做质子供体，也 可以做质子受体，可以作为广义酸碱共同催化反应。 胰凝乳蛋白酶活性中心的催化三联体是指哪三种氨基酸？
⑵ 按两相所处的状态分类 流动相有两种状态：
*液体作为流动相 *气体作为流动相 固定相也有两种状态： *固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相
常见的生物化学实验方法
常见的生物化学实验方法生物化学实验是研究生物分子结构、功能和相互作用的重要手段，广泛应用于生物医学研究、药物开发和环境保护等领域。
本文将介绍一些常见的生物化学实验方法。
一、色谱技术色谱技术是一种分离和分析物质的方法，根据分子的化学性质和大小差异，将混合物分离成各个组分。
常见的色谱技术包括气相色谱（GC）、液相色谱（LC）和薄层色谱（TLC）等。
在生物化学实验中，色谱技术常用于对生物样品中的分子进行纯化和分析。
例如，气相色谱可用于分析氨基酸和脂肪酸等小分子化合物，液相色谱则可以用于分离蛋白质、核酸和多糖等生物大分子。
二、电泳技术电泳技术是利用电场作用下物质的电荷和大小差异，将混合物分离成各个组分的方法。
常见的电泳技术包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和凝胶过滤电泳等。
在生物化学实验中，电泳技术常用于分离和检测蛋白质和核酸等生物大分子。
例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于分离和测定蛋白质分子量，SDS-PAGE则可以用于检测蛋白质的纯度。
三、质谱技术质谱技术是利用质量分析仪器对物质的质量和结构进行分析的方法。
常见的质谱技术包括质谱仪、飞行时间质谱（TOF-MS）和液相色谱质谱联用（LC-MS）等。
在生物化学实验中，质谱技术常用于鉴定和定量生物分子。
例如，利用质谱仪可以对蛋白质进行鉴定，通过测定样品中蛋白质的质量和碎片离子的质量谱图，确定蛋白质的氨基酸序列。
四、核酸杂交技术核酸杂交技术是利用互补的DNA或RNA序列进行结合，从而检测目标序列的方法。
常见的核酸杂交技术包括Southern blot、Northernblot和in situ hybridization等。
在生物化学实验中，核酸杂交技术常用于检测和定量特定DNA或RNA序列的存在。
例如，Southern blot可用于检测DNA片段在基因组中的分布和拷贝数，Northern blot则可用于检测特定mRNA的表达水平。
常用的蛋白质纯化方法和原理
常用的蛋白质纯化方法和原理蛋白质的纯化是生物化学研究中非常重要的一步，纯化蛋白质可以用于结构解析、功能研究、动态过程研究等各种生物学实验。
常用的蛋白质纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换色谱法、亲和色谱法、逆渗透法和层析法等。
下面将对这些方法的原理和步骤进行详细阐述。
1. 盐析法盐析法是根据蛋白质在溶液中的溶解性随盐浓度的变化而变化的原理进行蛋白质的纯化。
该方法是利用蛋白质在高盐浓度下与水结合能力降低，使其从溶液中沉淀出来。
应用盐析法时，需要先调节溶液的盐浓度使蛋白质溶解，然后逐渐加入盐使其过饱和，蛋白质便会析出。
最后通过离心将蛋白质的沉淀物分离，得到纯化的蛋白质。
2. 凝胶过滤法凝胶过滤法是利用凝胶的pores 来分离蛋白质的一种方法。
凝胶通常是聚丙烯酰胺（也称作Polyacrylamide）或琼脂糖。
研究者将蛋白质样品加入到过滤膜上，较小的蛋白质能够通过pores，较大的分子则被排出。
通过选择不同大小的凝胶孔径，可以根据蛋白质的大小来选择合适数目的过滤膜。
凝胶过滤法需要进行缓冲液体积的连续换流，将蛋白质与其他杂质分离开来。
3. 离子交换色谱法离子交换色谱法是利用蛋白质与离子交换基质之间静电吸引力的不同而分离的方法。
离子交换基质通常是富含正离子或负离子的高分子材料。
在离子交换色谱法中，样品溶液在特定的pH 下流经离子交换基质，带有不同电荷的蛋白质能够与基质发生反应，吸附在基质上。
为了获得纯化蛋白质，需要通过梯度洗脱，逐渐改变缓冲液pH 或离子浓度，使吸附在离子交换基质上的蛋白质逐渐释放出来。
4. 亲和色谱法亲和色谱法是利用蛋白质与特定的配体相互作用特异性进行分离的方法。
配体可以是天然物质，如金属离子、辅酶或抗体，也可以是人工合成的结构。
在亲和色谱法中，样品溶液经过含有配体的固定相，与配体发生特异性相互作用，蛋白质与其它组分分离。
然后可以通过改变某些条件（如pH、温度或离子浓度）来洗脱纯化的蛋白质。
生物化学中的分析方法
生物化学中的分析方法在生物化学领域中，分析方法是研究生物分子结构和功能的重要手段。
通过不同的分析方法，我们可以揭示生物体内的化学成分、代谢过程、分子结构以及生物分子的相互作用，进而深入了解生物体的生理与病理过程。
本文将通过以下几种典型的生物化学分析方法，介绍它们的原理和应用。
一、质谱分析方法质谱分析是一种基于分子离子间的相互作用原理的分析方法。
它通过将样品中的分子离子化，利用质谱仪测量并分析其质量荷比，从而确定分子的质量和结构。
质谱分析方法在生物化学中具有广泛应用，例如质谱在蛋白质组学中的鉴定和定量分析、代谢产物的鉴定、药物分析等。
常见的质谱分析方法包括质谱仪的MALDI-TOF、ESI-MS等。
二、核磁共振分析方法核磁共振（NMR）是通过测量位于外加磁场中的核自旋能级差的吸收和发射电磁辐射而进行的分析技术。
核磁共振分析方法可以用于研究物质的结构、动力学和相互作用等。
在生物化学中，核磁共振技术广泛应用于蛋白质、核酸及小分子的结构解析、代谢产物的定量分析以及药物研发等方面。
常见的核磁共振分析方法包括1H-NMR、13C-NMR以及2D-NMR等。
三、色谱分析方法色谱分析是一种通过样品组分在移动相和固定相之间的分配系数差异进行分离和分析的技术。
在生物化学中，色谱分析方法具有重要的应用，例如气相色谱（GC）和液相色谱（LC）可以用于化合物的分离和检测，固相萃取（SPE）可以用于样品的富集和净化。
此外，高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）技术也是常用的生物化学分析手段，用于复杂样品中的成分分离和鉴定。
四、电泳分析方法电泳分析是一种利用电场作用下，带电粒子在介质中的运动进行分离和检测的方法。
在生物化学中，凝胶电泳（如SDS-PAGE和琼脂糖凝胶电泳）常用于蛋白质的分离和纯化，毛细管电泳可用于核酸和蛋白质的分离和定量。
此外，凝胶滤析和等电聚焦等电泳技术也是生物化学研究中常用的分析方法。
综上所述，生物化学中的分析方法是研究生物分子结构和功能的重要手段，包括质谱分析方法、核磁共振分析方法、色谱分析方法以及电泳分析方法等。
蛋白质分离纯化的一般程序
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。
所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。
常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3. 反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。
这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。
抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。
如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。
在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。
（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。
比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。
常用的有下列几种方法：1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。
2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。
被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。
3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。
能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。
此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。
由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。
生物活性物质的分离纯化与结构分析
生物活性物质的分离纯化与结构分析生物活性物质是指具有一定的生物学活性和功能的化学物质，包括生物分子、天然产物和药物等。
对于这些物质的提取、分离和纯化以及结构研究，一直是生物化学、药学、医学等研究领域中的热点问题。
本文将从从分离纯化的方法、技术，以及结构分析入手，探讨生物活性物质研究的相关知识。
一、生物活性物质的分离纯化方法生物活性物质一般是复杂的混合物，包括多种成分。
如何从中分离出目标成分并纯化至足够的程度成为分离纯化技术的关键所在。
以下将介绍几种常用的分离纯化方法：1. 薄层层析法薄层层析法是利用结果分子在不同介质（多以硅胶、氧化铝、硅胶钙等为基质）上的吸附和分配特性进行分离纯化的一种方法。
该方法可用于富集生物样品中的目标分子，快速、简便、经济，适用于小分子的分离纯化。
2. 柱层析法柱层析法是用柱状填料作为固相基质，通过溶液在固相基质上的分配和吸附特性，对细胞结构或混合液中的大分子进行分离纯化的方法。
柱层析法操作方便，可以简单分离大分子的蛋白质和核酸等，利用分子量筛选不同分子量大小的蛋白质和富集其活性成分，也可用于中小分子自然化合物的纯化。
3. 电泳法电泳法是将样品分子经电荷分离在电场中移动，根据分子大小、形状、电荷等特性在电场中进行分离的一种方法。
电泳法广泛应用于核酸、蛋白质等大分子分离纯化和分子结构研究中。
二、分子结构分析方法在生物活性物质的分离纯化的基础上，为了了解目标分子的结构和性质，就需要进行分子结构分析。
下面将简略介绍几种常用的分子结构分析方法：1. 光谱学光谱学依据分子吸收、发射、散射、旋转、振动等各种不同的现象，研究分子的结构和特性的一些学科。
常用的光谱学技术有紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱、荧光光谱等，可以大大提高对于目标分子的了解和认识。
2. 质谱学质谱学是把目标分子进行过质子化处理，然后通过对离子进行光、电极、磁场等多个波长的激发，来得到离子的质荷比的法师。
该方法广泛用于蛋白质、药物等大分子物质的结构鉴定和质量分析。
(生物化学)蛋白质分离纯化技术
蛋白质分离纯化技术摘要：蛋白质分离纯化是蛋白质产品工业化生产的关键之一。
本文分析了蛋白质分离纯化的特点及一般原则；综述了蛋白质分离纯化的传统技术：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水作用层析、高效液相色谱层析(HPLC)、电泳法等及新型技术：亲和超滤、内含肽介导的蛋白质亲和纯化。
关键词：蛋白质分离纯化蛋白质是生命的物质基础,是生命活动的最终控制者和直接执行者,它参与生物体内几乎所有的生命活动过程,如生长、发育、遗传、代谢、应激、能量转换、信号传导等。
以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向。
对蛋白质进行纯化，得到高纯度的"高活性的蛋白质是生物学科研人员经常要面对的问题。
蛋白质的分离纯化主要包括4个步骤：预处理、蛋白质的抽提、蛋白质的粗分级和蛋白质的分离纯化[1]。
本文针对近年来有关蛋白质的分离纯化技术所取得的进展进行了综述,为今后的理论和应用研究提供依据。
1 蛋白质分离纯化的特点及一般原则1.1蛋白质分离纯化的特点1）大多数蛋白质产品是生物活性物质,在分离纯化过程中,有机溶剂、溶液pH值、离子强度的变化均可使蛋白质变性失活。
2）蛋白质产品在物料中含量很低,且物料组成非常复杂。
例如,利用基因工程菌发酵生产蛋白质,物料中含有大量组成复杂的培养基、菌体生产代谢物等,目标蛋白质的含量常常不到蛋白质总量的1%。
有些目标蛋白质存在于细胞内或在胞内形成包含体,为获取蛋白质,还需进行细胞破碎,结果物料中含有大量的细胞碎片和胞内产物。
3）含蛋白质产品的物料不稳定,蛋白质产品易受料液中蛋白水解酶降解。
4）很多蛋白质产品作为医药、食品被人类利用,因而要求蛋白质产品必须是高度纯化的,产品无菌、无致热源等[2]。
1.2蛋白纯化的一般原则1）蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质的分离纯化方法2.1根据分子大小不同进行分离纯化蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开，并使蛋白质混合物也得到分离.根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。
透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。
透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中，再浸入透析液进行分离。
超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。
这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。
它们经常和盐析、盐溶方法联合使用，在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐.由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢，截流物质的分子量也越来越小。
所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。
当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。
例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中，加入纤维素酶和α—淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3］。
使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度（区带）离心。
常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度.可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。
密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白，得到的产品纯度高但产量偏低。
蒋辰等［6］通过比较不同密度梯度介质的分离效果，利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白.凝胶过滤也称凝胶渗透层析，是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。
凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之，比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外.目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。
分离纯化方法
分离纯化方法分离纯化方法是生物化学和生物工程领域中非常重要的一环，它涉及到从混合物中分离出目标物质并将其纯化的过程。
在生物制药、生物能源、食品工业等领域，分离纯化方法的选择直接影响到产品的质量和产量。
因此，科学家们不断努力探索新的分离纯化方法，以满足不同领域的需求。
一、离心法。
离心法是一种常用的分离纯化方法，它利用离心机对混合物进行高速离心，通过不同组分的密度差异来分离它们。
离心法适用于细胞、蛋白质、病毒等生物颗粒的分离纯化，操作简单、速度快、效果明显。
但是，离心法对设备要求较高，成本较大，且无法对分子量相近的物质进行有效分离。
二、层析法。
层析法是一种基于物质在固定相和流动相之间分配系数不同而进行分离的方法。
常见的层析法包括凝胶层析、离子交换层析、亲和层析等。
层析法适用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分离纯化，具有分离效果好、适用范围广的优点。
然而，层析法操作复杂，耗时较长，且需要较多的试剂和设备支持。
三、电泳法。
电泳法是利用物质在电场中的迁移速度差异来进行分离的方法，常见的电泳法包括凝胶电泳、毛细管电泳、等电聚焦等。
电泳法适用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分离纯化，具有分辨率高、操作简便的特点。
但是，电泳法对样品的要求较高，且不适用于大规模生产。
四、超滤法。
超滤法是利用滤膜对混合物进行筛选分离的方法，常见的超滤法包括微滤、纳滤、超滤等。
超滤法适用于蛋白质、多糖、细胞等生物颗粒的分离纯化，具有操作简单、设备易得的优点。
然而，超滤法对样品浓度和粘度有一定要求，且易受到膜的污染和堵塞。
五、结合技术。
在实际应用中，常常需要结合多种分离纯化方法来达到更好的效果。
比如，可以先利用离心法去除大颗粒杂质，再通过层析法进行进一步纯化。
结合技术可以充分发挥各种方法的优势，提高分离纯化的效率和纯度。
总结。
分离纯化方法的选择应根据具体的实验要求和目标物质的特性来确定，需要综合考虑分离效果、成本、操作难度等因素。
蛋白质分离的方法
蛋白质分离的方法蛋白质分离是一种常用的生物化学技术，用于从混合物中分离和纯化蛋白质。
以下是几种常用的蛋白质分离方法：1. 沉淀法：沉淀法是最简单和最常用的蛋白质分离方法之一。
它利用蛋白质在水溶液中的溶解度差异，通过添加适量的盐、有机溶剂或高分子化合物等沉淀剂，使目标蛋白质从溶液中沉淀出来。
常用的沉淀剂包括硫酸铵、乙醇、丙酮等。
2. 凝胶色谱法：凝胶色谱法是一种基于分子大小分离蛋白质的方法。
它利用凝胶颗粒构成的凝胶柱作为分离介质，将混合物中的蛋白质通过洗脱液进行洗脱。
不同大小的蛋白质分子通过凝胶柱时，会根据其大小被不同程度地阻滞，从而实现分离。
3. 电泳法：电泳法是利用蛋白质分子在电场中的迁移率差异进行分离的方法。
它通过在电场中施加不同的电压和电流，使蛋白质分子在电场中移动。
不同大小的蛋白质分子在电场中的迁移率不同，从而实现分离。
常见的电泳法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、醋酸纤维素膜电泳等。
4. 亲和色谱法：亲和色谱法是一种利用蛋白质与固定相之间的特异性亲和力进行分离的方法。
它通过将目标蛋白质与固定相之间的特异性结合，实现与其他蛋白质的分离。
亲和色谱法通常与其他色谱技术结合使用，如离子交换色谱、凝胶色谱等。
5. 高效液相色谱法：高效液相色谱法是一种高分辨率、高速度的蛋白质分离方法。
它利用高压泵将混合物中的蛋白质通过固定相和流动相之间的分配进行分离。
高效液相色谱法具有高分辨率和高速度的优点，适用于大规模蛋白质分离和纯化。
以上是常见的蛋白质分离方法，每种方法都有其优缺点和适用范围。
在实际应用中，需要根据实验要求和目标蛋白质的性质选择合适的方法或方法组合来实现蛋白质的分离和纯化。
蛋白质化学研究方法和思路
蛋白质化学研究方法和思路蛋白质化学研究是生物化学领域的一个重要分支，它涉及对蛋白质的结构、功能、相互作用和生物合成的深入研究。
以下是蛋白质化学研究的一些常见方法和思路。
1. 蛋白质分离和纯化：通过各种色谱技术（如凝胶过滤、离子交换、亲和色谱等）从混合物中分离目标蛋白质。
使用电泳技术（如SDS-PAGE）对蛋白质进行分子量分析。
2. 蛋白质结构分析：通过X射线晶体学获得蛋白质的三维结构。
利用核磁共振（NMR）光谱学分析蛋白质的二维结构。
通过冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术观察蛋白质的近原子分辨率结构。
3. 蛋白质功能研究：通过体外酶活实验研究蛋白质的催化功能。
利用细胞生物学实验（如共转染、基因敲除等）研究蛋白质在细胞中的功能。
通过蛋白质相互作用分析（如免疫沉淀、酵母双杂交等）研究蛋白质与其他分子的相互作用。
4. 蛋白质修饰研究：分析蛋白质的磷酸化、乙酰化、泛素化等修饰形式。
研究修饰对蛋白质结构和功能的影响。
5. 蛋白质表达调控：研究蛋白质的转录后调控机制，如miRNA、转录因子等对蛋白质表达的影响。
分析蛋白质的降解途径和稳定性。
6. 蛋白质组学：利用高通量质谱技术对蛋白质进行鉴定和定量分析。
通过蛋白质组学数据挖掘，发现新的蛋白质功能和研究途径。
7. 计算生物学方法：利用生物信息学工具（如SwissProt、UniProt等）查询和分析蛋白质序列信息。
通过分子对接和分子动力学模拟研究蛋白质与配体的相互作用。
8. 系统生物学：研究蛋白质在生物网络中的角色和功能。
利用系统生物学方法分析蛋白质在复杂生物过程中的作用。
在进行蛋白质化学研究时，通常需要综合运用多种技术和方法，以获得全面的研究结果。
研究过程中，科学家们会根据研究目标和问题，选择合适的研究方法和实验设计，以揭示蛋白质在生命活动中的重要作用。
蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法
蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法文章出处：朱敏蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度降低。
有机溶剂与水作用能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。
常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，由于有机溶剂的加入易引起变性失活，尤其乙醇和水混合释放热量，操作一般宜在低温下进行，且在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以免局部浓度过大。
用此法所析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降。
分离后的蛋白质沉淀应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。
操作时的pH 值大多数控制在待沉淀蛋白质等电点附近。
有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性和提高分离的效果。
一般在有机溶剂沉淀时添加中性盐的浓度在0.05mol 左右, 过多不仅耗费有机溶剂, 而且可能导致沉淀不好. 沉淀的条件一经确定, 就必须严格控制, 才能得到重复性结果. 有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度素示. 故操作条件比盐析法严格。
许多有机溶剂，如碳链较长的醇，它溶于水，但有限度。
其量大到一定程度后则分成两相，一相以水为主，一相以有机溶剂为主。
某些第3组分的存在可以改变两相的比例和组成。
有许多蛋白质在两相中均能溶解，形成分配。
在同一个两相的溶剂系统中，不同的蛋白质有不同的分配系数。
根据这一原理，操作全部机械化的有逆流分溶。
因要求实验室温度恒定且操作也繁杂，虽一直有人在用但很不普遍。
分配层析也是应用这一原理，但在分离纯化蛋白质工作中用得不多，主要是因为多数蛋白质在有机溶剂中，特别是在易与水分相的溶剂中溶解度小且易变性。
疏水层析是近年发展的新方法。
它利用蛋白质表面有一部分疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。
洗脱时将盐浓度逐渐降低，蛋白质因疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化。
生物化学实验技术(2)常用分离技术
二．硫酸铵的使用
硫酸铵中常含有少量的重金属离子， 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基 有敏感作用，使用前必须用H 处理： 有敏感作用，使用前必须用H2S处理：将硫酸铵配成浓 溶液，通入H 饱和，放置过夜， 溶液，通入H2S饱和，放置过夜，用滤纸除去重金属离 浓缩结晶，100℃烘干后使用 烘干后使用。 子，浓缩结晶，100℃烘干后使用。 另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左 另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左 ），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。 使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH 右），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。
第三节 其他沉淀法一．Fra bibliotek电点沉淀法 二．生成盐复合物沉淀法 三． 选择性变性沉淀 四．非离子多聚物沉淀法
一．等电点沉淀法
两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低， 两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的 两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。 两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。 利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性， 利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性， 不然盲目使用十分危险。 不少蛋白质与金属离子结合后， 不然盲目使用十分危险。 不少蛋白质与金属离子结合后，等 电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH 电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH 值。 等电点法常与盐析法、 等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联 合使用，以提高其沉淀能力。 合使用，以提高其沉淀能力。
使用硫酸铵时： 使用硫酸铵时：
1）必须注意饱和度表中规定的温度，一般有0℃或室温两种， ）必须注意饱和度表中规定的温度，一般有 ℃或室温两种， 加入固体盐后体积的变化已考虑在表中； 加入固体盐后体积的变化已考虑在表中； 2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化。一种 ）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化。 蛋白质如经二次透析，一般来说，第一次盐析分离范围（ 蛋白质如经二次透析，一般来说，第一次盐析分离范围（饱 和度范围）比较宽，第二次分离范围较窄。 和度范围）比较宽，第二次分离范围较窄。 3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或 ）盐析后一般放置半小时至一小时， 离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下， 离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下，硫 酸铵密度较大， 酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心速度和长时间的离 心操作，耗时耗能。离心多用于低浓度硫酸铵溶液。 心操作，耗时耗能。离心多用于低浓度硫酸铵溶液。
生物化学中的蛋白质表达和纯化
生物化学中的蛋白质表达和纯化蛋白质是细胞中最基本的生物大分子之一，具有重要的结构和功能作用。
在生化实验研究中，常常需要大量的蛋白质作为实验材料。
蛋白质表达和纯化技术是生物化学研究中的关键技术之一。
本文将简要介绍蛋白质表达和纯化的原理和方法。
一、蛋白质表达技术蛋白质表达是将目的基因转录成RNA后再翻译成蛋白质的过程。
蛋白质表达主要有原核细胞和真核细胞两种方法。
原核细胞表达系统主要利用大肠杆菌，真核细胞表达系统则使用哺乳动物细胞，其主要的表达技术有以下几种：（一）重组蛋白质大规模表达重组蛋白质是指人为构建的同源或异源蛋白序列，利用基因工程技术将其导入到表达宿主中进行高效表达的蛋白质。
大肠杆菌是目前最常用的宿主。
一般来说，要将目的基因插入到选择性表达载体中，选用合适的启动子和终止子，将目的蛋白质与标签结合。
表达宿主随后被转化，蛋白质在生长过程中表达出来，随后进行纯化和鉴定。
（二）GST融合蛋白表达GST融合蛋白是利用GST (glutathione S-transferase)标签的蛋白质，将GST和目的蛋白质融合在一起表达，然后通过Glutathione 亲和层析纯化方法纯化目的蛋白质。
GST融合蛋白可以提高目的蛋白质的稳定性和可溶性，使得其在细胞内表达更加稳定。
（三）His标签蛋白表达His标签是一种聚组氨酸标签，可以与Ni2+螯合，因此可采用Ni2+亲和层析的方法纯化。
His标签融合蛋白表达时选择了较少的氨基酸标签，对目标蛋白的生物学性质和功能影响较小。
二、蛋白质纯化技术蛋白质表达和纯化是蛋白质生物化学研究的关键。
通常情况下，表达宿主细胞中的蛋白质必须经过纯化才能得到纯净的蛋白质，获得足够高纯度的蛋白质可用于测定其结构和功能。
（一）离子交换层析法离子交换层析法是利用蛋白质负荷（或正荷）的离子性质与相应的离子交换质团之间进行选择性结合的纯化方法。
离子交换层析法分为阴离子交换层析和阳离子交换层析两种。
蛋白质分离纯化注意事项
蛋白质分离纯化注意事项蛋白质分离纯化是研究生物学和生物化学中十分重要的工作，其目的是从复杂的混合物中得到纯净的目标蛋白质并获得足够的数量进行进一步研究。
蛋白质分离纯化的注意事项包括选择适当的方法、合理设计实验方案、注意实验条件和操作细节的优化等。
首先，选择适当的方法是蛋白质分离纯化的关键。
常用的蛋白质分离纯化方法包括离心、沉淀、柱层析、电泳、过滤、亲和纯化和逆流高效液相色谱等。
根据目标蛋白质的理化性质和分子量，选择最适合的分离纯化方法。
如果目标蛋白质是溶液中的最丰富成分，则可以采用沉淀和过滤的方法进行分离纯化；如果目标蛋白质在混合物中含量较低，则需要采用高效的柱层析法进行富集分离纯化。
其次，合理设计实验方案是蛋白质分离纯化的重要一步。
在设计实验方案时，需要考虑分离纯化的目标、混合物的复杂程度、样品的来源和特性等因素。
根据这些因素，确定实验前的准备工作，如提取样品、选择合适的层析介质、其它辅助试剂的选择等。
同时，还需考虑蛋白质的稳定性和活性，在分离纯化过程中尽量减少对目标蛋白质的损伤和失活。
第三，注意实验条件的优化是蛋白质分离纯化过程中不可忽视的一点。
实验条件的优化包括温度、pH值、离子浓度等因素的调节，这些因素会影响蛋白质的结构和稳定性。
在柱层析法中，选择合适的缓冲液和洗脱液，调节洗脱梯度和离子浓度以达到最佳的分离纯化效果。
在电泳和过滤等方法中，要注意保持适当的温度和pH值，以保证分离纯化的稳定性和高效性。
最后，操作细节的优化也是蛋白质分离纯化的关键之一。
在操作中应注意减少目标蛋白质的损失和污染。
采用无菌的操作技术和设备，避免细菌、真菌和病毒等污染蛋白质样品。
同时，注意操作时的温度控制、搅拌速度和时间等细节，以确保操作的稳定性和可重复性。
总之，蛋白质分离纯化是一项重要且复杂的工作，需要根据目标蛋白质的特性选择合适的方法，并进行合理的实验方案设计。
在实验过程中，需要注意实验条件的优化和操作细节的优化，以获得高纯度和高活性的蛋白质样品。
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沉淀法
盐析法、有机溶剂沉淀法、重金属盐
沉淀法、生物碱或酸类沉淀法、加热 变性沉淀法
分
离子交换层析 吸附层析
离
层析法
凝胶过滤（分子筛）
纯
亲和层析
化
等电聚集层析
方
电学法
电泳法
法
等电聚焦
离心法
透析
膜分离技术 超滤
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3
纯度鉴定 分子量测定
层析法：凝胶过滤; 高效液相色谱法(HPLC) 电泳法：PAGE、梯度凝胶电泳、等电聚焦电泳等 免疫化学法：专一的沉淀线
生物大分子分离纯化主要方法
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生物大分子分离提取液→粗产品→
→结晶 超离心法
超滤
│←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│
•材料选择与处理 •细胞破碎（机械破 碎、溶涨和自溶、 酶解、化学处理）
•盐析（硫酸铵盐析） •等点电沉淀 •有机溶剂沉淀 •透析
SDS- PAGE电泳法：测定亚基数 超速离心：成分均一 其它：如, 结晶法……
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透析
定义：利用半透膜把大小分子分开的方法。
操作
蛋白质溶液置半透膜袋中，置流动溶剂 （如蒸馏水）中，使小分子杂质（如无机盐、 单糖、双糖、AA、小肽等透出）蛋白质留于 袋中而得到分离。
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二、层析法分类（按分离原理分类 ）
分配层析 吸附层析 凝胶过滤（分子筛层析） 离子交换层析 亲和层析 聚焦层析
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层析法分类（按装置分类 ）
纸层析 薄膜层析 柱层析
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洗脱液
样品 填充物 玻璃柱
分部收集
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各类层析的原理和载体
K=Cs/Cm
Cs: 固定相中的浓度，Cm: 流动相中的浓度。 迁移率（或比移值）是指：在一定条件下，在相同 的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相 本身移动的距离之比值。常用Rf来表示。
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相对迁移率：是指在一定条件下，在相同时 间内，某一组分在固定相中移动的距离与 某一标准物质在固定相中移动的距离之比 值。它可以小于等于1，也可以大于1。用 Rx来表示。分配系数主要与下列因素有关：
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数值越大，表明基质对该物质的亲合力越强。 应当注意，同一种基质对不同种类分子的 操作容量是不相同的，这主要是由于分子 大小（空间效应）、带电荷的多少、溶剂 的性质等多种因素的影响。因此，实际操 作时，加入的样品量要尽量少些，特别是 生物大分子，样品的加入量更要进行控制， 否则用层析办法不能得到有效的分离。
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2.流动相：
在层析过程中，推动固定相上待分离的 物质朝着一个方向移动的液体、气体或超 临界体等，都称为流动相。柱层析中一般 称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它 也是层析分离中的重要影响因素之一。
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3.分配系数及迁移率（或比移值）： 分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定 相和流动相中含量（浓度）的比值，常用K来表 示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。
离子交换树脂 、纤维素、
葡聚糖
带配基的sepharose
或sephadex
多缓冲交换剂（与带有多种电
荷基团的配体相偶联的
sepharose 6B）
①被分离物质本身的性质；
②固定相和流动相的性质；
③层析柱的温度。
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4.分辨率（或分离度）
分辨率一般定义为：相邻两个峰的分开
程度。用Rs来表示。Rs值越大，两种组分 分离的越好。当Rs = 1时，两组分具有较好 的分离，互相沾染约2%，即每种组分的纯 度约为98%。当Rs=1.5时，两组分基本完 全分开，每种组分的纯度可达到99.8%。如 果两种组分的浓度相差较大时，尤其要求 较高的分辨率。
类别
分离原理
吸附层析
化学、物理吸附
分配层析
两溶剂相中的溶解效应
凝胶层析
分子筛效应的排阻效应
离子交换层析 离子基团的交换反应
亲和层析 聚焦层析
分离物与配体之间有 特殊亲和力 等电点和离子交换作用
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基质或载体
硅胶、氧化铝 、羟基磷酸
纤维素、硅藻土 、硅胶
sepharose 、sephadex
5
透析工作图
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半透膜原理
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7
层析技术（chromatography）p148
一、层析技术一般原理 二、层析技术分类及应用
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一、层析技术原理
层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析，其系统通 常由互不相溶的两个相组成：一是固定相（固体或吸附在固体 上的液体），一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合 物中各组分理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性 、分子亲和力、溶解度等）的差异，使各组分不同程度地分布 在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度 移动而最终被分离。
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5.正相色谱与反相色谱
正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极 性，因此，在这种层析过程中非极性分子或极性 小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱 中流出来。
反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极 性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小 的分子移动的速度快而先从柱中流出。
一般来说，分离纯化极性大的分子（带电离子等） 采用正相色谱（或正相柱），而分离纯化极性小 的有机分子（有机酸、醇、酚等）多采用反相色 谱（或反相柱）
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6. 操作容量（或交换容量）
在一定条件下，某种组分与基质（固定相） 反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容 量，我们称为操作容量（或交换容量）。 它的单位是毫摩尔（或毫克）/克（基质） 或毫摩尔（或毫克）/毫升（基质）
样品在层析时的移动速度可用迁移率Rf值表示：
样品原点到斑点中心的距离
Rf= ——————————————
样品原点到溶剂前沿的距离
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(一) 层析相关概念
1.固定相：
固定相是层析的一个基质。它可以是固体 物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等）， 也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维 素上的溶液），这些基质能与待分离的化 合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。 它对层析的效果起着关键的作用。