人脂联素球状结构域基因的原核表达及多克隆抗体的制备

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NGAL原核表达及多克隆抗体的制备

（昌大学：．南１第二附属医院检验科３００；．一附属医院检验科３００；３０６２第３０６
３江西省胸科医院检验科，昌３００）．南３０６
摘要：的构建人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（目ＮＧＡＩ的原核表达载体，备兔抗人ＮＧ）制ＡＬ多克隆抗体。方法利用ＤＮＡ重组技术构建原核表达载体ｐＴ８— ＡＩ，导表达ＮＧＥ２ａＮＧ诱ＡＬ融合蛋白，离该融合蛋白后，射入免疫家兔制分注备多克隆抗体。结果成功获得ＮＧＡ免疫动物所得抗血清效价为１：０，抗体能够识别原核表达的ＮＧＬ，４００该ＡＬ。结论成功
（．ｂｒｔｒｐｒｍｅｔｔｅＳｃｎ１ＬａｏａｏｙＤｅａｔｎ，ｈｅｏｄＡｆｆｌａｅｓｔｌｏｎｈｎｉｅｓｔ３００，ｈｎｉｉｔｄＨｏｐｉｆＮａｃａｇＵｎｖｒｉｙ，３０６Ｃｉａ；ａ２ＬａｏａｏｙＤｅａｔｎ，ｈｒｔＡｆｉｉｔｄＨｏｐｉａｆＮａｃａｇＵｎｖｒｉ３００，ｈｎ．ｂｒｔｒｐｒｍｅｔｔｅＦｉｓｆｌａｅｓｔｌｏｎｈｎｉｅｓｔ３０６Ｃｉａ；ｙ，
国际检验医学杂志２１年１０１Ｏ月第３卷第１期ＩｔａｄＯｔｂｒ０１Ｖ１２Ｎ．６２６ｎＬｂＭｅ，ｃｏｅ１，ｏ．，ｏ１Ｊ２３

人载脂蛋白A～Ⅰ的基因克隆﹑原核表达及多克隆抗体的制备

［关键词】人载脂蛋白Ａ—Ｉ；原核表达；抗体制备
［中图分类号］Ｑ５
［章编号】１７文６２—７９（０１０－８４０１３２１）５００－４
［文献标识码］Ａ
Ｄｉ１．９９ｊｉｎ１７ｏ：３６／．ｓ．６２—７９．０１０．１０ｓ１３２１．５００
ＧｅｅＣｌｎｆＡｐｌｏｒｔｉ，ＰｏａｙｔｘｒｓｉｎａｄｔｅＰｅａａｉｎｏｏｙｌｎｌｔｂｄｎｏｅｏｏｉｐｏｅｎＡＩｒｋｒｏｉＥｐｅｓｏｎｈｒｐｒｔｆＰｌｃｏａｉｏｙｐｃｏＡｎＲｅｅｇｉｎ－ＨｅＣａｇａｇ，ＤｐｒｎｆＩｔｍａｄｃｎ．２－ｈｅｐｅｓＨｏｐｔｌｆｎｕＣｕｔ，ＮａｃｏｇＣｔｎＦｎｌａｈｎｙｎｅａｔｔｏｎｃｌＭｅｉｉｅＮｏｍｅｔｅＰｏｌ ’ ｓｉｂｏｎｙａｏＮａｎｈｎｉ・Ｙ，ＳｃｕｎＰｏｉｃ．Ｒ．Ｃｉａ６７０ｉｈａｒｖｎｅＩＰｈｎ３３０
ｗａｍｎｄ。ｗｃｓａｐｅｏｓｕｔｒｃｍｂｎｎｌｓｄｏｓｏｘｒｓｉｎｖｃｏ．ＧｓｇｅｉｈｈｗａｐｈｄｔｃｎｔｃｏｉａｔａｍｉｆｕｉｎｅｐｅｓｏｅｔｒｐＥＸ一６ｏｒｅｐｆＰ一１一ＡｐＡ —Ｉｈｅｏ；ｔｅｒ —
ｔｉｅｎ：ＧＳＴ—ＡｐＡ —Ｉ；ａｔｒｐｏｅｎｒｎｔｒｔｎａｄｐｒｃｔｎｈｅｏｉａｔｐａｍｉａｐｈｄｔｍｍｕｅｔｅｍｉｅｔｏｆｒｔｉｅａｕａｉｎｕｉａｉ，ｔｅｒｃｍｂｎｎｌｓｄｗａｐｅｉｅｏｉｆｏｓｏｎｃｈｏ

医学细胞生物学

论：以茎突作为标志追踪垒颈乳孔。在
茎乳孔处寻找面神经于的方法安全可靠，面神经一分舌下神经吻合是可行部
的．图１参１４关键词；面神经面神经一舌下神经吻合术：显微解剖０００９３０－７医学细胞生物学７１９５１１人脂联素球状结构域（Ａ）因的克隆、ｇｄ基融合表达和纯化＝Ｃｏｉｎｕｉｎｌｎｎａｄｆｓｇｏ
目的：对人白细胞介素一４（ｌ一４２ｈＬ２）进行克隆、表达和纯化．方法：分离人外周血单个核细胞。ＣｎＡ刺激培养。提取ｏ细胞总ＲＮＡ，应用Ｒ－ＣＴＰＲ技术从外周血单个核细胞中扩增ｈＬ２成熟肽编码ｌ一４
区，定向克隆至融合表达载体ｐＥＧＸ一
ＤＡ测序鉴定后，转化ＥｃｌＢ２ＮｏｉＬ１（Ｅ）ＰＧ诱导表达。阴离子交换层Ｄ３，ＩＴ
析纯化融合蛋白，Ｄ —ＡＳＳＰＧＥ和Ｗｅｔｓｒｅｎ
培养环境；基因表达
００Ｏ９７１９７３０・１１７
日的：建立人脂联素球状结构域（Ａｄｇ）
杨瑁，田文标，朱永红，毛旭虎，邹全
明，中国生物制品学杂志．２Ｏ／一Ｏ６，
１（）１４１８９２．３～３一
个基因表达下调．另外，１个基因在不２同培养模式中差异表达，只有ＣＬＣ２在
动态培养中高表达，而其余１个基因均１
２０，１（）１～２０６９１．７０一

人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测

里！型！！塑型！！垫！婴！型塑坠！人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测。

刘德敏杨莉丽丁玉静孙颖于德民摘要目的：在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。

方法：利用ＰＣＲ技术扩增人脂联素基因完全编码序列，选用Ｇａｔｅｗａｙ原核表达体系，经过ＢＰ反应、ＬＲ反应两步反应，将ＰＣＲ产物克隆人ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２质粒，构建融合表达载体ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２，ａｔｔＢ—ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，转化大肠杆菌Ｂ１２１（ＤＥ３），以异丙基硫代一Ｂ—Ｄ一半乳糖苷（ＩＹｒＧ）诱导表达脂联索融合蛋白，经镍柱亲和层析纯化，ＮＤＳＢ２０１高效复性后，使重组蛋白作用于体外培养的肝细胞，ＲＴＰＣＲ法检测重组脂联素对肝细胞葡萄糖一６一磷酸酶转录水平的影响。

结果：成功构建了表达载体ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ—ａｄｉｇｎｎｅｃｔｉｎ，ＤＮＡ序列测定结果与预期一致。

ＩＰｒＧ诱导表达的融合蛋白经纯化后ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定具有人脂联素抗原性，并可使培养的肝细胞中葡萄糖－６一磷酸酶转录水平下降。

结论：获得具有生物学活性的重组人脂联素为进一步研究脂联素的生理机制奠定了基础。

关键词脂联索克隆，分子基因表达肝细胞重组蛋白质类葡糖一６—磷酸酶大肠杆菌ＰｒｏｋａｒｙｏｔｉＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＡｃｔＭｔｙＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＨｕｍａｎＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎＧｅｎｅＬ１ＵＤｅｎｔｉｎ，ＹＡＮＧＬｉｆｔ，ＤＩＮＧＹ删抽ｇ，ＳＵＮＹｉｎｇ，ＹＵＤｅｍｉｎＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｗｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｔａｂｏｌｉｃＨｏｐｉｔｕｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７０，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｌｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｘｐｒｅｓｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｗｉｔｈｂｉｏｌｏ咖ａｌａｅｆｉｖｉＶｉｎＥｃｏｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅｅＤＮＡｃｏｄｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｇｅｎｅⅧａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲＧａｔｅｗａｙｐｍｋａｒｙｏｆｉｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓｕｓｅｄＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２ｐｌａｓｍｉｄｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｆｕｓｉｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ－ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｓｉｔｅｒＢＰｒｅａｃｆｉｃｍａｎｄＬＲｒｅａｃｔｉｏｎｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２／ａｎＢ—ａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎＷａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥｅｏｌｉＢ１２｜ａｎｄｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｗⅡｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙＩＰＴＧｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｄｉｐｏｎｅｅｔｌｎ，ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＷ８８ｐｕｎｆｉｅｄｂｙＮｉ・ＮＴＡａⅡｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｍａｔａｎｔａｄｉｐｏｎｅｅｆｉｎｏｎｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈ０８ｐｈａｔｏｎｅｗ∞ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ—ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｓｈｏｗｅｄ出啦ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｃｔｏｒｐＥＴ—ＤＥｓＴ４２ｆ戬啦＿ａｄｉｐ叫ｅｃ血ｗ啦ｅｍａｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．ｐｕｒｉｆｉｅｄａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｓｈｏｗｅｄａｎｄｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄｒｅｄｕｃｅｄｓｋｏ”６一ｐｈ０８ｐｈａｔａｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｅｖｅｌＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｗｅｈａｖｅｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈａｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｗｉｔｈｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙ．ｗｈｉｃｈｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｖ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｃｌｏｎｉｎｇ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｇｌｕｅｏｓｅ一６一ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｅｓｃｈｅｆｉｃｈｉａｃｏｌｉ人脂联素（ａｄｉｐ（、ｎｅｃｔｉｎ）基因全长１７ｋｂ，位于染色体３ｑ２７，包含３个外显子和２个内含予。

脂联素球状结构域真核表达载体pcDNA3.0-gAd的构建

脂联素球状结构域真核表达载体pcDNA3.0-gAd的构建黄敏;陈显久;王彦;杨静【摘要】目的构建脂联素球状结构域(globular adiponectin,gAd)的真核表达载体,为研究gAd对糖尿病、动脉粥样硬化等疾病的治疗奠定基础.方法从健康人全血中提取基因组DNA,PCR法获得脂联素球状结构域基因,经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后与pcDNA3.0真核表达载体重组得到pcDNA3.0-gAd,分别用PCR法和DNA 测序法鉴定pcDNA3.0-gAd.结果以从健康人全血中提取出的高纯度基因组DNA 为模板,PCR扩增出gAd基因,真核载体pcDNA3.0经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后与gAd基因进行体外重组,PCR法筛选出阳性克隆,DNA测序显示重组质粒pcDNA3.0-gAd的gAd基因与基因库中报道的脂联素基因序列(GenBank:EU420013.1)中gAd序列完全一致,说明成功构建了pcDNA3.0-gAd,且序列正确.结论本研究为进一步从分子水平探究gAd基因和蛋白质的功能、深入探讨其生物作用机制创造了条件.【期刊名称】《中西医结合心脑血管病杂志》【年(卷),期】2010(008)003【总页数】3页(P331-333)【关键词】脂联素;球状结构域;真核表达载体【作者】黄敏;陈显久;王彦;杨静【作者单位】山西医科大学第一医院,030001;山西医科大学第一医院,030001;山西医科大学第一医院,030001;山西医科大学第一医院,030001【正文语种】中文【中图分类】R318脂联素是近年来发现由脂肪细胞分泌的一种蛋白质,其具有增加胰岛素敏感性[1]、抗动脉粥样硬化[2]、抗炎症[3]、防治肝纤维化[4]、抑制肿瘤生长[5]和影响骨代谢[6]等重要生物学作用。

脂联素蛋白全长247个氨基酸,包含有N端信号序列、可变区、胶原样区和 C端球状结构域(globular adiponectin,gAd)4个功能性结构域[7]。

人脂联素球型结构域原核表达重组质粒的构建及体外表达

Ｖ电泳至结束。电泳后的凝胶用考马斯亮蓝Ｒ－２５０（５０％甲醇，０．２５％考马斯亮蓝Ｒ－２５０，１０％冰醋酸，４０％水）染色２ｈ，用脱色液（４５％甲醇，４５％水，１０％冰醋酸）脱色至背景透明，观察结果。
２结果２．１ＲＴ－ＰＣＲ扩增人ｇＡｄ基因
两条带，分别是４１２ｂｐ和２６９２ｂｐ，一条是ｇＡｄ目的基因，一条是ｐＭＤ１８－Ｔ质粒载体。以ｇＡｄ－Ｔ质粒阳性克隆为模板，以ｇＡｄ特异性引物进行ＰＣＲ扩增，扩增出４１２ｂｐ长度的ｇＡｄ目的基因（图２）。
１实验材料和方法１．１实验材料
实验中采用的人脂肪组织来源于一个３５岁的女性慢性胆囊炎手术病人的大网膜，术前已获病人口头同意。该女性体质量指数为２１．５ｋｇ／ｍ２；血压正常；空腹及餐后血糖正常；血脂正常。既往无肥胖及吸烟史。
收稿日期：２００８－０３－１５基金项目：国家自然科学基金（３０５７０８７４）通讯作者：余叶蓉，教授，博士导师
无肥胖及糖尿病家族史。实验中总ＲＮＡ提取试剂购自于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公
司；反转录试剂盒、ＤＮＡ分子标记、限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接试剂盒、ｐＭＤ１８－Ｔ质粒均购自于大连宝生物工程有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自于ＯＭＥＧＡ公司；酵母提取物、胰化蛋白胨购自于ＯＸＩＯＤ公司；琼脂糖、琼脂粉购自于Ｓｉｇｍａ公司；质粒ｐＥＴ３２ａ（＋）、大肠杆菌ＪＭ１０９、ＤＨ５α及ＢＬ２１为四川大学病理生理实验室赠送；引物由上海申能博彩生物科技有限公司合成。实验中所用的其他化学试剂购自于四川大学化学试剂中心，均为分析纯级。１．２实验方法１．２．１两步法反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）获取人ｇＡｄ基因首先参照总ＲＮＡ提取试剂盒说明书提取约３００ｍｇ脂肪组织的总ＲＮＡ。然后，利用反转录试剂盒将前面提取的总ＲＮＡ逆转录合成单链ｃＤＮＡ。将单链ｃＤＮＡ产物在特异引物Ｐ１和Ｐ２的作用下，通过ＰＣＲ扩增出编码人ｇＡｄ的基因。其中特异引物Ｐ１和Ｐ２分别为：Ｐ１：５＇－ＴＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＴＡＴＧＴＡＴＡＣＣＧＣＴＣＡＧＣ－３＇，序列中含有限制性内切酶ＥｃｏＲＩ的酶切位点；Ｐ２：５＇－ＡＴＡＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＴＧＧＴＡＧＡ－３＇，其序列中含有限制性内切酶ＳａｌＩ的酶切

人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测

ｃＤＮＡｃｏｄｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｇｅｎｅｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲ．Ｇａｔｅｗａｙｐｍｋａｒｙｏｉｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓｕｓｅｄ．
ｐｕｉｆｒｉｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｔａｎｔａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｏｎｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ｈｅＴＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｓｈｏｗｅｄｈａｔｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ— ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ－ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．Ｐｕｒｉｉｆｅｄａｄｉｐｏｎｅｃｉｔｎｓｈｏｗｅｄ
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６４４
ＴｉａｎｊｉｎＭｅｄＪ，Ｓｅｐ２００７，Ｖｏｌ３５Ｎｏ９
人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测
刘德敏
摘要
杨莉丽丁玉静来自孙颖于德民
目的：在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。方法：利用ＰＣＲ技术扩增人脂联素基因完全编

人脂联素基因真核表达载体的构建及表达

ＧｌｘａｔｎＫｔ。ｅＥｔｃｏｉｒｉ）
Ｐ１：ＡＣ５ＣＴＣＡＧＧＡＴＧＣＴＧＴｒＧ
机体能量平衡、糖脂代谢等作用。，其病理生理。但作用及其机制尚未完全明确。本研究拟通过人脂联素基因的克隆及其真核表达载体的构建来表达脂联
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安徽医科大学学报
ＡｔＵｉｒｔｉＭｅｉｎｌｎｕ２０ｃ；１５ｃｎｅｉｔｄｉｉＡｈｉ０６Ｏｔ（）ａｖｓａｓｃａｓ４
‘５５・２
人脂联素基因真核表达载体的构建及表达
成功诱导表达出融合蛋白ＧＴｈＰＳ —ＡＭ，为进一步获得大量可供实验研究和临床应用的重组ｈＰ创造条件。ＡＭ主题词
自由词
码序列（斜体部分）同时再分别在两个酶切位点前，加上两个保护碱基。② ＰＲ反应：Ｃ以本实验室中国
１２２ｈＰ基因真核表达载体构建及鉴定．．ＡＭ
真核表达载体ＰＥ－Ｔ１约ＧＸ４一（
①
１１１质粒和菌株．．
载体ＰＥ－Ｔ１和ＰＲ纯化产物双酶切：ＧＸ４一Ｃ根据真核
１２１ｈＰ基因克隆．．ＡＭ
① 引物设计：据已报道根
的人ＡＭ（ＡＭ）ＤＡ序列设计一对引物，ＰｈＰｃＮ并分别在上下游引物前加上Ｅｏ１Ｓｉ切位点编ｃＲ、ａｌ酶

无标签人源性脂联素球状结构的表达、纯化与活性检测

研究报告
无标签人源性脂联素球状结构的表达、纯化与活性检测
张立剑，孙璐，李冬冬，郭云萍，王增禄，刘毅，张英起，陶凌
第四军医大学ａ．西京医院；ｂ．药学系生物技术中心；陕西西安７１００３２
［摘要］目的：利用基因工程方法构建无标签人源性脂联素球状结构（ｇａｄ）基因的原核表达载体，并对重组蛋白进
行诱导表达、纯化及鉴定。方法：从正常人脂肪组织里提取总ＲＮＡ，反转录合成ｅＤＮＡ，经ＰＣＲ扩增、酶切后连入ｐＥＴ一２２ｂ（＋）载体构建重组质粒ｐＥＴ一２２ｂ（４－）一ｇＡｄ，转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞，经低温、低浓度ＩＰＴＧ诱导
使其可溶性表达，采用硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析和阴离子交换层析三步分离纯化，得到不带任何标签的人源性
ｇａｄ；运用ＳＤＳ — ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹、ＨＰＬＣ对重组蛋白进行鉴定，通过对ＡＭＰ激活的蛋白激酶（ＡＭＰＫ）的磷酸化水平检测纯化蛋白的生物学活性。结果：构建了原核表达载体ｐＥＴ一２２ｂ（＋）一ｇＡｄ，实现了人源性ｇＡｄ在原核细胞中的可溶性表达，纯化的蛋白经ＳＤＳ — ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析证实为ｇＡｄ，ＨＰＬＣ分析蛋白纯度达到９５％以上；通过对ＡＭＰＫ磷酸化水平的检测，证明纯化的ｇＡｄ具有高生物学活性。结论：重组表达和纯化了无标签、高生物学活性的人源性脂

人UNC5CL原核蛋白的表达及多克隆抗体的制备和鉴定

ＵＣＣ（ｅＢｎ：Ｎ１３６．）利用死亡Ｎ５ＬＧｎＤ）ｄａｄｍａＤ的氨基酸序列以ｔＬＳｎｈｎＢＡＴ
ＥｏｉＢ１１ＩｗｈｃｔｅｕｉｎｒｔｉＧＳＴＵＮＣＣＬｃｌ＿．ｎ２ｉｈｈｆｓｏｐｏｅｎ — ５
ＤｅａｔｎｆＩｐｒｍｅｔｏｍｍｕｏｏｙ，ＰｋｎｉｅｓｙＨｅｌＳｉｎｅｎｌｇｅｉｇＵｎｖｒｉａｔｔｈｃｅｃＣｎｅ；ＤｅａｔｎｆＵｒｌｇｅｔｒｐｒｍｅｔｏｏｏｙ，ＰｋｎｉｅｉｈｒｓｉｅｉｇＵｎｖｒｔＴｉｄＨｏｐ－ｓｙ
人ＵＣＣＮ５Ｌ原核蛋白的表达及多克隆抗体的制备和鉴定
吕丹钱晓萍，，田晓军张，毓，张君
（北京大学：医学部免疫学系Ｔ细胞室，第三医院泌尿外科，北京１０９）０１１
Ｐｒｋｒｏｉｅｐｅｓｏｏａｙｔｃｘｒｓｉｎ，
性ＵＣＣＮ５Ｌ具有较好的反应性和特异性，为进一步研究
ｔ，Ｂｒｎ０１１ｈａａｅｉｇ１０９，Ｃｉｌｎ
［ｂｔａｔＡＭ：ｏｃｎｔｃｔｒｋｒｔｘｒ・Ａｓｃ］ｒＩＴｏｓｕｔｈｐｏａｏｉｅｐｓｒｅｙｃｅ
检索人ＥＴ数据库得到的一新的编码含有死亡结构Ｓ
域蛋白的基因，初其编码蛋白被命名为ＺＤ（Ｕ最ＵＺ５
ａｄｄａｏｉ．ｎａｉｇｐｏｉ）。ＵＣｎｅｔｄｍａｃｔｎｎｒｅｎｈｎｏｉｔＮ５Ｌ基Ｃ

人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备

人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备作者：陈章权*, 黄震, 梁晓东, 陆田田, 何天文【摘要】目的: 原核细胞表达人CD1d分子胞外区及制备其多克隆抗体。

方法: 用RT-PCR法扩增人CD1d分子胞外区基因, 将其克隆入原核表达载体pET28中, 转化大肠杆菌BL21（DE3）, 用IPTG 诱导重组蛋白的表达, 用亲和层析法纯化重组蛋白, 以之为免疫原免疫小鼠制备多克隆抗体, 并以ELISA、 Western blot及免疫组织化学法检测抗体。

结果: 在原核细胞中高效表达和纯化了人CD1d分子胞外区蛋白, 用其免疫小鼠, 获得了效价高、特异性较好的多克隆抗体, 免疫组织化学检测显示该抗体可识别人小肠组织中的天然CD1d分子。

结论: 成功制备了人CD1d分子胞外区重组蛋白及鼠抗人CD1d分子胞外区抗体, 为进一步建立人CD1d分子的免疫学检测方法及其生物学功能的深入研究奠定了基础。

【关键词】 CD1d 基因表达抗体制备CD1分子是独立于MHC分子之外的第三类抗原提呈分子, 分为CD1-I和CD1-II两组, 前者包括CD1a、 CD1b、 CD1c和CD1e等4个分子, 后者只有CD1d分子［1］。

CD1d分子由胞内区、跨膜区和胞外区组成, 胞外区又由α1、α2和α3等3个结构域组成, 它主要提呈糖脂抗原, 在免疫调节及与感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等疾病的发生发展过程中起重要作用［1, 2］。

在CD1d基因克隆过程中, 我们发现在某些疾病患者体内存在α3结构域或跨膜区缺失的变异体, 跨膜区缺失的变异体的存在提示患者体内可能存在可溶性CD1d分子。

为此, 我们拟建立双抗体夹心ELISA法进行可溶性CD1d分子的检测, 但目前尚未见有其商品化ELISA检测试剂盒。

特异性抗体的获取是建立ELISA检测方法的关键所在, 在成功制备兔抗人CD1d分子α3结构域抗体［3］的基础上, 我们又对人CD1d分子胞外区编码基因进行了重组表达, 并制备了其鼠源性抗体。

glipr1基因的原核表达及多克隆抗体制备

glipr1基因的原核表达及多克隆抗体制备生秀梅;陈龙;王正新【摘要】目的克隆表达胶质瘤致病相关蛋白1基因(glor1)并制备多克隆抗体,运用该抗体检测各肿瘤细胞系中GLIPR1的表达.方法通过PCR技术以含glipr1基因的cDNA克隆质粒(pLX304-glipr1)为模板获得glipr1(M)片段,再将此片段克隆至表达载体pET-15b上,并转人大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)进行表达;Ni柱纯化后的GLIPR1(M)蛋白作为抗原免疫家兔,获得多克隆抗体,Western blot法检测其特异性,并检测GLIPR1在A549、PC14、LNCaP、PC3及U87细胞中的表达.结果成功构建了表达载体pET-15b-glipr1(M),并获得了纯化的GLIPR1(M)蛋白,成功制备了兔抗GLIPR1多克隆抗体,特异性高,可用于检测各细胞系中GLIPR1的表达,GLIPR1在U87中的表达最高.结论成功表达了GLIPR1(M)蛋白,并获得了多克隆抗体,为进一步研究GLIPR1的功能和作用机制奠定了基础.【期刊名称】《安徽医科大学学报》【年(卷),期】2016(051)010【总页数】5页(P1436-1439,1444)【关键词】GLIPR1;蛋白表达;多克隆抗体【作者】生秀梅;陈龙;王正新【作者单位】江苏大学医学院生化教研室,镇江212013;The Center for Cancer Research and Therapeutic Development, Dept of Biological Sciences, Clark Atlanta University,Atlanta, GA 30314;江苏大学医学院生化教研室,镇江212013;The Center for Cancer Research and Therapeutic Development, Dept of Biological Sciences, Clark Atlanta University,Atlanta, GA 30314【正文语种】中文【中图分类】R34;Q78胶质瘤致病相关蛋白1基因(glipr1)是从胶质细胞瘤中克隆出来的新基因[1-2]。

人MTERF3蛋白的原核表达与多克隆抗体制备

人MTERF3蛋白的原核表达与多克隆抗体制备杨勇琴;张成桂;孙美涛;王昀;杨泽芳;张晓娟;熊伟【摘要】Objective Human mitochondrial transcription termination factor 3 ( MTERF3 ) is a negative regulator of mito⁃chondrial gene expression and energy metabolism. This study was to construct a prokaryotic expression system for MTERF3 in Esche⁃richia coli ( E. coli ) and prepare itsmouse⁃anti⁃human polyclonal antibody. Methods The complete open reading frame ( ORF) of human MTERF3 cDNA was amplified by RT⁃PCR and subcloned into prokaryotic expression vector pET28b. Then the recombinant plasmid pET28b⁃MTERF3 was transformed into competent E.coli BL21(DE3) and IPTG induced the expression of 6×his fusion protein. The recom⁃binant human MTERF3 protein was purified through Ni2+⁃NTA agar⁃ose gel column affinity chromatography and the purified recombinant protein was used as immunogen to immunize the BALB/c mice to pre⁃pare its specific polyclonal antibody. The titer and specificity of the antibody were analyzed by ELISA, Western blot and cellularimmuno⁃fluorescence, respectively. Results The recombinanthuman MTERF3 protein was successfully expressed in E. coil and the mouse⁃anti⁃human MTERF3 polyclonal antibody with high quality was successfully prepared. ELISA showed that the titer of the antibody was1:105 . Western blot and immunofluorescence detection revealed that the mouse⁃anti⁃human MTERF3 antibody could recognize the native MTERF3 antigen specifically. Conclusion Human MTERF3 expressed in theprokaryotic system has strong immunogenicity and the polyclonal antibody obtained from immunizing mice has high titer and specificity. The prokaryotic expression of human MTERF3 and the preparation of its antibody lay the foundation for further function research of human MTERF3.%目的：人线粒体转录终止因子3（ mitochondrial transcription termination factor 3， MTERF3）是线粒体基因表达及能量代谢的负调控因子。

人脂联素球状结构域(gAd)基因的克隆、融合表达和纯化

人脂联素球状结构域(gAd)基因的克隆、融合表达和纯化杨泽华;解军;杨琦;张悦红;牛勃【期刊名称】《中国生物制品学杂志》【年(卷),期】2006(19)1【摘要】目的建立人脂联素球状结构域(gAd)融合组氨酸标签的原核高效表达体系,并分离纯化gAd。

方法从淋巴细胞中提取人基因组DNA,PCR扩增出含有脂联素编码序列的片段,经T-A克隆入pMD18-T载体中,然后设计适当的引物,引入起始密码、C端连续6个组氨酸编码序列、终止密码以及相应的酶切位点,把脂联素球状结构域(gAd)基因亚克隆到表达载体pBV220,将序列鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌DH5α中,用42℃温控诱导表达目的蛋白。

结果在大肠杆菌中成功实现了gAd稳定高效表达,表达产物以包涵体形式存在,表达量约占全菌蛋白的19%,用超声破菌,经金属离子(Ni2+)配体亲和层析一步纯化得到了均一蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定得到了较高纯度的gAd。

结论已成功表达了gAd融合蛋白,为进一步研究其生物学功能和作用机制奠定了基础。

【总页数】4页(P17-20)【关键词】脂联素;球状结构域;融合表达;纯化【作者】杨泽华;解军;杨琦;张悦红;牛勃【作者单位】山西医科大学生物化学与分子生物学教研室【正文语种】中文【中图分类】R392-33;R284.2【相关文献】1.猪脂联素球状结构域gAd蛋白在重组乳酸乳球菌中表达条件的优化 [J], 杨虹坤;刘霭莎;胡文锋;李岩;吴同山;王进军2.人脂联素球状结构域基因的原核表达及多克隆抗体的制备 [J], 安薇;徐霞3.人脂联素、球状脂联蛋白基因克隆及真核表达载体的构建与表达 [J], 李丙蓉;郑丹;邓华聪;刘金波;兰丽珍;郑宏庭4.人脂联素球状结构域的表达、纯化和功能鉴定 [J], 刘宏磊;李希;宋后燕;汤其群5.猪脂联素球状结构域gAd基因在乳酸乳球菌中的表达 [J], 刘霭莎;李岩;胡文锋;吴同山;李加琪;陈真伟;江冠尧;黎立因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人脂联素、球状脂联蛋白基因克隆及真核表达载体的构建与表达

人脂联素、球状脂联蛋白基因克隆及真核表达载体的构建与表达李丙蓉;郑丹;邓华聪;刘金波;兰丽珍;郑宏庭【期刊名称】《中国糖尿病杂志》【年(卷),期】2007(15)6【摘要】目的构建高效表达球状脂联蛋白的真核表达载体,为研究脂联素、球状脂联蛋白在2型糖尿病及动脉粥样硬化中的作用奠定基础.方法克隆人脂联素基因,构建球状脂联蛋白基因的真核表达载体,转染人脐静脉内皮细胞株(HUVEC),Western blot检测上清中球状脂联蛋白的表达.结果测序结果表明克隆的人脂联素基因序列正确;构建的球状脂联蛋白基因真核表达载体能有效转染HUVEC,并在上清中检测到该基因的表达.结论完成人脂联素基因克隆,成功构建了人球状脂联蛋白基因真核表达载体,并在HUVEC中获得分泌表达,为研究球状脂联蛋白对2型糖尿病的干预作用提供了可能.【总页数】3页(P367-369)【作者】李丙蓉;郑丹;邓华聪;刘金波;兰丽珍;郑宏庭【作者单位】400016,重庆医科大学附属第一医院内分泌科;400016,重庆医科大学附属第一医院内分泌科;400016,重庆医科大学附属第一医院内分泌科;400016,重庆医科大学附属第一医院内分泌科;400016,重庆医科大学附属第一医院内分泌科;400016,重庆医科大学附属第一医院内分泌科【正文语种】中文【中图分类】R9【相关文献】1.人骨形成蛋白2和人骨形成蛋白7成熟肽编码区基因克隆和真核表达载体的构建[J], 吉建新;廖伟娇;刘利东;卢春生;朱伯平;范婷婷2.脂联素球状结构域真核表达载体pcDNA3.0-gAd的构建 [J], 黄敏;陈显久;王彦;杨静3.人骨形态发生蛋白-2基因克隆及真核表达载体的构建 [J], 周诺;黄旋平;廖妮;韦山良;梁飞新;麦华明4.绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体的构建 [J], 刘德敏;杜春红;孙颖;张捷5.人热休克蛋白90β-cDNA基因克隆及其真核表达载体的构建 [J], 刘涛;赵菊梅;田聆;魏于全;梁传余因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人GPC3基因的原核表达及多克隆抗体的制备

人GPC3基因的原核表达及多克隆抗体的制备腾桥;夏丽洁;张富春【摘要】This work aims to construct the prokaryotic protein of glypican3 (GPC3) and to prepare its anti-serum to mouse.The complete open reading frame (ORF) of human GPC3's cDNA was amplified by PCR,and then cloned into prokaryotic expression vector of pET28a.Further,the GPC3 fusion protein was expressed in Escherichia coli BL21,the fusion his-protein was purified by affinity chromatography and the fusion protein of purity was measured by SDS-PAGE electrophoresis.Finally,the protein content was also measured.The Balb/c mice were immunized by the purified protein for preparing the anti-serum,and the anti-serum was identified with ELISA analysis.Results showed that the polyclonal antibody against GPC3 protein was successfully prepared and the titer of antisera was1:51200;moreover,the specificity was validated to be fine by Western blot.Conclusively,recombinant human GPC3 protein expressed in the prokaryotic system has strong immunogenicity.%旨在构建人磷酯酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican3,GPC3)原核蛋白,制备小鼠GPC3抗血清.扩增人GPC3基因cDNA的完整的开放阅读框,克隆至pET28a原核表达载体,在大肠杆菌BL21表达菌株中诱导表达磷酯酰肌醇蛋白聚糖融合蛋白,利用亲和层析的方法纯化his-融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳检测蛋白的纯度,并测定蛋白含量;免疫Balb/c小鼠,制备抗血清.结果显示,成功制备了小鼠抗GPC3多克隆抗体,抗体滴度为1:51200,经Westem blot检查特异性良好.原核表达的重组人GPC3蛋白具有较好的免疫原性.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2017(033)011【总页数】6页(P188-193)【关键词】磷酯酰肌醇蛋白聚糖3;融合蛋白;多克隆抗体【作者】腾桥;夏丽洁;张富春【作者单位】新疆大学生命科学与技术学院生物资源基因工程重点实验室,乌鲁木齐830046;新疆大学生命科学与技术学院生物资源基因工程重点实验室,乌鲁木齐830046;新疆大学生命科学与技术学院生物资源基因工程重点实验室,乌鲁木齐830046【正文语种】中文肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，严重威胁着人类的健康［1］。

人脂联素原核表达纯化及活性检测

人脂联素原核表达纯化及活性检测王云龙;刘旺根;梁晓艳;李永超;昌静峰;李玉林;王国强;邓黎黎;陈冬焕;董彩文;孙新城【摘要】为了克隆人脂联素基因(ACRP30),获得有免疫活性的重组人脂联素,以人皮下脂肪组织为材料,提取总RNA,通过RT-PCR得到ACRP30基因.构建重组质粒pET-CKS-ACRP30,转化表达茵BL21(DE3),以IPTG诱导表达人脂联素重组蛋白,利用镍亲和层析纯化,Western blot鉴定其活性,双抗体夹心法检测其免疫活性.获得了人脂联素基因,表达纯化了人脂联素融合蛋白,融合蛋白分子质量约为50 ku,表达量约占茵体总蛋白的30％,纯度达到90％,双抗体夹心法检测重组蛋白具有免疫活性.本研究成功表达了人脂联素重组蛋白且表达产物具有免疫活性,为人脂联素检测技术的建立奠定了基础.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2011(032)010【总页数】4页(P36-39)【关键词】人脂联素;原核表达;免疫活性【作者】王云龙;刘旺根;梁晓艳;李永超;昌静峰;李玉林;王国强;邓黎黎;陈冬焕;董彩文;孙新城【作者单位】河南工业大学,河南郑州450001;郑州职业技术学院,河南郑州450121;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州450001;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州450001;河南工业大学,河南郑州450001;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州450001;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州450001;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州450001;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州450001;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州450001;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州450001;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州450001【正文语种】中文【中图分类】Q789脂联素（adiponectin）是由脂肪细胞分泌的一种细胞因子，具有抗动脉粥样硬化、调节脂肪酸氧化和糖代谢、增加胰岛素敏感性、抑制肝糖产生、抑制反馈TNF－α的生成与释放，对损伤的肝细胞有重要的保护［1－3］。

类人胰岛素原多拷贝重复基因原核表达载体的构建与表达

类人胰岛素原多拷贝重复基因原核表达载体的构建与表达罗联忠;陈仲巍;叶子坚【期刊名称】《南昌大学学报（理科版）》【年(卷),期】2014(000)003【摘要】The human pre-insulin gene was redesigned for optimal expression in Escherichia coli through the alteration of its codon bias to reflect were redesigned according to the Codon Preference Parameter of Esch-erichia coli codon preference,and the C peptide of human preinsulin was replaced with Lys-Lys.Then the redesigned human pre-insulin gene (hINS)was cloned using Polymerase Chain Reaction (PCR),and fur-ther performed as a template on which based the multi-copy genes of hINS (hINS-M)was cloned by PCR with several couples of specialprimers.Besides,sequences of both the Restriction Enzyme and Trypsin cut-ting sites were included in the primers.Accordingly,restriction Endonucleases were employed to cut the PCR products,and T4 DNA Ligase was then employed to tape the cut PCR produces to the differently de-signed multi-copies of the hINS-M.The prokaryotic expression vectors of these multi-copies genes were constructed and transformed into host Escherichia coli strains for expression.Furthermore,dodecyl sufate, sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE),coomassie brilliant blue staining,photodensi-tometry,and mass spectrometry were employed to analyze the the expression products of the hINS-M.Our results indicatedthat the expression efficiency of the 4-copies gene of hINS-M was significantly higher than that of the others.The ratio of the expression product of the 4-copies gene hINS-Mthe human preinsulin to the total expression proteins of the host strains was over 28.0%.The ratio was about 3 times of that of the expression product of the 1-copy gene of hINS-M.Moreover,the expression products from the different mutil-copes genes of hINS-M were all indentified to be the re-designed human preinsulin.Therefore,the prokaryotic expression vectors of the multi-copies genes of hINS-M could be used to improve the expres-sion efficiency of the recombinant human preinsulin.%根据大肠杆菌密码子偏好性，优化人胰岛素原基因序列，同时用2个赖氨酸取代 C链。

人脂联素基因的原核表达纯化、抗体制备及应用的开题报告

人脂联素基因的原核表达纯化、抗体制备及应用的开题报告一、项目背景人脂联素（Adiponectin）是一种由脂肪组织分泌的蛋白质，具有调节能量代谢、抗炎、抗肥胖和抗糖尿病等生物学功能。

人脂联素基因（ADPN）位于第3号染色体长臂上，由3个外显子和2个内含子组成，编码一个244个氨基酸残基的前体蛋白（pre-adiponectin），经过蛋白酶的切割后，生成28 kDa的脂联素（adiponectin）。

研究表明，脂联素在机体代谢调节过程中发挥着重要的作用，其功能异常与肥胖、糖尿病、脂肪肝等疾病的发生发展密切相关。

因此，深入研究人脂联素基因的表达和调控机制对这些疾病的预防和治疗具有重要意义。

本项目旨在构建人脂联素基因原核表达重组系统，高效表达并纯化脂联素，制备脂联素特异性抗体，并探索其在疾病诊断和治疗中的应用。

二、项目内容1.构建人脂联素基因原核表达系统采用基因克隆技术，构建人脂联素基因原核表达载体，并将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）中。

通过SDS-PAGE和Western blot等技术鉴定表达蛋白的表达量和纯度，并优化其表达条件。

2.脂联素的纯化与结构分析采用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对脂联素进行纯化，并通过质谱分析鉴定蛋白的分子量、氨基酸序列和糖基化情况等。

3.脂联素特异性抗体的制备以纯化的脂联素为免疫原，免疫小鼠、兔子等动物制备脂联素特异性抗体，并通过ELISA，Western blot和免疫组化等技术对其进行鉴定和评估。

4.探索脂联素在疾病诊断和治疗中的应用通过脂联素特异性抗体检测血清中脂联素的水平，探索其在肥胖、糖尿病、脂肪肝等疾病的诊断、预测和治疗中的应用。

三、预期成果1.成功构建人脂联素基因原核表达重组系统，并高效表达和纯化脂联素。

2.制备脂联素特异性抗体，并对其进行鉴定和评估。

3.探索脂联素在肥胖、糖尿病、脂肪肝等疾病的诊断、预测和治疗中的应用。

4.在人脂联素的表达和功能调控机制、以及脂联素在代谢性疾病中的作用等方面取得新的研究进展。