反义RNA技术原理及在疾病治疗中的作用

反义RNA技术原理及在疾病治疗中的作用

摘要：反义RNA技术是利用反义RNA能够与特异靶RNA通过配对碱基间氢键作用而互补配对，从而在基因复制、转录和翻译3个不同水平上参与基因表达的调控，来治疗各种遗传性或病毒感染性疾病的一项技术。本文在讨论反义RNA技术的作用机制和与反义寡核苷酸技术的比较的基础上，拟概述反义RNA的作用机制、技术方法与特点、技术运用和存在的问题。相信随着对基因功能研究的广泛开展及基因治疗研究的深入，反义RNA技术必将成为一种有力的工具，在疾病治疗中起到重要的作用。

关键词:反义RNA；基因表达调控；基因治疗

反义核酸技术是继基因克隆和重组技术后分子生物学领域兴起的一种全新的技术。该技术由于其核苷酸具有与DNA意义链相同的序列且可以选择性地抑制特定基因的表达而得名。广义的反义核酸技术包括：①反义寡核苷酸技术(antisense oligonucleotides,ASOD)，即直接应用一段人工合成的寡聚核苷酸,通过碱基配对与细胞内核酸结合,特异的调节基因表达。②反义RNA技术(antisense RNA),是利用基因重组技术,构建表达载体，使其离体或在体内表达出反义的RNA。③核酶技术(ribozyme)核酶是一种可自我催化的特殊的反义RNA，能与靶序列结合并使之裂解，从而对特定基因的表达进行调控。反义RNA(antisense RNA)是一种本身缺乏编码能力，但能与特异靶RNA(主要是mRNA)互补的RNA分子，它可通过配对碱基间氢键作用与靶RNA的特定互补区域结合形成双链复合物，抑制靶RNA的功能,从而调控基因的正常表达[1]。反义RNA技术的基本原理是利用自然存在的或人工合成的反义RNA，通过基因重组技术反向插入到合适的表达载体形成重组DNA,然后转染受体细胞，则这一反向插入的序列就会随细胞周期产生大量反义RNA,对基因的表达进行调控,从而抑制、封闭或破坏靶基因的表达。选择具有明显的生物学效应的靶序列后,反义RNA即通过和相应的RNA互补而达到阻断其功能的目的。近20多年来,反义RNA技术已在病毒病、癌症、遗传性疾病等疑难疾

病的基因治疗、动植物品种的改良以及生物研究方法的改进方面取得了令人瞩目的成就。本文在讨论反义RNA技术的作用机制和与反义寡核苷酸技术的比较的基础上,拟概述反义RNA的作用机制、技术方法与特点、技术运用和存在的问题。

1反义寡核苷酸技术与反义RNA技术

1.1反义寡核苷酸技术

1978年,Zamecnik首先应用一种13个碱基的寡核苷酸抑制Rous肉瘤病毒,取得一定效果[1],此后,随着对其作用机制、特异性及药理作用等研究的深入,其应用范围不断扩大。由于ASOD的易降解性,在实验中通常要对其进行修饰,硫代反义寡核苷酸作为第一代反义寡核苷酸的代表,由于在细胞毒性、细胞吸收率等方面存在众多问题,Agrawal等设计了第二代混合骨架的反义寡核苷酸(mixed-backbone oligonucleotides ,MBO),MBO含有至少两种不同的化学修饰,在结构上可以是任意两种或多种修饰的不同排列组合。MBO 不仅保持了核酸酶抗性,而且具有很好的靶序列杂交特异性和相对较低的毒副作用[2]。近年来以2-氨基乙基甘氨酸为基本单元的多肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)由于可与互补的RNA或DNA形成稳定的PNA/DNA(RNA)杂合链并且具有较强的蛋白酶、核酸酶抗性而预示了其作为反义抑制剂的用途,被称为第三代反义核酸[3],但细胞对PNA的吸收效率较低的问题一直没有得到很好解决。并且,由于寡核苷酸的半衰期较短,有必要反复应用ASOD。事实上,以上三代寡核苷酸较高的制备成本也是妨碍其广泛应用的因素之一。同时,在反义寡核苷酸的设计上还较盲目,要设计出高效的反义寡核苷酸并非易事。相对而言,包含反义RNA的重组质粒则相当于具有生物兼容性和生物降解性的长期释放装置。

2 反义RNA作用机制

与ASOD方法相比,设计反义RNA时一般不需要目的基因的详细的调控知识,人们普遍应用由翻译起始位点延伸0.5kb～3.0 kb的片段作为重组质粒的(逆向)插入序列。而全长的cDNA序列一般认为没有必要,尤其当目的基因较长时。另外,互补于3′端非翻

译的序列也往往具有很好效果[4]。在真核生物中,一般认为对应5′非编码区的反义RNA优于针对编码区的反义RNA。包含反义核酸的重组质粒在细胞内转录出反义mRNA,发挥抑制基因表达的作用。目前,具体的作用机制尚不甚清楚,人们推测可能有: 反义RNA的作用机制主要表现在DNA复制、转录和翻译3个水平上。

2.1DNA复制中的作用

反义RNA作为DNA复制的抑制因子,与引物RNA结合或作用于引物前体而抑制DNA 复制,从而降低DNA的复制效率。E.coli的colE1质粒复制的前提是合成适当的RNA(RNA Ⅱ),它自动折叠后与DNA模板结合形成DNA复制的引物,从复制起始点上游—445bp 处开始,以另一DNA为模板反向转录的RNAⅠ正好与RNAⅡ的结合,阻止了正常引物的产生,从而干扰复制的进行。

2.2转录及转录后水平的作用

反义RNA与mRNA 5′末端互补结合,阻断帽子结构形成;作用于外显子和内含子的连接区,阻碍前mRNA剪接;作用于polyA形成位点,阻碍mR-NA的成熟及其向胞浆转运。在crp基因的ticRNA(transcription inhibitory complementary RNA)负向自我调控中,ticRNA 与crp mRNA的5′端结合,形成类似于RNA聚合酶识别的转录终止信号的二级结构,以反式作用对转录过程本身进行调控[5]。

2.3翻译水平的作用

反义RNA可直接与mRNA的SD序列(含RBS)或编码区(主要是AUG)结合,从空间上直接阻止核糖体的正常结合或可直接降解靶mRNA。反义RNA与mRNA在SD序列配对形成吻触复合体或在互补区段结合形成RNA- RNA双链结构,从而调控翻译的进行。在真核生物细胞中有许多RNA在翻译水平上表现反义RNA的功能。如鸡胚胎肌浆中存在的富含U的小分子RNA称为tcR-NA,它们可以与肌球蛋白重链的RNA的polyA尾杂交而抑制正常的翻译过程。Audrey等[6]的研究表明FGF- AS RNA在翻译过程能有效地抑制FGF- 2在哺乳动物细胞中的表达。